CN108524929A - 一种狂犬病疫苗的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种狂犬病疫苗的生产方法，该方法包括如下步骤：(1)狂犬病毒培养，制备病毒收获液；(2)病毒纯化，制备疫苗原液；(3)将疫苗原液与辅料混合，制备成疫苗；其中，步骤(2)之前或之后进行病毒灭活；步骤(2)的病毒纯化包括次序可互换的阴离子交换层析和羟基磷灰石层析。本发明的狂犬病毒生产方法显著提高了纯化后原液抗原纯度，纯度达到重组DNA技术治疗类生物制品标准(95％以上)；进一步降低了杂质残留量，特别是HCP的残留量，限量标准明显高于现行版国家药典同类制品；进一步提高了有效成分的免疫原性，在NIH效价更高的前提下，每剂疫苗所含原液蛋白质含量明显低于现行版国家药典同类制品限量。

Description

一种狂犬病疫苗的生产方法

技术领域

本发明属于疫苗生物学技术领域，具体涉及一种狂犬病疫苗的生产方法。

背景技术

狂犬病是一种高度致命的疾病。由于缺乏有效的治疗手段，人暴露于病毒后一旦进入发病阶段，死亡几乎不可避免。疫苗免疫接种是控制人患狂犬病发生和流行的唯一有效手段。狂犬病疫苗研发、生产和使用130年的实践证明，通过生产方法的持续创新使人用狂犬病疫苗的质量不断得到改进，对于提高疫苗保护效果、挽救更多暴露后人群的生命并降低疫苗使用者的不良反应发生率具有重要意义。

现有的人用狂犬病疫苗生产方法中，纯化工艺主要是利用分子量大小差异或浮力密度差异将病毒收获液中的有效成分与杂质进行分离，分离原理都属于分子筛性质。早期制品采用微孔滤膜过滤技术(微滤)去除组织碎片、脱落细胞或细胞碎片。其后，为提高疫苗效价，增加了超滤浓缩技术，一些小分子杂质也在超滤过程中被去除。1970s建立的蔗糖区带超速离心纯化工艺和1990s建立的凝胶过滤柱层析纯化技术，进一步提高了制品的纯度。此后，人用狂犬病疫苗制品纯化工艺不再有大的改进。国内外各种类型的狂犬病疫苗制品纯化工艺大致相同：病毒收获液微滤澄清、超滤浓缩、蔗糖区带超速离心或凝胶过滤柱层析。

由于现有的狂犬病毒疫苗纯化工艺所存在的不足，导致现有的人用狂犬病疫苗还存在一些问题。主要问题包括：

(1)纯度偏低。由于纯化工艺的原因，疫苗制品中有害杂质残留量偏高，导致疫苗使用者产生不良反应。这些有害杂质包括来源于宿主细胞的蛋白质和DNA、来源于工艺过程添加的牛血清蛋白质及来源于病毒灭活过程中形成的β-丙内脂-人血白蛋白复合物等。

(2)有效成分剂量可控性差。由于杂质含量高，无法采用快速准确的理化分析方法对有效成分的剂量进行检测和控制，只能依靠NIH效价测试法或酶联免疫抗原测试法。二种方法测试结果都不准确，前者测试结果偏差范围大(根据世界卫生组织专家委员会公布的数据，NIH效价测试结果偏差范围为25％～400％)；后者测试结果为有效成分和产品相关杂质(结构异常、免疫原性低的病毒)的总量，与生物学效价相关性差。有效成分剂量不能准确控制，则有可能出现剂量偏低导致免疫失败；或可能出现剂量偏高导致不良反应发生率提高。

(3)制剂复杂且稳定性差。由于纯度低，制剂中需要添加大量的保护剂才能保持制品生物学活性的稳定性。辅料过多不仅增加使用者的体内代谢负担，也增加了产品生产成本。

上述问题主要源于制品生产方法，特别是病毒纯化方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种狂犬病疫苗的生产方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种狂犬病疫苗的生产方法，包括如下步骤：

