CN105548540A - 一种i-iv型登革热病毒的通用检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，属于病毒检测技术领域。该试剂盒包括酶标记板、阴性对照血清、阳性对照NS1重组蛋白、检测抗体、显色底物和终止液。所述酶标记板上的包被抗体为DV14抗体，检测抗体为连接了生物素的DV11抗体。所述的阴性对照血清为没有感染登革热病毒的正常人的血清，终止液为2M的硫酸，显色底物包括酶标亲和素抗体和TMB显色液。本发明除了能快速的对早期登革热进行诊断，它还具有很高的专一性，与乙脑病毒并无交叉反应，对登革病毒具有良好的识别能力。本发明可使得四种不同型别特异性的单克隆抗体一次产生，缩短了至少4倍的时间和后续的成本。

Description

一种I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒。
背景技术
登革病毒(Dengusvirus，DENV)登革病毒属于黄病毒科黄病毒属中的一个血清型亚群，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播，引起登革热以及发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。世界卫生组织将感染了登革病毒患者的临床症状分类为登革热(DF)、登革出血热(DH)和登革休克综合征(DSS)。感染患者表现出在持续高热2-7天，并伴有头痛，全身乏力，恶心，呕吐，肌肉痛和腹痛。近年来，由于全球气候变暖、人口流动频繁等因素，登革热的爆发和流行范围有逐年扩大和愈演愈烈之势，其在全球的发病率提高了近30倍。在过去两年中，在地处热带和亚热带地区的东南亚、美洲以及西太平洋地区，超过100个国家的25亿人受到登革病毒的威胁，在2009-2013年间每年全球登革热、登革出血热的发病数均达3.9亿。2015年，截止10月10日仅在中国云南省西双版纳州累计报告登革热病例超过398例。登革热是过去50年间世界上最为严重的传染病之一，已成为严重的全球性公共卫生问题，不仅严重危害人类的健康，还为国家和个人带来沉重的经济负担。
目前由于登革热治疗的特效药物以及相关的预防疫苗还没有上市。所以登革热的诊断对预防和治疗登革热起到了至关重要的作用。在常规诊断方法主要包括三种，(1)RT-PCR法：登革病毒检测的方法常规用的是分离病毒后，通过RT-PCR来检测；(2)登革病毒抗体IgM和IgG抗体ELISA检测法；(3)登革病毒NS1抗原的检测法。在这三种检测方法中，RT-PCR法为最经典的检测方法，但是由于其操作时间长，成本也最高，所以不太适合临床大量样本的处理和检测。而第二种登革病毒抗体IgM和IgG抗体ELISA检测法，虽然其具有特异性、敏感性以及稳定性较高的特点，但其只有在登革病毒感染5-7天后才能检测出来。第三种NS1抗原检测法与第二种方法相比，能在最初感染的时候被检测出来，对于登革热的早发现、早干预及早治疗具有重要意义。而且NS1抗原的检出浓度对于登革热患者的预后具有重要的指导意义。但目前的NS1抗原的ELISA检测试剂盒中的包被抗体和检测抗体，其来源大多都为天然NS1抗体免疫后所得的抗体，由于登革病毒有四个型别，所以其抗体的制作过程会相对复杂，成本也会相应的有所提高。因此，制作操作简单、早期检测、快速准确且成本低的新型的登革病毒NS1抗原的ELISA检测试剂盒对于普通人民有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种基于登革病毒非结构蛋白NS1特异表位肽的I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，通过检测血清中登革病毒中的非结构蛋白NS1，可对早期感染登革热的病人进行早期诊断和最后的确诊，还可以通过检测非结构蛋白NS1的量来指导病人的病情。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，包括酶标记板、阴性对照血清、阳性对照重组蛋白、检测抗体、显色底物和终止液；
所述酶标记板上的包被抗体为DV14抗体，所述的DV14抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；
所述的阴性对照血清为没有感染登革热病毒的正常人的血清；
所述的阳性对照重组蛋白包括四种型别的NS1重组蛋白；
所述的四种型别的NS1重组蛋白的制备方法均是将登革病毒标准株经RT-PCR扩增后，与pMD19T载体连接，连接产物与pET30a经BamHI和NotI双酶切后，胶回收，T4DNA连接酶连接回收产物，然后再转到大肠杆菌BL-21中，通过表达纯化，得到相应型别的NS1重组蛋白；
所述的登革病毒标准株包括I-IV型登革病毒标准株；
所述的检测抗体为连接了生物素的DV11抗体，所述的DV11抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.2；
所述的显色底物包括酶标亲和素抗体和TMB显色液；所述的酶标亲和素抗体为HRP标记的羊抗小鼠二抗；
所述的终止液为2M的硫酸。
进一步，优选的是所述的DV14抗体的制备方法为：将如SEQIDNo.1的氨基酸序列编码的多肽DV14与牛血清蛋白连接后免疫小鼠所得的单克隆抗体。
进一步，优选的是所述的DV14抗体的制备方法为：将多肽DV14与牛血清蛋白连接后，得到DV14-BSA抗原；
