CN113304257A - 一种双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗的制备方法及应用,具体步骤如下:新型冠状病毒灭活原液按规定的同一蛋白质含量或抗原含量进行配制后,添加CpG佐剂和铝佐剂,其中,新冠病毒抗原总蛋白含量2‑4μg/ml,CpG含量为5‑40μg/ml,铝含量450μg/ml。本发明有益的效果:该方法制成的双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗可以有效提高当前铝佐剂新型冠状病毒灭活疫苗的血清效价和中和抗体水平;同时有效降低抗原用量,同时降低生产成本,提高疫苗产率以及未来全球新冠疫苗的使用覆盖率,造福人类。
Description
技术领域
本发明涉及灭活疫苗领域,主要是一种双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗的制备方法及应用。
背景技术
2019年12月末发生严重急性呼吸道综合症疫情,病原学检测结果证实为一种新型冠状病毒,随后细胞分离获得新型冠状病毒株。国际病毒分类委员会将该新型冠状病毒命名为重症急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndromecoronavirus2,SARS-CoV-2),WHO将该病毒导致的疾病命名为新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease2019,COVID-19),属于β冠状病毒家族。这是已知的第七种感染人类的冠状病毒;四种冠状病毒(229E,NL63,OC43,和HKU1)只会引起轻微感冒症状。相反,其他三个,SARS-CoV,MERS-CoV,和SARSCoV-2能引起严重症状甚至死亡,死亡率分别为10%、37%和5%。
SARS-CoV-2表面覆盖着大量的糖基化S蛋白,糖基化S蛋白与宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合,介导病毒细胞进入[Letko M,Marzi A,Munster V.Functionalassessment of cell entry and receptorusage for SARS-CoV-2and other lineage Bbetacoronaviruses.Nat Microbiol.2020;5:562–9.]。当S蛋白与受体结合,TM蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)(一种位于宿主细胞膜上的2型TM丝氨酸蛋白酶)通过激活S蛋白促进病毒进入细胞。一旦病毒进入细胞,病毒RNA就会释放出来,多蛋白从RNA基因组翻译出来,通过蛋白质裂解和复制酶-转录酶复合物的组装来复制和转录病毒RNA基因组。病毒RNA被复制,结构蛋白被合成,在宿主细胞中组装和包装,之后释放病毒颗粒。在自然状态下,新冠病毒S蛋白以无活性前体状态存在,病毒传染过程中,靶细胞蛋白酶通过将其裂解为S1和S2亚基使S蛋白活化[Bertram S,Dijkman R,Habjan M,Heurich A,Gierer S,Glowacka I,etal.TMPRSS2 activates the human coronavirus 229E for cathepsin-independenthost cell entry and is expressed in viral target cells in the respiratoryepithelium.J Virol.2013;87:6150–60.],这是病毒进入靶细胞后活化膜融合域所必须的[Hoffmann M,Kleine-Weber H,Schroeder S,Kruger N,Herrler T,Erichsen S,etal.SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by aclinically proven protease inhibitor.Cell.2020;181:271–80.e8.]因此,S蛋白是SARS-CoV-2的所有结构蛋白的主要抗原成分。与其他功能蛋白不同,它负责诱导宿主免疫反应,靶向S蛋白的抗体可以诱导针对病毒感染的保护性免疫。S蛋白的特异性效价是疫苗保护作用的重要标志。
新冠疫情发生后,国内外迅速组织开展新冠疫苗的研究,并采用不同的研究方式研制不同类型的疫苗,既有传统技术的应用如灭活疫苗和亚单位疫苗,也有新技术的应用如活载体疫苗和核酸疫苗,希望能快速研制安全有效的疫苗来抵御全球性的新冠疫情。这其中,灭活疫苗的免疫靶点直接取自灭活后的新冠病毒,具有病毒原始抗原表位结构,免疫原性优势明显,接种后可产生较高的免疫保护水平;而且其它类型疫苗相比,可以有效应对新冠毒株本身的变异影响。从当前国内研发进展较快的几款新冠病毒灭活疫苗动物和临床试验数据看出,中和抗体数值偏低,且在免疫效果和免疫时间上可能都存在不足。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足,而提供一种双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗的制备方法及应用。该方法制成的双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗可以有效提高当前铝佐剂新型冠状病毒灭活疫苗的血清效价和中和抗体水平;同时有效降低抗原用量,同时降低生产成本,提高疫苗产率以及未来全球新冠疫苗的使用覆盖率,造福人类。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。一种双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗的制备方法,该方法具体步骤如下:新型冠状病毒灭活原液按规定的同一蛋白质含量或抗原含量进行配制后,添加CpG佐剂和铝佐剂,其中,新冠病毒抗原总蛋白含量2-4μg/ml,CpG含量为5-40μg/ml,铝含量450μg/ml。