(1)狂犬病毒培养，制备病毒收获液；

(2)病毒纯化，制备疫苗原液；

(3)将疫苗原液与辅料混合，制备成疫苗；

在步骤(2)之前或之后进行病毒灭活，优选在病毒纯化之后进行病毒灭活；

其中，步骤(2)的病毒纯化包括次序可互换的阴离子交换层析和羟基磷灰石层析。二步层析操作可直接连接，也可在二者之间增加更换缓冲液的步骤。但增加更换缓冲液的步骤可能导致有效成分回收率降低。

本发明方法纯化步骤为将狂犬病毒吸附在阴离子交换层析填料和羟基磷灰石层析填料上，利用不同的洗脱条件并结合不同的分离原理可以将病毒颗粒与培养基质及培养基来源的杂质进行高效分离，也可以将不同结构的病毒颗粒进行有效分离。

作为其中一个优选方案，病毒纯化包括如下步骤：

1)将病毒收获液通过阴离子交换层析，依次洗脱，截取得到中间产物A1；

2)中间产物A1通过羟基磷灰石层析，依次洗脱，收集目标产物。

优选的，步骤1)的操作包括：

A.将狂犬病毒吸附到阴离子交换层析填料上；

B.用pH7.0～9.0、阴离子浓度为100～400mmol/L的预洗脱液进行预洗脱；

C.用pH7.0～9.0、阴离子浓度为200～1000mmol/L的洗脱液洗脱，得到中间产物A1。

优选的，步骤2)的操作包括：

a.将中间产物A1中的狂犬病毒吸附到羟基磷灰石层析填料上；

b.用pH值7.0～9.0、磷酸根离子浓度为50～100mmol/L的预洗脱液进行预洗脱；

c.用pH值7.0～9.0、磷酸根离子浓度为100～400mmol/L的洗脱液洗脱，收集目标产物。

作为其中另一个优选方案，病毒纯化包括如下步骤：

1)将狂犬病毒液通过羟基磷灰石层析，依次洗脱，截取得到中间产物A2；

2)中间产物A2通过阴离子层析，依次洗脱，收集目标产物。

作为优选的，步骤1)的操作包括：

A.将狂犬病毒吸附到羟基磷灰石层析填料上；

B.用pH7.0～9.0、磷酸根离子浓度为50～100mmol/L的预洗脱液进行预洗脱；

C.用pH7.0～9.0、磷酸根离子浓度为100～400mmol/L的洗脱液洗脱，得到中间产物A2。

作为优选的，步骤2)的操作包括：

a.将中间产物A2中的狂犬病毒吸附到阴离子交换层析填料上；

b.用pH值7.0～9.0、阴离子浓度为100～400mmol/L的洗脱液进行预洗脱；

c.用pH值7.0～9.0、阴离子浓度为200～1000mmol/L的洗脱液洗脱，收集目标产物。

所述中间产物A1或A2是指：在批量生产前可以利用无需付出创造性劳动的小试实验，分别截取不同洗脱阶段的洗脱液，测定其纯度及免疫原性，确定纯度高和/或免疫原性高的中间产物的洗脱、截取条件。

进一步优选的，病毒收获液纯化前先进行简单的除杂处理，如经过澄清处理，去除易于去除的杂质，以提高后续层析处理的载荷，进一步降低生产成本。

以上狂犬病毒采用包括但不限于以动物神经组织、禽胚组织、原代动物细胞或传代细胞为培养基质进行培养。具体的培养基质包括但不限于鼠脑、鸡胚、鸭胚、原代地鼠肾细胞、原代鸡胚成纤维细胞、原代狗肾细胞、人二倍体细胞或Vero细胞。