用生理盐水将DV14-BSA稀释并与弗氏完全佐剂乳化，至乳化液中DV14-BSA的浓度为1μg/μl，然后将乳化液于小鼠皮下多点注射，选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，以每只小鼠免疫100μl的的乳化液来免疫，每只小鼠免疫的抗原量为100μg；然后分别在第21天、第35天、第49天后用相同的办法进行第二次、第三次以及第四次免疫；经四次免疫过后，取小鼠脾细胞，按1：4(v/v)的比例将SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞进行混合，总体积20ml，混合前骨髓瘤细胞和脾细胞的密度均调节为107个/ml，850rpm离心5min，弃掉上清，然后在37℃水浴中于1分钟内边摇边滴加1ml的50％(v/v)PEG-1400的GKN溶液，滴加完后于2分钟内再加入20ml预热至37℃的1640培养基以终止融合，1000r/min离心，去上清，用60ml含10％(v/v)胎牛血清的1640培养基重悬细胞，并每孔100μl加入预先加好饲养细胞的96孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中培养，12h后，把含10％(v/v)胎牛血清的1640培养基换成含有HAT的选择培养基，同样条件下培养，每隔2天换一次新的HAT选择培养基，待细胞长至39-41％的时候，把含有HAT的选择培养基换成含有HT的培养基，通过有限稀释法得到了DV14单克隆细胞株；
选取6-8周龄的BALB/c小鼠提前一周用石蜡油来致敏小鼠，注射2ml的106个/ml的DV14单克隆细胞株来制备腹水，最后采用Millpore公司MontageAntibodypurificationkit试剂盒来纯化腹水，得到包被抗体DV14。
进一步，优选的是所述酶标记板的制备方法是：将所述的包被抗体DV14用包被缓冲液稀释到2.5μg/ml后，按100μl/孔包被到酶标记板的微孔内，在4℃条件下，将酶标记板置于湿盒中反应24小时后，用PBST洗板，每孔PBST用量为0.25ml，在4℃下，按每孔200μl放入3％(m/v)的脱脂奶粉封闭酶标记板，封闭24小时后，弃除多余的封闭液，置4℃保存，即得到酶标记板；
所述的包被缓冲液的pH为9.6，每1000ml包被缓冲液中含Na2CO31.59g、NaHCO32.93g；
所述的PBST为含有0.05％(v/v)吐温20的磷酸缓冲液；
所述的3％(m/v)的脱脂奶粉为以PBST为溶剂，以脱脂奶粉为溶质配成的溶液。
进一步，优选的是所述的阳性对照NS1重组蛋白的制备方法为：
①将登革病毒标准株进行RT-PCR扩增，得到NS1全基因；
②将NS1全基因与pMD19T载体连接，制备PMD19T-NS1质粒；
③将pMD19T-NS1质粒以及空表达载体pET30a同时采用BamHI和NotI进行双酶切，胶回收NS1目的片段与双酶切后的表达载体pET30a质粒片段，然后采用T4DNA连接酶将胶回收的NS1目的片段与表达载体pET30a质粒片段进行连接，得到pET30a-NS1质粒；
④将pET30a-NS1质粒到大肠杆菌BL-21中，然后通过表达纯化，得到NS1重组蛋白；
所述的登革病毒标准株为I型登革病毒标准株DV1Ag.st、Ⅱ型登革病毒标准株DV216681、Ⅲ型登革病毒标准株DV3H87和IV型登革病毒标准株DV4H241；
所述的RT-PCR扩增时，I型登革病毒标准株DV1Ag.st的扩增引物为：
F：5'-GGATCCGACTCGGGATGTGTAATCAACT-3'(SEQIDNo.3)；
R：5'-GCGGCCGCTGCAGAGACCATTGACTTAACTAGG-3'(SEQIDNo.4)
Ⅱ型登革病毒标准株DV216681的扩增引物为：
F：5'-GGATCCGATAGTGGTTGCGTTGTGAGCTGG-3'(SEQIDNo.5)；
R：5'-GCGGCCGCAGCTGTGACCAAGGAGTTGACC-3'(SEQIDNo.6)；
Ⅲ型登革病毒标准株DV3H87的扩增引物为：
F：5'-GGATCCGACATGGGGTGTGTCATAAACT-3'(SEQIDNo.7)；
R：5'-GCGGCCGCCGCTGAGACTAAAGACTTTACCATG-3'(SEQIDNo.8)；
IV型登革病毒标准株DV4H241的扩增引物为：
F：5'-GGATCCGACATGGGTTGTGTGGCGTCATGGA-3'(SEQIDNo.9)；
R：5'-GCGGCCGCGGCCGTCACCTGTGATTTGACCA-3'(SEQIDNo.10)。
进一步，优选的是所述的检测抗体的制备方法为将生物素与DV11抗体连接所得的抗体，即为检测抗体；
检测抗体在进行检测时，将检测抗体(1μg/μl)与溶剂按照体积比为1:3000进行配制后进行检测，该溶剂为PBS；
而所用的显色底物中的酶标亲和素抗体在使用时，将酶标亲和素抗体(1μg/μl)与溶剂按照体积比为1:2000进行配制后进行检测，该溶剂为包被缓冲液；
所述的DV11抗体的制备方法是将如SEQIDNo.2的氨基酸序列编码的多肽DV11与牛血清蛋白连接后免疫小鼠所得的单克隆抗体。
进一步，优选的是所述的DV11抗体的制备方法是：将多肽DV11与牛血清蛋白连接后，得到DV14-BSA抗原；
用生理盐水将DV11-BSA稀释并与弗氏完全佐剂乳化，至乳化液中DV11-BSA的浓度为1μg/μl，然后将乳化液于小鼠皮下多点注射，选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，以每只小鼠免疫100μl的的乳化液来免疫，每只小鼠免疫的抗原量为100μg；然后分别在第21天、第35天、第49天后用相同的办法进行第二次、第三次以及第四次免疫；经四次免疫过后，取小鼠脾细胞，按1：4(v/v)的比例将SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞进行混合，总体积20ml，混合前骨髓瘤细胞和脾细胞的密度均调节为107个/ml，850rpm离心5min，弃掉上清在37℃水浴中于1分钟内边摇边滴加1ml的50％(v/v)PEG-1400的GKN溶液，于2分钟内加入20ml预热至37℃的1640培养基以终止融合，1000r/min离心，去上清，用60ml含10％(v/v)胎牛血清的1640培养基重悬细胞，并每孔100μl加入预先加好饲养细胞的96孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。12h后，把含10％(v/v)胎牛血清的1640培养基换成含有HAT的选择培养基，同样条件下培养；待细胞长至39-41％的时候，把含有HAT的选择培养基换成含有HT的培养基，通过有限稀释法得到了DV11单克隆细胞株；