所述CpG佐剂为B型CpG,CpG具有SEQ ID No:1所示的核酸序列。
所述的铝佐剂包括氢氧化铝或磷酸铝。
本发明采用上述技术方案,具有如下积极效果:
1、本发明所采用的生产用毒种来源清晰,真实可靠。
2、本发明使用的佐剂为CpG和氢氧化铝双佐剂,在提高疫苗稳定性的同时,可同时激发天然免疫和获得性免疫反应,有效提高人体的自身免疫反应能力,降低抗原用量,缩短应答时间,提高免疫保护效果。
3、本发明使用的CpG佐剂,符合药物标准,生产制造工艺流程和质量检验规程,CpG来源清晰、成分明确、质量可控。
附图说明
图1为不同CpG免疫剂量下,小鼠血清中和抗体效价比较示意图。
具体实施方式
为更清楚的表述本发明的技术方案,下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。这些实施例仅用于举例说明本发明,而不对本发明的范围构成任何限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本发明涉及一种新型佐剂新型冠状病毒灭活疫苗的制备方法,所述的制备方法包括如下步骤:
①生产用细胞基质及病毒液的制备;
②病毒灭活及验证;
③灭活疫苗的制备;
④半成品及成品制备。
实施例1:生产用细胞基质及病毒液的制备:
①细胞复苏:从液氮罐中取出相应数量的Vero细胞(购买于ATCC,编号CCL-81),核对无误后,复苏在T25细胞培养瓶(购买于Corning)中,培养基为含20%新生牛血清的199培养基(199培养基购买于北京天信和生物,新生牛血清购买于杭州天杭生物)的,放入37℃恒温培养箱中进行培养直至细胞张满致密单层。
②细胞传代:将长满致密单层的Vero细胞进行传代,用适量0.01M PBS溶液(自制)缓慢清洗细胞,然后加入适量0.25%胰酶消化液(购买于Gbico)进行消化,并充分混匀后成细胞悬液。将细胞悬液按1:6的传代比例分装到相应的细胞培养瓶或细胞工厂中,并补足细胞培养瓶的液量,放入37℃恒温培养箱中进行培养。连续多次传代,直至达到生产规模细胞数量。
③生产用病毒液的制备,整个制备操作过程均在P3操作区进行:
毒种来源于浙江大学传染病诊治国家重点实验室分离的COVID-19新型冠状病毒毒株(毒株号:ZJU-CV)。在接种前,取合适的无菌离心管用MEM培养液将毒种稀释至相应梯度,按照上面计算的病毒量分别加入到MEM培养液中作为病毒接种液。然后加入到10层细胞工厂(购买于Thermo),混匀完毕后旋紧盖子,放入培养箱培养。
实施例2:病毒液收获及灭活
①观察细胞工厂病变情况,细胞工厂病变达到50%-80%后,依次将细胞工厂放入2~8℃冰箱预冷至4-8℃,然后按1:4000比列加入稀释好的β-丙内酯(购买于SERVA),放入2~8℃继续灭活20h。
②灭活完毕后,根据收获液总量及收集桶内液量,按每批次不少于0.1%的液量进行灭活取样,样品量按不同收获容器进行取样,接种于Vero细胞,盲传3代,每4~5天传1代,每代以细胞病变法检查病毒,结果应均为阴性。
实施例3:灭活疫苗原液的制备
①超滤浓缩:超滤膜(购买于科百特)选用500KD分子量,开启超滤器进行超滤浓缩30到50倍,然后用补加0.01M PBS溶液洗滤,洗滤量至少与浓缩前收获液体积等量。
②酶解纯化:以每毫升25万单位计算添加核酸酶(购买于Merck),置37℃水浴箱或恒温箱中2小时,4000rpm离心60min后收取上清液。启动纯化层析系统(购买于GE),用0.01MpH7.2 PBS溶液平衡层析柱,将核酸酶酶解后样品泵入层析柱,上样量不超过1CV,然后继续用PBS溶液洗脱。收获样品溶液第一峰到收集瓶中,经0.22μm的滤膜(购买于科百特)除菌过滤,取样进行蛋白含量和抗原含量测定,加入人血白蛋白至0.3-0.5%,即为单价原液。
实施例4:半成品及成品制备:
①半成品配制:按照新冠单价抗原总蛋白的终浓度4-8μg/ml、人血白蛋白的终浓度为0.3-0.5%、氢氧化铝(自制)终浓度为450μg/ml,CpG佐剂(来源于南京华普生物技术股份有限公司)终浓度为5-80μg/ml,序列如SEQ ID No:1所示。
计算单价原液、无菌0.02mol/L PBS溶液、20%人血白蛋白和氢氧化铝佐剂用量,并泵入配制罐混合均匀。在无菌操作间A级层流下,按照无菌操作要求准确量取所需溶液,首先加入氢氧化铝溶液,在充分搅拌混合的同时加入新型冠状病毒原液,搅拌10分钟充分混匀使氢氧化铝吸附蛋白,接着按照计算量加入20%人血白蛋白(购买于Baxter AG),加入配液罐中,充分混匀;最后按照计算量加入CpG、0.02mol/L PBS溶液,加入配液罐中,充分混匀。
配制半成品配方如下表1:
②分装与包装:检定合格后,分批分装即为成品。分批分装过程应符合“生物制品分包装及贮运管理”和“生物制品分包装及贮运管理”规定。成品规格为每瓶为0.5ml,每1次人用剂量为0.5ml。