作为优选的，辅料主要由蔗糖和人血白蛋白组成。

进一步优选的，所述辅料各组分在疫苗制剂中的质量浓度为：蔗糖1％-10％，人血白蛋白0.1％-5％。

一种狂犬病疫苗制剂，由以上所述的生产方法制备得到。

本发明的有益效果

实验结果表明，本发明的狂犬病疫苗生产方法可以取得如下效果：

(1)纯化工艺操作简单，纯化效果好、效率高；省去超滤浓缩步骤后，不仅提高了工艺的连贯性，也避免了工艺过程对有效成分的破坏以及导致大分子杂质进一步复杂化。

(2)疫苗原液的抗原纯度高，纯度达到95％以上；

(3)每剂疫苗的杂质残留量低，牛血清蛋白残留量、宿主细胞蛋白质残留量和每剂所含疫苗原液蛋白总量等指标均显著低于国家药典规定的限量；

(4)有效成分的均质性好，狂犬病毒5个结构蛋白组成比例保持稳定。

(5)有效成分的免疫原性高，按疫苗原液蛋白质含量为20μg/剂分装的冻干成品，NIH效价稳定在4IU/剂以上，原液蛋白质装量明显低于国家药典规定的限量；

(6)纯化工艺的耐受性(Process robustness)好，既使病毒收获液质量出现明显差异，也能通过纯化工艺过程进行校正，保证疫苗原液批间的一致性。

(7)病毒灭活在纯化后进行，避免了在灭活过程中产生β-丙内脂-人血白蛋白复合物，进一步提高制品的安全性。

(8)本发明疫苗所使用的辅料组分简单，但制品稳定性好。

附图说明

图1为实施例1制备的疫苗原液进行银染色法SDS-PAGE的凝胶扫描图及狂犬病毒蛋白分子量标定结果。图中，Marker为蛋白质分子量标准品，Mr为其中各组分蛋白质分子量(单位为KD)；1、2和3为同一样品的三个重复分析。

图2为实施例1不同纯化阶段收集的样品进行考马斯亮蓝染色法SDS-PAGE电泳分析结果。显示不同纯化步骤的纯化效果。图中，Marker为蛋白质分子量标准品，Mr为其中各组分蛋白质分子量(单位为KD)；1为病毒收获液；2为阴离子交换层析洗脱组分；3-4为CHT层析洗脱组分(3为脱盐前的样品，4为脱盐后的样品)。

图3为实施例1制备的疫苗原液电镜观察照片。显示纯化收集的目标产物为狂犬病毒颗粒。电镜放大倍数为20000×。

图4为实施例2制备的疫苗原液进行银染色法SDS-PAGE的凝胶扫描图。图中，Marker为蛋白质分子量标准品，Mr为其中各组分蛋白质分子量(单位为KD)；1、2和3为同一样品的三个重复分析。

图5为实施例3制备的疫苗原液进行银染色法SDS-PAGE的凝胶扫描图。图中，Marker为蛋白质分子量标准品，Mr为其中各组分蛋白质分子量(单位为KD)；1、2和3为同一样品的三个重复分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例中的产品质量检测方法及工艺过程中间品质量检测方法说明如下：

1疫苗原液的抗原性鉴别、纯度检测和病毒蛋白组成比例分析

纯化工艺最终收获的纯化后组分为疫苗原液，经酶联免疫方法(ELISA方法)鉴别确定为狂犬病毒特异性抗原。取疫苗原液样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，经银染色或考马斯亮蓝染色后，将电泳胶置于凝胶成像系统下扫描，以分子量测定法标定5个病毒蛋白，按峰面积归一法计算各个病毒蛋白占总蛋白的比例；以5个病毒蛋白比例之和计算为病毒纯度。

2有效成分含量检测

(1)酶联免疫法

采用市售的“人用狂犬病疫苗中病毒抗原相对含量检测试剂盒”检测酶标抗原量，用于工艺过程中间品的有效成分含量粗略检测

(2)蛋白量法

以疫苗原液的蛋白质含量(单位：μg/ml)标定有效成分含量，并作为制剂时剂量配制和分装依据。疫苗原液蛋白质含量检测按《中华人民共和国药典》2015年三部所述方法(通则0731第二法Lorry法)进行。