选取6-8周龄的BALB/c小鼠提前一周用石蜡油来致敏小鼠，注射2ml的106个/ml的DV11单克隆细胞株来制备腹水，最后采用Millpore公司MontageAntibodypurificationkit试剂盒来纯化腹水，得到包被抗体DV14。
进一步，优选的是所述的酶标记板为96孔板。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明除了能快速的对早期(3-8天)登革热进行诊断，它还具有很高的专一性，与乙脑病毒并无交叉反应，对登革病毒具有良好的识别能力。
本发明在保持NS1诊断试剂盒的所有优点的同时，其制作方法较传统方法更简单快速，节省了大量的成本与工作量。主要表现为：(1)免疫动物时选取的免疫抗原是小分子抗原，通过计算机辅助分析筛选获得基于登革病毒非结构蛋白NS1特异表位肽，并且这些肽段具有I-IV型登革病毒NS1抗原通用表位，随后人工合成单一抗原表位序列，并与小分子载体BSA，形成了具有抗原性的小分子化合物，采用单一表位可以刺激小鼠机体的免疫系统产生针对该表位的B细胞克隆群，相对与全病毒免疫小鼠产生的多个不同的B细胞克隆群，该免疫方法具有更少的细胞克隆群，更有利于后期单克隆细胞株的筛选，大大减少了工作量及操作成本；(2)选取纯化腹水来获得抗体，与纯化杂交瘤细胞上清液获得抗体的方法比较，纯化腹水的方法成本较低，并且获得的抗体浓度较高，无需重复的大量培养细胞以及浓缩细胞上清，避免了培养细胞时可能出现的污染等外部因素。(3)免疫抗原选择的是I-IV型登革病毒NS1蛋白全序列中的保守序列，即通过免疫一种抗原表位，就可以获得针对四种型别NS1抗原的单克隆抗体，而不是分组免疫I-IV型的登革病毒，然后再通过大量的杂交瘤筛选及抗体纯化后的相互交叉反应验证来获得I-IV型通用型单克隆抗体。由于单克隆抗体来源于被免疫小鼠的腹水，如果假设一种单克隆抗体需要一只小鼠，那么单独的每个型别NS1的单克隆抗体都需要一只小鼠，要得到四种不同型别的单克隆抗体则需要四只老鼠；而本发明由于是通用型的抗体则只需要一只小鼠，缩短了至少4倍的时间和后续的成本。
附图说明
图1.免疫荧光检测抗体特异性；图1a-d：分别感染了I-IV型登革病毒后的BHK细胞与单克隆抗体DV24反应；图1e：使用4G2阳性抗体作对照；图1f：阴性对照。
图2.Westernblots检测DV11与DV14的特异性；
其中，图2a为DV11作为Westernblots一抗检测四种型别重组蛋白NS1；1：空BL21全菌蛋白对照；2-5：I-IV型的重组蛋白NS1；
图2b为DV14作为Westernblots一抗检测四种型别重组蛋白NS1；1：空BL21全菌蛋白对照；2-5：I-IV型的重组蛋白NS1。
图3.I-IV型登革病毒NS1基因的扩增；M：5000bpDNAmarker；1-4:I-IV型登革病毒NS1基因片段。
图4.双酶切鉴定pMD19T-NS1质粒；M:DNAmarker(DL15000)；1-4:BamHI/NotI双酶切鉴定I-IV型的重组质粒pMD19T-NS1。
图5.双酶切鉴定pET30a-NS1质粒；M:DNAmarker(DL15000)；1-4:BamHI/NotI双酶切鉴定I-IV型的重组质粒pET30a-NS1。
图6.NS1重组蛋白原核诱导表达鉴定图；M：预染的蛋白marker；1-7：含I型重组表达质粒pET30a-NS1的BL21表达0h,2h,4h,6h,8h,10h,12h后的全菌蛋白。
图7.纯化后的重组I-IV型登革病毒NS1蛋白SDS-PAGE鉴定图；M：预染的蛋白marker；1-4：纯化后的Ⅰ-IV型的重组蛋白NS1。
图8.重组蛋白NS1的westernblot分析；
其中，图8a为DV11抗体检测重组蛋白NS1；1：空BL21全菌蛋白对照；2-5：I-IV型的重组蛋白NS1；
图8b为DV14抗体检测重组蛋白NS1；1：空BL21全菌蛋白对照；2-5：I-IV型的重组蛋白NS1；
图8c为Anti-His抗体检测重组蛋白NS1；1-4：I-IV型的重组蛋白NS1。
图9.免疫血清中抗体效价测定结果；Contro：免疫PBS的对照组；FC：重组抗原与弗氏佐剂组；ALC：重组抗原与铝佐剂组。
图10.方阵试验部分结果；图a-d：DV11作为包被抗体，DV14作为检测抗体，浓度梯度下检测DV(I-IV)-NS1时的OD值变化。
图11.方阵试验部分结果图a-d：DV14包被抗体，DV11作为检测抗体，浓度梯度下检测DV(I-IV)-NS1时的OD值变化。
图12.方阵试验部分结果；图a-d：以2.5μg的DV14包被酶标记板，DV11浓度梯度下作为检测抗体检测DV(I-IV)-NS1时的OD值变化
图13.不同组别间稳定性的检测；NO1-3：正常包被抗体批次实验组；contro1-3：包被好抗体后将酶标记板及相关检测试剂置于37℃7天后的对照组
图14.样品抗原的最低检出下限。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
DV14-BSA抗原由上海强耀生物技术有限公司合成。
DV11-BSA抗原由上海强耀生物技术有限公司合成。
I型登革病毒标准株DV1Ag.st、Ⅱ型登革病毒标准株DV216681、Ⅲ型登革病毒标准株DV3H87和IV型登革病毒标准株DV4H241均为现有的公开的登革病毒标准株。
所述的酶标亲和素抗体(HRP标记的羊抗小鼠二抗)和TMB显色液均购自于Sigma公司。
GKN溶液：NaCl8g，KCl0.4g，Na2HPO4·2H2O1.77g，NaH2PO4·2H2O0.69g，葡萄糖2g，酚红0.01g，溶于1000ml重蒸水中。
50％(v/v)PEG-1400的GKN溶液为将PEG-1400与GKN溶液等体积混合制得的。
6M尿素缓冲液：每1000ml包被缓冲液中含磷酸氢二钠8.95g、磷酸二氢钾3.4g、尿素6mol；
4M尿素缓冲液：每1000ml包被缓冲液中含磷酸氢二钠8.95g、磷酸二氢钾3.4g、尿素4mol；
2M尿素缓冲液：每1000ml包被缓冲液中含磷酸氢二钠8.95g、磷酸二氢钾3.4g、尿素2mol；
包被缓冲液的pH为9.6，每1000ml包被缓冲液中含Na2CO31.59g、NaHCO32.93g；