实施例5:动物免疫及评价:
选取18-20g的BALB/C小鼠(购买于维通利华),按照表2的实验方案进行分组,每组9或10只,雌雄各半;每组按设计的免疫程序,在D0和D14天分别以腹腔注射的方式免疫小鼠。按实验设计时间,分别在D0、D6、D13、D21和D28采血分离血清,所有血清检测S蛋白(购买于义翘神州)特异性IgG和病毒中和抗体;按统计学计算每组动物血清IgG和病毒中和抗体几何平均效价,结果见表3。
表2:新型冠状病毒灭活疫苗免疫原性研究实验设计
表3:免疫后小鼠血清中新冠病毒S蛋白特异性效价和中和抗体效价统计列表
不同抗原剂量组相比:
1、低抗原剂量组中(组4-组8),添加CpG后(组5-组8),S蛋白抗体效价及中和抗体效价远大于单铝佐剂组(组4);
2、中抗原剂量组中(组9-组13),添加CpG后(组12-组13),S蛋白抗体效价及中和抗体效价也大于单铝佐剂组(组9);
3、而高抗原剂量组中(组14-组18),添加CpG后(组15-组18),S蛋白抗体效价及中和抗体效价反而小于单铝佐剂组(组14)。
不同CpG剂量组相比(见附图1):
1、比较5、20、40μg/ml三个CpG剂量组,低、中抗原剂量组中和效价水平均与CpG剂量成正相关;
2、CpG剂量达到80μg/ml后,中抗原剂量组中和效价低于低、高抗原剂量组,不同抗原剂量组中和效价水平与CpG剂量不成正相关;
3、80μg/ml CpG剂量组中,除高抗原剂量组之外,整体中和效价水平均低于其它5、20、40μg/ml三个CpG剂量组。
通过不同配方组别中和抗体效价的分析,选择出优选新冠灭活疫苗的配方组,即新冠病毒抗原总蛋白含量2-4μg/ml,CpG含量为5-40μg/ml,铝含量450μg/ml。
本发明选择在当前传统铝佐剂新冠病毒灭活疫苗的基础上,添加CpG佐剂,研发制备出一种双佐剂新冠病毒灭活疫苗,弥补当前灭活疫苗临床结果中出现的中和抗体水平以及细胞免疫水平不足等缺陷;同时,利用CpG佐剂“免疫增效”作用,有效降低抗原用量,同时降低生产成本,提高疫苗产率以及未来全球新冠疫苗的使用覆盖率。
本发明选用的CpG佐剂是一种TLR-9受体激动剂,可以大幅度提高人体的自身免疫反应能力,可同时激发天然免疫和获得性免疫反应,用于肿瘤免疫治疗药物、疫苗佐剂、自身免疫疾病治疗等。CpG通过激活TLR-9受体,使机体对各种抗原的特异性体液和细胞免疫应答增强,包括多肽和蛋白抗原、活的或死亡的病毒、DC疫苗、自体的细胞疫苗、多糖结合物等。CpG佐剂可与上述各类疫苗联合使用,可大大降低抗原用量,缩短应答时间,提高免疫保护效果,因此具有普适性。
可以理解的是,对本领域技术人员来说,对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 浙江天元生物药业有限公司
南京华普生物技术股份有限公司
<120> 一种双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗的制备方法及应用
<130> I030021
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23
Claims (4)
1.一种双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗的制备方法,其特征在于:该方法具体步骤如下:新型冠状病毒灭活原液按规定的同一蛋白质含量或抗原含量进行配制后,添加CpG佐剂和铝佐剂,其中,新冠病毒抗原总蛋白含量2-4μg/ml,CpG含量为5-40μg/ml,铝含量450μg/ml。
2.根据权利要求1所述的双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗的制备方法,其特征在于:所述CpG佐剂为B型CpG,CpG具有SEQ ID No:1所示的核酸序列。
3.根据权利要求1所述的双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗的制备方法,其特征在于:所述的铝佐剂包括氢氧化铝或磷酸铝。
4.权利要求1至3任何一项所述方法制备得到的双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗。
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Address after: 311100 No.56, Tianhe Road, Yuhang Economic Development Zone, Hangzhou City, Zhejiang Province Applicant after: Zhejiang Tianyuan Biological Pharmaceutical Co.,Ltd. Applicant after: Huapu Biotechnology (Jiangsu) Co.,Ltd. Address before: 311100 No.56, Tianhe Road, Yuhang Economic Development Zone, Hangzhou City, Zhejiang Province Applicant before: Zhejiang Tianyuan Biological Pharmaceutical Co.,Ltd. Applicant before: Nanjing Huapu Biotechnology Co.,Ltd. |