3其余质量项目检测

按《中华人民共和国药典》2015年三部收录的“冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)”制品检定规程的方法或所述药典通则规定的有关方法进行。

实施例所使用的狂犬病毒收获液可采用下列任意一种方法制备得到，且并不局限于此。

一、生物反应器培养Vero细胞和狂犬病毒CTN-1V株制备病毒收获液

1病毒培养

1.1Vero细胞种子制备：从液氮保存的Vero细胞工作库取出1管或数管冻存细胞，38～40℃水浴解冻后在超净工作台内将细胞悬液移入细胞培养瓶中，加入细胞生长液，生长液为含5％胎牛血清的M199培养基，37℃培养72～96小时，胰蛋白酶消化细胞，按1∶4的分种率传代到新的细胞培养瓶中进行细胞扩增培养，连续扩增5代，制备足够数量用于生物反应器大规模培养的种子细胞；

1.2生物反应器扩增培养Vero细胞：培养瓶中的种子细胞铺满后，胰蛋白酶消化细胞并悬浮到培养基中，将若干个培养瓶的细胞悬液合并，接种至生物反应器中，生长液为含10％小牛血清的M199，培养条件设置为：温度37℃；pH7.2；溶氧35％；连续灌流方式排出培养液并补加新鲜培养基；

1.3生物反应器培养狂犬病毒：细胞在生物反应器中培养6天后，按照0.01-0.1MOI的感染病毒量接种狂犬病毒CTN-1V株毒种，病毒培养条件设置为：温度33℃；pH7.6；溶氧35％；连续灌流方式收获病毒液及补充新鲜维持液；

1.4单次病毒收获液制备

合并病毒收获液，制备成单次病毒收获液。

2病毒收获液检测

从单次病毒收获液中取样进行有关项目检查，结果列于表1。

二、方瓶培养人二倍体细胞(MRC-5细胞)和狂犬病毒CTN-1V株制备病毒收获液

1病毒培养

1.1MRC-5细胞扩增：从液氮保存的MRC-5细胞工作库取出1管冻存细胞，38～40℃的水浴中接冻后将细胞悬液移入细胞培养瓶中，加入细胞生长液，生长液为含5％胎牛血清的MEM培养基，37℃培养72～96小时；胰蛋白酶消化细胞，按照1∶2的分种率传代到新的细胞培养瓶中进行细胞扩增培养，连续扩增6代，制备8个以上TC-175方瓶培养的MRC-5细胞；

1.2方瓶培养狂犬病毒：TC-175方瓶铺满单层MRC-5细胞后，移去瓶内生长液，加入含0.3％人血白蛋白的MEM培养基(维持液)，并按照0.01-0.1MOI的感染病毒量接种狂犬病毒CTN-1株毒种，置33℃培养箱中静止培养144小时，收获病毒培养液，收液后方瓶再加入新鲜维持液，同样条件下培养94小时，第二次收获病毒培养液，每个方瓶收获2次病毒培养液。

1.3单次病毒收获液制备

合并8个方瓶的病毒收获液，制备成单次病毒收获液。

2病毒收获液检测

从单次病毒收获液中取样进行有关项目检查，结果列于表2。

三、鸡胚培养狂犬病毒CTN-1V株制备病毒收获液

1病毒培养

采购5日龄的SPF级鸡胚，表面消毒后于生物安全柜中注射接种狂犬病毒CTN-1株毒种，无菌膜封盖接种针口后置33℃培养箱中静止培养144小时，于生物安全柜中收获鸡胚尿囊液，每枚收获2ml，合并50枚鸡胚的尿囊液，制备单次病毒收获液。