本发明所述的细胞培养基为含10％(v/v)胎牛血清的1640培养基，即完全培养基，购买于Gibco。
本发明所述的不完全培养基为1640培养基，购买于Gibco。
本发明的含10％(v/v)胎牛血清的1640培养基也叫做细胞维持液，购买于Gibco。
本发明所有有关含HAT、HT的培养基均来购买于Gibco。
DV(I-IV)-NS1指的是四种型别的NS1重组蛋白，分别可以表示为DVI-NS1蛋白、DVⅡ-NS1蛋白、DVⅢ-NS1蛋白和DVIV-NS1蛋白
实施例1
I-IV型登革病毒非结构蛋白NS1通用型单克隆抗体(包被抗体、检测抗体)的制备方法
(1)免疫抗原的选择和制备
通过生物信息软件比对I-IV型登革病毒标准株非结构蛋白NS1的全蛋白序列以及预测它们之间的共同保守抗原表位，筛选出四个可能的抗原表位，分别是DV11、DV12、DV13及DV14(表1)；由中国上海强耀生物技术有限公司将这四个表位合成，并把部分合成的抗原表位多肽分别与BSA以及KLH小分子载体偶联，制备为免疫抗原和检测抗原。
表1免疫抗原信息
(2)免疫动物
选择(1)中偶联了BSA小分子载体的DV11-BSA，DV12-BSA，DV13-BSA，DV14-BSA作为免疫小鼠的抗原，用生理盐水将DV14-BSA稀释并与弗氏完全佐剂乳化，至乳化液中DV14-BSA的浓度为1μg/μl，然后将乳化液于小鼠皮下多点注射，选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，以每只小鼠免疫100μl的的乳化液来免疫，每只小鼠免疫的抗原量为100μg，按免疫抗原的不同将小鼠分为四个组别，每组四只小鼠以每只小鼠免疫100μl的乳化液来免疫；21天后进行第二次免疫，这次用弗氏不完全佐剂与免疫抗原乳化后来分组免疫小鼠，然后每隔二周免疫，强免疫第三次和第四次。经第四次免疫过后，小鼠眼眶取血，用ELISA方法来检测小鼠的抗体效价，检测抗原选择KLH偶联的抗原表位。效价较的小鼠再经脾脏免疫来加强一次。4天后分别取小鼠脾细胞制备杂交瘤细胞。
(3)小鼠免疫后经ELISA方法检测其血清效价
a.用(1)中KLH偶联的抗原来包被96孔酶标记板制备包被缓冲液，并用该包被液来稀释检测抗原浓度至10μg/ml，分别以KLH-DV11，KLH-DV12，KLH-DV13，KLH-294来包被ELISA酶标记板，用排枪每孔加入100μl稀释好的抗原，包被好之后，将酶标记板置于湿盒中，4℃冰箱过夜
所述的包被缓冲液的pH为9.6，每1000ml包被缓冲液中含Na2CO31.59g、NaHCO32.93g；
b.封闭把过夜包被好的酶标记板吸出包被抗原，用预先配制好的PBST洗液洗板3次。再用3％的脱脂好奶粉封闭酶标记板，每孔200μl封闭液。将酶标记板放入湿盒中并于4℃冰箱中孵育过夜。第二天取出酶标记板，倒掉孔内液体，在吸水纸上拍净酶标记板，然后进行后续的步骤。
c.加入一抗小鼠尾静脉采血清样本作为一抗。对血清样本进行10倍的梯度稀释，从第一孔稀释好的样品中吸取一定量的稀释液，加入第二孔，依此梯度稀释加入样品，最后一孔吸出来的液体弃掉。并设立阳性和阴性对照以及空白对照。将加好一抗的酶标记板放在37℃孵箱内孵育2小时。
d.加入二抗取出酶标记板，倒掉孔内液体。用PBST洗板五次，每次放置5min，倒掉孔内液体，在吸水纸上拍干，加入HRP标记的羊抗小鼠二抗。二抗按比例1:8000稀释加入。每孔100μl。把酶标记板放入湿盒中，于37℃孵箱内孵育1小时。
e.显色取出酶标记板，用PBST洗液洗板五次，每次间隔5min，最后在吸水纸上拍干，准备显色液，现配现用，每块酶标记板需要5mlA液，5mlB液(来源于Millipore公司的增强型HRP-DAB底物显色试剂盒)，混匀成为显色液。每孔加入100μl显色液，快加，避光。显色时间为15min，开始加显色液时就开始计时。用计时器计时。
f.终止显色时间到后，迅速用排枪加入2MH2SO4终止液，每孔加100μl。加完终止液后，立即用酶标仪450nm波长读取吸光度值。
g.计算把得到的OD值进行比对，按大于阴性孔平均OD值的2.1倍为参照，得到小鼠血清效价，从而得到效价较高的小鼠数据。
通过免疫小鼠静脉取血测效价，测得DV11及DV14免疫组效价达到制血单克隆抗体的水平，分别达到106的效价。
(4)杂交瘤细胞的制备
a.饲养细胞的制备选取(2)中被免疫并过经(3)检测过的，效价较高的DV11及DV14免疫组的BALB/c小鼠处死，将小鼠浸泡于75％酒精中5min，置于生物安全框的无菌平皿中。用剪刀从剪开小鼠腹部皮肤，注意不要损伤腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取6-8ml的不完全培养基注射到小鼠腹腔中，要注意避免针头刺到腹腔内的脏器。用棉球轻轻按摩腹部1min，吸出注入的培养液。将培养液置于离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清。选取血清效价较高小鼠，脱颈椎处死后，浸泡于75％的酒精中10min，于生物安全框中取出小鼠脾脏，经铜网研磨获得脾细胞，先用PBS洗二次待用。
b.取a中得到的脾细胞10μl，加入血球计数板，在显微镜计数。按1：4(v/v)的比例将SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞进行混合，总体积20ml，混合前骨髓瘤细胞和脾细胞的密度均调节为107个/ml，850rpm离心5min，弃掉上清在37℃水浴中于1分钟内边摇边滴加1ml的50％(v/v)PEG-1400的GKN溶液制备杂交瘤细胞，于2分钟内加入20ml预热至37℃的1640培养基以终止融合，1000r/min离心，去上清，用60ml含10％(v/v)胎牛血清的1640培养基重悬细胞，并每孔100μl加入预先加好饲养细胞的96孔板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(5)单克隆细胞株的筛选
a.(4b)中培养12h后，把含10％(v/v)胎牛血清的1640培养基换成含有HAT的选择培养基，同样条件下培养，每隔2天换一次新的HAT选择培养基，待细胞长至39-41％的时候，把含有HAT的选择培养基换成含有HT的培养基，通过有限稀释法得到了DV11免疫组单克隆细胞64株，DV14免疫组单克隆细胞32株。
b.步骤a中细胞长至40％左右的时候，取细胞上清，用(3)中所描述的方法来检测其分泌抗的效价；在(a)中得到的64株DV11单克隆细胞株，其中18株抗体效价水平符合要求；32株DV14免疫组单克隆细胞株，其中8株抗体效价价水平符合要求。
c.步骤b中检测效价较高的细胞传至24孔板中培养，同样等细胞生长到至70-80％的时候，取细胞上清复测其效价，效价高的细胞进行有限稀释法稀释到细胞浓度为0.1个/ml。然后96孔板中，每孔100μl，37℃，5％的CO2培养五天。
d.待步骤c培养的细胞生长到至70-80％后，在普通显微镜下筛选单克隆细胞孔并标记。把筛选标记好的单克隆细胞孔上清液取100μl，通过ELISA方法来测每个细胞株分泌抗体的效价，筛选出效价高的细胞株，并传至24孔板扩大培养，复测效价，然后扩大至T-25培养，冻存。
(6)腹水的制备与纯化
a.复苏(5)中得到的杂交瘤(单克隆细胞株)，传代培养，同时取上清来检测其分泌的抗体效价。
b.选取6-8周龄的BALB/c小鼠来制备腹水，提前一周用石蜡油来致敏小鼠。第一只接种细胞数可以控制在106，如果出现小鼠腹水不足或者死亡，改变接种的细胞数量。接种后，观察小鼠的腹水生成情况及存活情况，如果有明显的腹水产生即可抽取腹水。一般每次可以收取2-3ml。
采用Millpore公司MontageAntibodypurificationkit纯化抗体试剂盒。纯化的后的抗体于562nm处检测其吸光度。计算出各样品的的蛋白含量。得到了DV11单克隆抗体13株，DV14单克隆抗体8株。
(7)间接免疫荧光检测抗体特异性
选取抗体效价最高抗体株DV11单克隆抗体于分别接种了I-IV型登革病毒的BHK细胞上进行间接免疫荧光试验，结果见图1。
(8)Westernblots检测抗体
为了证明DV11和DV14抗体对NS1识别的特异性，采用重组的I-IV型的NS1蛋白做为Westernblot样本，DV11和DV14作为一抗来检测NS1抗原，证实这二种抗体可以特异性的结合重组蛋白NS1，表明特异性良好，结果见图2。
(9)杂交瘤细胞株稳定性研究
DV11单克隆抗体细胞株和DV14单克隆抗体细胞株在体外连续培养3个月后，以及冻存于液氮罐中半年以上复苏后，均能稳定分泌抗体，其效价未见下降。
实施例2
I-IV型登革病毒非结构蛋白NS1重组蛋白(阳性对照)的克隆表达
(1)I-IV型登革病毒NS1全基因的获取
a.I-IV型登革病毒cDNA的获取复苏四支C6/36细胞于四瓶T25细胞培养瓶中。待细胞长至70％-80％左右时，倒掉含10％(v/v)胎牛血清的1640培养基(GIBICO)，PBS洗2次，每瓶加入5ml的含5％(v/v)胎牛血清的1640培养基，并分别加入1ml的I-IV型的登革病毒病毒原液。让病毒吸附2小时。2小时后，每个细胞培养瓶中补加5ml含5％胎牛血清的1640培养基，于37℃、5％CO2中培养。4-5天左右，在显微镜下观察细胞的病变情况。等细胞病变90％的时候，收取细胞上清，1000rpm离心10min。提取上清液中的病毒RNA。得到RNA后进行反转录反应，反应条件：37℃15min；然后85℃5sec；最后4℃7min。得到I-IV型登革病毒的cDNA，如图3所示，大小正确。
b.I-IV登革病毒非结构蛋白NS1全基因的获取
I-IV型登革病毒非结构蛋白NS1的PCR特异性引物的设计，通过NCBI查找获得上述选取的常用I-IV登革病毒实验株的全基因序列，通过primer引物设计软件分别分析其NS1基因序列上的限制性酶要位点，选取BamHI(GGATCC)和NotI(GCGGCCGC)作为目的基因上的添加序列并将引物合成(表2)，利用a中逆转录好的I-IV型登革病毒cDNA作为模板，经RT-PCR分别获得I-IV型登革病毒NS1的全基因片段，反应条件如表3所示。
表2I-IV型登革病毒NS1引物
表3反转录反应体系
(2)I-IV型登革病毒PMD19T-NS1质粒的构建及鉴定
使用TAKARA公司的pMD19T载体连接试剂合将(1)中得到的全基因片段回收后的I-IV型的登革病毒NS1目的基因与pMD19T载体连接，体系如下：
混合物 体积
NS1目的片段 3μl
缓冲液I(SolutionI) 5μl
pMD19T 1μl
dH2O 1μl
总共 10μl
混合后将反应体系置于16℃，温育2小时。将连接好的PMD19T-NS1质粒分别转到感受态E.coliDH5α中进行扩增。
双酶切鉴定阳性质粒：BamHⅠ-NotⅠ双酶切pMD19T-NS1质粒反应体系：
混合物 体积
10×Buffer 2μl
内切酶BamHⅠ 1μl
内切酶NotⅠ 1μl
pMD19T-NS1质粒 5μl
dH2O 11μl
总共 20μl
混合后将反应体系置于16℃，温育2小时；
配制0.8％的琼脂糖凝胶，放入电泳槽中，将上述的双酶切产物加入上样孔中进行琼脂糖凝胶电泳。电压120V，电泳35min后，取出琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中拍照鉴定阳性克隆(图4)。
(3)I-IV型登革病毒pET30a-NS1质粒的构建及鉴定
将上述鉴定阳性的pMD19T-NS1质粒以及空表达载体pET30a同时经BamHI和NotI进行双酶切。胶回收NS1目的片段与双酶切后的表达载体pET30a质粒片段。步骤按天根的DNA胶回收试剂盒说明书操作。使用NEB公司的T4DNA连接酶将胶回收后的NS1目的片段与表达载体pET30a质粒片段进行连接反应，连接体系如下：
混合后置16℃连接2小时；通过转化进入DH5α感受态中。将转化后的感受态涂于含30mg/mlKANA的LB液体培养基上，37℃培养过夜；取出过夜培养后的平板，挑选单克隆菌落，接种于含30mg/mlKANA的LB液体培养基中，37℃摇床培养12-16小时，取菌液提取质粒。提取的质粒用BamHⅠ-NotⅠ双酶切，然后通过琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定(图5)。