2病毒收获液检查

从单次病毒收获液中取样进行有关项目检查，结果列于表3。

病毒收获液检测数据列表

表1生物反应器培养Vero细胞和CTN-1V病毒株制备的病毒收获液检定结果

表2方瓶培养MRC-5细胞和CTN-1V病毒株制备的病毒收获液检定结果

表3鸡胚培养CTN-1V病毒株制备的病毒收获液检定结果

实施例1狂犬病疫苗(Vero细胞)的生产及产品质量检测

1单次病毒收获液制备：

生物反应器培养Vero细胞和狂犬病毒CTN-1V株制备病毒收获液(见前述病毒收获液制备方法一)。

2病毒纯化

2.1病毒收获液预处理

将单次病毒收获液进行过滤澄清，除去脱落细胞和细胞碎片。

2.2阴离子交换(DEAE柱)层析

(1)柱平衡：对DEAE层析柱进行平衡，平衡液为：pH7.6的20mmol/L磷酸缓冲液(含150mmol/L氯化钠)；

(2)病毒吸附：将预处理后的病毒收获液加样至平衡后的DEAE层析柱，加样量为20倍柱体积；加样结束后，以2-5倍柱体积的平衡液继续平衡层析柱；

(3)预洗脱：以预洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行预洗脱，预洗脱液为：pH7.6的20mmol/L磷酸缓冲液(含250mmol/L氯化钠)；

(4)病毒洗脱：以洗脱液对预洗脱后的层析柱进行洗脱，洗脱液为：pH7.6的20mmol/L磷酸缓冲液(含550mmol/L氯化钠)，根据层析系统检测仪指示的光吸收峰收集洗脱液，得到产物A；

2.3羟基磷灰石柱(CHT柱)层析

(1)柱平衡：对CHT层析柱进行平衡，平衡液为：pH7.6的20mmol/L磷酸缓冲液(含550mmol/L氯化钠)；

(2)病毒吸附：将产物A流过平衡后的CHT层析柱，加样量为5倍柱体积；加样结束后，以2-5倍柱体积的平衡液继续平衡层析柱；

(3)预洗脱：以预洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行预洗脱，预洗脱液为：pH7.6的100mmol/L磷酸缓冲液(含150mmol/L氯化钠)；

(4)病毒洗脱：以洗脱液对预洗脱后的层析柱进行洗脱，洗脱液为：pH7.6的200mMol/L磷酸缓冲液(含150mmol/L氯化钠)，根据层析系统检测仪指示的光吸收峰收集洗脱液，得到目标病毒洗脱液。

3病毒灭活

向目标病毒洗脱液中加入终浓度为1/4000的β-丙内脂，2～8℃条件下灭活病毒24小时后置37℃水浴中2小时使灭活剂完全水解。

4脱盐制备疫苗原液

灭活后的目标病毒洗脱液以S-200凝胶过滤柱层析脱盐制备疫苗原液，脱盐后的缓冲液为pH7.6的20mmol/L磷酸缓冲液(含50mmol/L氯化钠)。

5疫苗原液质量检测

取样检测疫苗原液的蛋白质含量、Vero细胞蛋白质残留量、Vero细胞DNA残留量，并与纯化前的单次病毒收获液对应检测值进行比较，计算纯化工艺对杂质的去除率，结果列于表4。检测结果表明疫苗原液杂质含量低，每剂疫苗抗原蛋白质含量、Vero细胞蛋白质残留量均显著低于国家药典规定的限量标准，有关数据对比见表5。

对疫苗原液样品进行银染色法SDS-PAGE电泳分析，检测抗原纯度，三次重复检测结果及平均值见表6，疫苗原液的SDS-PAGE电泳图见图1。检测结果表明疫苗原液的抗原纯度高于95％。