(4)I-IV登革病毒NS1重组蛋白的表达及纯化
I-IV登革病毒NS1重组蛋白的表达：把(3)中构建好的pET30a-NS1质粒转入感受态大肠杆菌BL21后，表达6小时后，将10ml菌液装于50ml离心管中，于4500rpm离心15min，弃掉上清液，将菌体用15ml的PBS重悬充分后，置于冰上于超声破碎仪(SCIENTZJY92-IIN)中超声裂解。功率使用30％，总超声时间1小时，超声10S间隔10S。将超声完全的样品于超速离心机中，8000g离心20min，离心完成后，分别取少量超声后的上清和沉淀(上清和沉淀的量没有具体要求，只要能完成鉴定即可)，并加入30μl蛋白上样缓冲液，煮沸10min，获得上清蛋白样和包涵体蛋白样。通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达是否分泌到菌体外(上清)还是存在于菌中的包涵体内。
含I型重组表达质粒pET30a-NS1的BL21表达0h,2h,4h,6h,8h,10h,12h后的全菌蛋白图如图6所示。
包涵体蛋白的纯化：首先用2M的尿素与含0.1％triton的PBS溶液(v/v)重悬包涵体蛋白15min，然后4000rpm离心15min，弃上清，保留沉淀。然后再用2M的尿素重悬沉淀后，置于4℃过夜；第二天离心过夜后的蛋白样品，同样弃去上清，将沉淀用6M的尿素缓冲液溶解，并将溶解后的蛋白样品装于透析袋中，蛋白总量为5mg，各自分别加入2.5mg置于4M尿素缓冲液，2M尿素缓冲液，上样缓冲液中透析4小时。最后收集透析袋中的蛋白样品，离心取上清；使用AKTA蛋白纯化仪与GE公司的组氨酸蛋白标签纯化柱来纯化蛋白，首选于纯化仪上安装好纯化柱后，先上样平衡缓冲液使蛋白纯化柱平衡。等蛋白基线平稳后将蛋白样上柱。上柱完全后，注入洗脱缓冲液(购买于sigma)，由电脑上观察蛋白峰图。待蛋白基线起峰后，分段收集洗脱的蛋白液；通过SDS-PAGE鉴定收集的蛋白洗脱液，观察纯化后的NS1蛋白在哪个时间段的洗脱液中。对相关的蛋白浓度进行测定，通过SDS-PAGE进行检测(图7)，最后通过Westernblots鉴定重组蛋白(图8)。
(5)I-IV登革病毒重组蛋白NS1免疫原性的检测
动物免疫：18-23g重的雌性小鼠由中国医学科学院医学生物学研究所提供，如表4所示。具体免疫方案如下：将佐剂与抗原乳化后于小鼠皮下多点注射，每次蛋白免疫量为30μg/只，以后每隔10天以弗氏不完全佐剂、铝佐剂与相同的抗原量乳化后免疫小鼠，经4次免疫后，尾动脉采血，间接ELISA法检测抗体效价(如表4和图9所示)。由表4和图9可知，本发明所得到的登革病毒重组蛋白NS1具有很好的免疫原性。
表4.免疫血清中和效价测定结果
免疫组 免疫抗原 效价
对照组 PBS 0
弗氏完全佐剂组 阳性对照重组蛋白+弗氏完全佐剂组 1:(5349±1754)
铝佐剂组 阳性对照重组蛋白+铝佐剂组 1:(3634±1732)
实施例3
登革病毒NS1抗原ELISA检测方法的建立及优化
(1)包被抗体和检测抗体的选择
因前面获得的抗体分别是通过单一的抗原表位免疫小鼠后得到的，其中以DV11株抗体、DV14分别作为包被抗体和检测抗体来确定及组合最佳的包被抗体和检测抗体。通过ELISA结果显示，DV14作为包被抗体，DV11作为生物素化检测抗体为最佳。优于其他配对方式。具体如下：
a.使用购自Thermor公司的生物素来分别连接DV11和DV14这两个抗体，作为检测抗体备用。具体方法如下：把保存于4℃的生物素试剂取出，使其平衡至室温。按照说明书给的计算公式计算抗体所需浓度，用(pH9.6，0.05M)包被缓冲液稀释抗体到2mg/ml浓度。使用DMSO配制10mM的生物素溶液，即将2.0mg的生物素溶于350μl的DMSO中。按说明书的计算要求，在稀释好的抗体蛋白溶液中加入生物素溶液，于冰上孵育抗体生物素混合溶液2小时，或者室温30min进行连接。使用购自Thermo公司的生物素抗体脱盐柱，对上步反应后的溶液进行脱盐处理，除去没有结合的抗体和生物素。
b.然后分别用DV11、DV14、DV11+DV14混合抗体包被96孔板。再分别将与生物素连接的DV11和DV14作为检测抗体来检测。通过初步ELISA试验来确定最佳包被抗体以及生物素检测抗体。通过方阵试验得出最佳包被抗体包被浓度为2.5μg/mL。最佳检测抗体(DV11)的使用时与溶剂按照体积比为1:3000进行配制后进行检测，该溶剂为PBS(检测抗体母液浓度为1μg/μl；检测抗体母液溶剂：PBS)。而所用的显色底物中的酶标亲和素抗体在使用时，将酶标亲和素抗体与溶剂按照体积比为1:2000进行配制后进行检测，该溶剂为包被缓冲液；部分结果见图10、图11以及图12所示。
(2)双抗夹心检测方法的建立
采用最佳包被抗体包被96孔酶标记板，以重组表达的四个型别的NS1作为待测样本，以最佳浓度的生物素化检测抗体DV11作为检测抗体，阳性对照重组蛋白以及TMB做为显色底物来检测阳性对照中的四种型别的NS1重组蛋白，初步建立NS1双抗夹心检测方法(DV)。
(3)变异系数以及稳定性的初步检测
参照国家药典规定，通过(2)所建立的双抗夹心检测方法，分批次做平行试验，每批次同一种样品做十次重复来确定CV值。同样参照国家药典，做稳定性试验检测，将检测体系中的各组份置于37℃一周，再与正常条件下的检测体进行稳定性比较，应用SPSS16软件进行统计学分析上述建立的ELISA方法检测登革病毒NS1抗原的稳定性，各组间比较采用单因素方差分析其稳定性，两组间比较采用独立样本t检验法，以P>0.05为没有差异，表示没有统计学意义。以P<0.05表示有差异，有统计学意义。最终初步建立登革病毒NS1抗原的ELISA检测方法。结果得出CV值在4％-5％左右。通过稳定性的检测，得到不同组别间T检验，分别为0.495，0.492，0.496，得到P值都大于0.05，没有显著的明显差异，结果见图13。
(4)最低抗原检出下限的测定
通过上述建立的ELISA检测方法，分别检测不同浓度的抗原样品。通过阴性孔的OD值与样品的OD值比较得出最低的抗原检出下限为2.5ng，结果见图14所示。
(5)特异性检测
利用建立好的ELISA方法来检测乙脑病毒感染细胞后上清液体。结果发现该检测体系的抗体并不会与乙脑病毒的非结构蛋白NS1发生交叉反应，说明其有很好的检测特异性。