对疫苗原液、纯化各步骤中间品及纯化前的单次病毒收获液进行银染色法SDS-PAGE电泳分析，电泳图如图2；结果显示每一步层析都具有显著的纯化效果。

取疫苗原液样品进行电镜观察，电镜照片如图3。结果显示纯化后产物为狂犬病毒颗粒。

6疫苗半成品配制

根据疫苗原液蛋白质含量检测结果，按疫苗原液蛋白质含量终浓度为40μg/ml进行稀释和配制。组方中其他物质(辅料)的组成、含量和作用为：1％人血白蛋白和5％蔗糖为赋形剂/保护剂，按此组方配制疫苗半成品。

7疫苗制剂

半成品分装到2ml玻璃管制品，规格0.5ml/瓶，置冻干机内进行冷冻干燥，冻干后立即加胶塞并扎铝塑复合盖密封，制备为成品。

8成品质量检测

按《中华人民共和国药典》2015年三部收录的“冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)”制品检定规程的方法或所述药典通则规定的有关方法对制备的疫苗产品进行质量检测，并与现行版国家药典同类制品标准进行对比，结果列于表9。检测结果表明产品各项质量指标均达到或超过国家药典规定的标准。

9疫苗产品稳定性考察

9.1实时稳定性(长期稳定性)实验

将疫苗产品置2～8℃的药品保存箱作长期保存，按计划分别于放置后3个月、6个月、9个月、1年、2年和3年时取样进行NIH效价检测。已完成1年的稳定性考察，各时间点NIH效价检测结果列于表7。表7数据显示疫苗产品的稳定性良好。

9.2加速稳定性实验

将疫苗产品置37℃的恒温箱保存，分别于放置后28天、35天和42天时取样进行NIH效价检测。各时间点NIH效价检测结果列于表8；结果表明经37℃高温处理42天后，疫苗产品的效价仍然符合国家药典要求，产品的热稳定性超过药典规定的37℃放置28天标准。

10生产批间疫苗原液均质性考察

按本实施例同样的生产方法、同样的工艺条件和同样的规模，从细胞复苏开始到疫苗产品制备进行连续9批生产，将各批生产疫苗原液纯度分析列表比较，结果见表10。表10数据表明不同批间有效成分的一致性和均质性良好。

实施例1检测数据和结果列表

表4疫苗原液(Vero细胞)检测结果和纯化指标分析

表5疫苗原液(Vero细胞)质量指标检测结果与国家药典标准对比

表6疫苗原液(Vero细胞)抗原纯度分析

表7疫苗产品(Vero细胞)实时稳定性实验NIH效价检测结果

表8疫苗产品(Vero细胞)加速稳定性实验NIH效价检测结果

表9疫苗产品(Vero细胞)质量检定结果

表10连续9批生产的疫苗原液(Vero细胞)抗原纯度分析

实施例2狂犬病疫苗(人二倍体细胞)生产及产品质量检测

1单次病毒收获液制备：

方瓶培养MRC-5细胞和狂犬病毒CTN-1V株制备病毒收获液(见前述病毒收获液制备方法二)。

2病毒纯化

按实施例1步骤2.1～2.3所述方法进行。根据病毒收获液的酶联免疫检测结果按比例提高DEAE柱层析加样量，并相应缩小层析柱规模；

3病毒灭活

按实施例1步骤3所述方法进行。

4脱盐制备疫苗原液

按实施例1步骤4所述方法进行。根据病毒灭活后样品体积按比例缩小脱盐柱规模。

5疫苗原液质量检测

取样检测疫苗原液的蛋白质含量和酶标抗原含量，并与纯化前的单次病毒收获液对应检测值进行比较，结果列于表11。

对疫苗原液样品进行银染色法SDS-PAGE电泳分析，检测抗原纯度，三次重复检测结果及平均值见表12，疫苗原液的SDS-PAGE电泳图见图4。检测结果表明疫苗原液的抗原纯度高于95％。