实施例4试剂盒的使用方法
利用2013年从云南省西双版纳收集的登革病毒血清为样本，根据病人知情同意后，参考他们的临床资料从中筛选出20份登革病毒感染的急性期的血清。阳性对照重组蛋白为四种型别的NS1重组蛋白，而阴性对照血清为没有感染登革热病毒的正常人的血清。
参照实施例3所确定的包被抗体的最佳包板浓度包被好酶标记板后，分别直接加入10倍稀释的待测血清，阳性对照以及阴性对照，放在37℃孵箱内孵育2小时；取出酶标记板，倒掉孔内液体。用PBST洗板五次，每次放置5min，倒掉孔内液体，在吸水纸上拍干，加入100μl/孔的检测抗体即连接了生物素的DV11抗体。把酶标记板放入湿盒中，于37℃孵箱内孵育2小时后。用PBST洗液洗板3次每次间隔5min，最后在吸水纸上拍干。每孔加入100μl的酶标亲和素抗体(HRP标记亲和素抗鼠二抗)，于37℃孵箱内孵育1小时后。
取出酶标记板，用PBST洗液洗板五次，每次间隔5min，最后在吸水纸上拍干。每孔加入100μlTMB显色液，快加，避光。显色时间为15min。
显色时间到后，迅速用排枪加入2M硫酸终止液，每孔加100μl。加完终止液后，立即用酶标仪450nm波长读取吸光度值。
读取吸光度值后，看吸光度值大于阴性孔平均OD值的2.1倍的则为阳性。
采用本发明试剂盒进行检测，所测的感染了登革病毒的血清均为阳性，而正常人的血清则为阴性。而且本发明从感染的第三天就能检测出来，便于提早防治。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQIDNo.1
GlySerSerGlyProSerLeuArgThrThrThr
SEQIDNo.2
GlySerSerHisThrTrpThrGluGlnTyrLysPhe
SEQIDNo.3
GGATCCGACTCGGGATGTGTAATCAACT
SEQIDNo.4
GCGGCCGCTGCAGAGACCATTGACTTAACTAGG
SEQIDNo.5
GGATCCGATAGTGGTTGCGTTGTGAGCTGG
SEQIDNo.6
GCGGCCGCAGCTGTGACCAAGGAGTTGACC
SEQIDNo.7
GGATCCGACATGGGGTGTGTCATAAACT
SEQIDNo.8
GCGGCCGCCGCTGAGACTAAAGACTTTACCATG
SEQIDNo.9
GGATCCGACATGGGTTGTGTGGCGTCATGGA
SEQIDNo.10
GCGGCCGCGGCCGTCACCTGTGATTTGACCA

Claims (8)

1.一种I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，其特征在于，包括酶标记板、阴性对照血清、阳性对照重组蛋白、检测抗体、显色底物和终止液；
所述酶标记板上的包被抗体为DV14抗体，所述的DV14抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；
所述的阴性对照血清为没有感染登革热病毒的正常人的血清；
所述的阳性对照重组蛋白包括四种型别的NS1重组蛋白；
所述的四种型别的NS1重组蛋白的制备方法均是将登革病毒标准株经RT-PCR扩增后，与pMD19T载体连接，连接产物与pET30a经BamHI和NotI双酶切后，胶回收，T4DNA连接酶连接回收产物，然后再转到大肠杆菌BL-21中，通过表达纯化，得到相应型别的NS1重组蛋白；
所述的登革病毒标准株包括I-IV型登革病毒标准株；
所述的检测抗体为连接了生物素的DV11抗体，所述的DV11抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.2；
所述的显色底物包括酶标亲和素抗体和TMB显色液；所述的酶标亲和素抗体为HRP标记的羊抗小鼠二抗；
所述的终止液为2M的硫酸。
2.根据权利要求1所述的I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，其特征在于，所述的DV14抗体的制备方法为：将如SEQIDNo.1的氨基酸序列编码的多肽DV14与牛血清蛋白连接后免疫小鼠所得的单克隆抗体。
3.根据权利权利要求2所述的I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，其特征在于，所述的DV14抗体的制备方法为：将多肽DV14与牛血清蛋白连接后，得到DV14-BSA抗原；
用生理盐水将DV14-BSA稀释并与弗氏完全佐剂乳化，至乳化液中DV14-BSA的浓度为1μg/μl，然后将乳化液于小鼠皮下多点注射，选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，以每只小鼠免疫100μl的的乳化液来免疫，每只小鼠免疫的抗原量为100μg；然后分别在第21天、第35天、第49天后用相同的办法进行第二次、第三次以及第四次免疫；经四次免疫过后，取小鼠脾细胞，按1：4（v/v）的比例将SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞进行混合，总体积20ml，混合前骨髓瘤细胞和脾细胞的密度均调节为107个/ml，850rpm离心5min，弃掉上清，然后在37℃水浴中于1分钟内边摇边滴加1ml的50%（v/v）PEG-1400的GKN溶液，滴加完后于2分钟内再加入20ml预热至37℃的1640培养基以终止融合，1000r/min离心，去上清，用60ml含10%（v/v）胎牛血清的1640培养基重悬细胞，并每孔100μl加入预先加好饲养细胞的96孔板中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，12h后，把含10%（v/v）胎牛血清的1640培养基换成含有HAT的选择培养基，同样条件下培养，每隔2天换一次新的HAT选择培养基，待细胞长至39-41%的时候，把含有HAT的选择培养基换成含有HT的培养基，通过有限稀释法得到了DV14单克隆细胞株；