6疫苗半成品配制

按实施例1步骤6所述方法进行。

7疫苗制剂

按实施例1步骤7所述方法进行。

8成品质量检测

狂犬病疫苗(人二倍体细胞)尚未列入国家药典。参考《中华人民共和国药典》2015年三部收录的“冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)”制品检定规程的方法或所述药典通则规定的有关方法对制备的疫苗产品进行质量检测，结果列于表13。按国内外疫苗产品管理相关规定，人二倍体细胞培养生产的疫苗不进行宿主细胞蛋白质残留量和DNA残留量检测。

实施例2检测数据和结果列表

表11疫苗原液(人二倍体细胞)和对应的病毒收获液检测结果及纯化技术指标分析

表12疫苗原液(人二倍体细胞)抗原纯度分析

表13疫苗产品(人二倍体细胞)质量检定结果

实施例3狂犬病疫苗(鸡胚)生产及产品质量检测

1单次病毒收获液制备：

鸡胚培养狂犬病毒CTN-1V株制备病毒收获液(见前述病毒收获液制备方法三)。

2病毒纯化

2.1病毒收获液预处理

100ml单次病毒收获液(鸡胚尿囊液)，加入400ml含0.1％人血白蛋白的PBS溶液(磷酸钠浓度为20mmol/L，氯化钠浓度为150mmol/L，pH值为7.6)，以0.45μm的微孔滤膜进行过滤澄清，除去组织碎片、脱落细胞和细胞碎片。

2.2羟基磷灰石柱(CHT柱)层析

(1)柱平衡：对CHT层析柱进行平衡，平衡液为：pH7.6的20mmol/L磷酸缓冲液(含150mmol/L氯化钠)。

(2)病毒吸附：将预处理后的病毒收获液加样至平衡后的CHT层析柱，加样量为20倍柱体积；加样结束后，以2-5倍柱体积的平衡液继续平衡层析柱。

(3)预洗脱：以预洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行预洗脱，预洗脱液为：pH7.6的100mmol/L磷酸缓冲液(含150mmol/L氯化钠)。

(4)病毒洗脱：以洗脱液对预洗脱后的层析柱进行洗脱，洗脱液为：pH7.6的200mMol/L磷酸缓冲液(含150mmol/L氯化钠)，根据层析系统检测仪指示的光吸收峰收集洗脱液，得到产物A。

2.3阴离子交换(DEAE柱)层析

(1)柱平衡：对DEAE层析柱进行平衡，平衡液为：pH7.6的20mmol/L磷酸缓冲液(含150mmol/L氯化钠)。

(2)病毒吸附：将产物A流过平衡后的DEAE层析柱，加样量为5倍柱体积；加样结束后，以2-5倍柱体积的平衡液继续平衡层析柱。

(3)预洗脱：以预洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行预洗脱，预洗脱液为：pH7.6的20mmol/L磷酸缓冲液(含250mmol/L氯化钠)。

(4)病毒洗脱：以洗脱液对预洗脱后的层析柱进行洗脱，洗脱液为：pH7.6的20mmol/L磷酸缓冲液(含550mmol/L氯化钠)，根据层析系统检测仪指示的光吸收峰收集洗脱液，得到目标病毒洗脱液。

3病毒灭活

按实施例1步骤3所述方法进行。

4脱盐制备疫苗原液

按实施例1步骤4所述方法进行。根据病毒灭活后样品体积按比例缩小脱盐柱规模。

5疫苗原液质量检测

取样检测疫苗原液的蛋白质含量和酶标抗原含量，并与纯化前且经预处理的单次病毒收获液对应检测值进行比较，结果列于表14。

对疫苗原液样品进行银染色法SDS-PAGE电泳分析，检测抗原纯度，三次重复检测结果及平均值见表15，疫苗原液的SDS-PAGE电泳图见图5。检测结果表明疫苗原液的抗原纯度高于95％。

6疫苗半成品配制

按实施例1步骤6所述方法进行。

7疫苗制剂

按实施例1步骤7所述方法进行。

8成品质量检测

8成品质量检测

狂犬病疫苗(鸡胚)尚未列入国家药典。参考《中华人民共和国药典》2015年三部收录的“冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)”制品检定规程的方法或所述药典通则规定的有关方法对制备的疫苗产品进行质量检测，结果列于表16。按国内外疫苗产品管理相关规定，鸡胚培养生产的疫苗不进行宿主细胞蛋白质残留量和DNA残留量检测。

实施例3检测数据和结果列表

表14疫苗原液(鸡胚)和对应的病毒收获液检测结果及纯化技术指标分析

表15疫苗原液(鸡胚)抗原纯度分析

表16疫苗产品(鸡胚)质量检定结果

根据图1、图4和图5可以看出：采用不同培养方法得到的病毒收获液经过本发明方法纯化后，得到的狂犬病毒疫苗中5个结构蛋白组成比例保持稳定。

Claims (11)

1.一种狂犬病疫苗的生产方法，包括如下步骤：

(1)狂犬病毒培养，制备病毒收获液；

(2)病毒纯化，制备疫苗原液；

(3)将疫苗原液与辅料混合，制备成疫苗；

在步骤(2)之前或之后进行病毒灭活；

其中，步骤(2)的病毒纯化包括次序可互换的阴离子交换层析和羟基磷灰石层析。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，病毒纯化包括如下步骤：

1)将病毒收获液通过阴离子交换层析，吸附病毒，然后依次洗脱，截取得到中间产物A1；

2)中间产物A1通过羟基磷灰石层析，吸附病毒，然后依次洗脱，收集目标产物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)的操作包括：

A.将狂犬病毒吸附到阴离子交换层析填料上；

B.用pH7.0～9.0、阴离子浓度为100～400mmol/L的洗脱液进行预洗脱；

C.用pH7.0～9.0、阴离子浓度为200～1000mmol/L的洗脱液洗脱，得到中间产物A1。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤2)的操作包括：

a.将中间产物A1中的狂犬病毒吸附到羟基磷灰石层析填料上；

b.用pH值7.0～9.0、磷酸根离子浓度为50～100mmol/L的洗脱液进行预洗脱；

c.用pH值7.0～9.0、磷酸根离子浓度为100～400mmol/L的洗脱液洗脱，收集目标产物。

5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，病毒纯化包括如下步骤：

1)将病毒收获液通过羟基磷灰石层析，吸附病毒，然后依次洗脱，截取得到中间产物A2；

2)中间产物A2通过阴离子层析，吸附病毒，然后依次洗脱，收集目标产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)的操作包括：

A.将狂犬病毒吸附到羟基磷灰石层析填料上；

B.用pH7.0～9.0、磷酸根离子浓度为50～100mmol/L的洗脱液进行预洗脱；

C.用pH7.0～9.0、磷酸根离子浓度为100～400mmol/L的洗脱液洗脱，得到中间产物A2。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤2)的操作包括：

a.将中间产物A2中的狂犬病毒吸附到阴离子交换层析填料上；

b.用pH值7.0～9.0、阴离子浓度为100～400mMol/L的洗脱液进行预洗脱；

c.用pH值7.0～9.0，阴离子浓度为200～1000mMol/L的洗脱液洗脱，收集目标产物。

8.根据权利要求1-7任一项所述的生产方法，其特征在于，病毒收获液纯化前先经过澄清处理、适当提高病毒收获液的阴离子浓度或磷酸根离子浓度。

9.根据权利要求1-8任一项所述的生产方法，其特征在于，狂犬病毒培养采用动物神经组织、禽胚组织、原代动物细胞或传代细胞为培养基质。

10.根据权利要求1-9任一项所述的生产方法，其特征在于，制剂辅料主要由蔗糖和人血白蛋白组成。

11.根据权利要求10所述的生产方法，其特征在于，所述制剂辅料各组分在疫苗制剂中的质量百分比浓度为：蔗糖1％～10％，人血白蛋白0.1％～5％。