选取6-8周龄的BALB/c小鼠提前一周用石蜡油来致敏小鼠，注射2ml的106个/ml的DV14单克隆细胞株来制备腹水，最后采用Millpore公司MontageAntibodypurificationkit试剂盒来纯化腹水，得到包被抗体DV14。
4.根据权利权利要求2所述的I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记板的制备方法是：将所述的包被抗体DV14用包被缓冲液稀释到2.5μg/ml后，按100μl/孔包被到酶标记板的微孔内，在4℃条件下，将酶标记板置于湿盒中反应24小时后，用PBST洗板，每孔PBST用量为0.25ml，在4℃下，按每孔200μl放入3%（m/v）的脱脂奶粉封闭酶标记板，封闭24小时后，弃除多余的封闭液，置4℃保存，即得到酶标记板；
所述的包被缓冲液的pH为9.6，每1000ml包被缓冲液中含Na2CO31.59g、NaHCO32.93g；
所述的PBST为含有0.05%（v/v）吐温20的磷酸缓冲液；
所述的3%（m/v）的脱脂奶粉为以PBST为溶剂，以脱脂奶粉为溶质配成的溶液。
5.根据权利要求1所述的I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照NS1重组蛋白的制备方法为：
①将登革病毒标准株进行RT-PCR扩增，得到NS1全基因；
②将NS1全基因与pMD19T载体连接，制备PMD19T-NS1质粒；
③将pMD19T-NS1质粒以及空表达载体pET30a同时采用BamHI和NotI进行双酶切，胶回收NS1目的片段与双酶切后的表达载体pET30a质粒片段，然后采用T4DNA连接酶将胶回收的NS1目的片段与表达载体pET30a质粒片段进行连接，得到pET30a-NS1质粒；
④将pET30a-NS1质粒到大肠杆菌BL-21中，然后通过表达纯化，得到NS1重组蛋白；
所述的登革病毒标准株为I型登革病毒标准株DV1Ag.st、Ⅱ型登革病毒标准株DV216681、Ⅲ型登革病毒标准株DV3H87和IV型登革病毒标准株DV4H241；
所述的RT-PCR扩增时，I型登革病毒标准株DV1Ag.st的扩增引物为：
F：5'-GGATCCGACTCGGGATGTGTAATCAACT-3'（SEQIDNo.3）；
R：5'-GCGGCCGCTGCAGAGACCATTGACTTAACTAGG-3'（SEQIDNo.4）
Ⅱ型登革病毒标准株DV216681的扩增引物为：
F：5'-GGATCCGATAGTGGTTGCGTTGTGAGCTGG-3'（SEQIDNo.5）；
R：5'-GCGGCCGCAGCTGTGACCAAGGAGTTGACC-3'（SEQIDNo.6）；
Ⅲ型登革病毒标准株DV3H87的扩增引物为：
F：5'-GGATCCGACATGGGGTGTGTCATAAACT-3'（SEQIDNo.7）；
R：5'-GCGGCCGCCGCTGAGACTAAAGACTTTACCATG-3'（SEQIDNo.8）；
IV型登革病毒标准株DV4H241的扩增引物为：
F：5'-GGATCCGACATGGGTTGTGTGGCGTCATGGA-3'（SEQIDNo.9）；
R：5'-GCGGCCGCGGCCGTCACCTGTGATTTGACCA-3'（SEQIDNo.10）。
6.根据权利要求1所述的I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，其特征在于，所述的检测抗体的制备方法为将生物素与DV11抗体连接所得的抗体，即为检测抗体；
检测抗体在进行检测时，将检测抗体与溶剂按照体积比为1:3000进行配制后进行检测，该溶剂为PBS；
而所用的显色底物中的酶标亲和素抗体在使用时，将酶标亲和素抗体与溶剂按照体积比为1:2000进行配制后进行检测，该溶剂为包被缓冲液；
所述的DV11抗体的制备方法是将如SEQIDNo.2的氨基酸序列编码的多肽DV11与牛血清蛋白连接后免疫小鼠所得的单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，其特征在于，所述的DV11抗体的制备方法是：将多肽DV11与牛血清蛋白连接后，得到DV14-BSA抗原；
用生理盐水将DV11-BSA稀释并与弗氏完全佐剂乳化，至乳化液中DV11-BSA的浓度为1μg/μl，然后将乳化液于小鼠皮下多点注射，选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，以每只小鼠免疫100μl的的乳化液来免疫，每只小鼠免疫的抗原量为100μg；然后分别在第21天、第35天、第49天后用相同的办法进行第二次、第三次以及第四次免疫；经四次免疫过后，取小鼠脾细胞，按1：4（v/v）的比例将SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞进行混合，总体积20ml，混合前骨髓瘤细胞和脾细胞的密度均调节为107个/ml，850rpm离心5min，弃掉上清在37℃水浴中于1分钟内边摇边滴加1ml的50%（v/v）PEG-1400的GKN溶液，于2分钟内加入20ml预热至37℃的1640培养基以终止融合，1000r/min离心，去上清，用60ml含10%（v/v）胎牛血清的1640培养基重悬细胞，并每孔100μl加入预先加好饲养细胞的96孔板中，于37℃、5%CO2培养箱中培养12h后，把含10%（v/v）胎牛血清的1640培养基换成含有HAT的选择培养基，同样条件下培养；待细胞长至39-41%的时候，把含有HAT的选择培养基换成含有HT的培养基，通过有限稀释法得到了DV11单克隆细胞株；
选取6-8周龄的BALB/c小鼠提前一周用石蜡油来致敏小鼠，注射2ml的106个/ml的DV11单克隆细胞株来制备腹水，最后采用Millpore公司MontageAntibodypurificationkit试剂盒来纯化腹水，得到包被抗体DV14。
8.根据权利要求1所述的I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标记板为96孔板。
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