CN101308137A

CN101308137A - 登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒

Info

Publication number: CN101308137A
Application number: CNA2007100280036A
Authority: CN
Inventors: 江立敏; 周惠琼; 郑夔; 柯昌文
Original assignee: GUANGDONG PROV DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRE
Current assignee: GUANGDONG PROV DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRE
Priority date: 2007-05-15
Filing date: 2007-05-15
Publication date: 2008-11-19
Anticipated expiration: 2027-05-15
Also published as: CN101308137B

Abstract

本发明涉及一种登革病毒抗体酶联免疫诊断试剂盒。本发明所述的试剂盒包括酶标记板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标记物、样品稀释液、浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、封板胶，所述酶标记物包含羊抗人IgG－HRP；所述酶标记板上的包被抗原包括：氨基酸序列为SEQ ID No.1的重组1型登革病毒包膜蛋白特异性抗原；氨基酸序列为SEQID No.3的重组2型登革病毒包膜蛋白特异性抗原；氨基酸序列为SEQ ID No.5的重组3型登革病毒包膜蛋白特异性抗原；氨基酸序列为SEQ ID No.7的重组4型登革病毒包膜蛋白特异性抗原。通过检测血清中登革病毒IgG抗体，可对二次或以上多次感染登革热的病人进行早期诊断和对健康人群的血清流行病学调查。并可对初次感染登革热的病人进行最后确诊。

Description

登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种酶联免疫诊断试剂盒，尤其是涉及一种登革病毒抗体酶联免疫诊断试剂盒。

背景技术

登革热(Dengue Fever，DF)是由4个血清型登革病毒(Dengue Virus，DV)引起的急性蚊媒传染病，主要通过埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播。登革病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(Flavivirus)。DF是分布最广，发病最多，危害较大的一种虫媒病毒性疾病，广泛流行于全球热带和亚热带的非洲、美洲、东南亚和西太平洋区的100多个国家和地区。据WHO估计全球约有25亿人口的健康受到威胁，每年有5000万人感染登革病毒。随着全球气候变暖日趋严重，登革热地理分布上有蔓延的趋势，发病率和疫情的严重程度也有所增加，登革热已成为全球性的严重公共卫生问题。

登革热在我国经过了30多年静止期后，1978年广东佛山突然发生流行，自此，登革热一直是广东省重点防治的传染病。登革热疫情来势急，扩散快，不容易控制，对人民的生命健康产生巨大威胁、对地方经济发展产生极大影响，因而成为一项重大的公共卫生问题。登革热疑似病例的尽快确诊可帮助及早发现疫情，尽快采取措施，在最小范围控制疫情，因而把损失减到最少。目前我国对登革热的实验室诊断主要依靠进口的酶联免疫试剂，其价格昂贵，在基层医院及市、县级疾控中心难于普及，另外，进口试剂采购到货时间长，实验室有时未能及时拿到试剂，而延误诊断。首发病人往往由于误诊，没有及时采取有效措施，而导致登革热疫情蔓延。每宗疫情在其发现时已陷入十分紧张和被动的局面，进而花费巨大的人力物力去控制。因此，开发出简便、快速、经济、适宜于基层单位推广使用的登革热诊断试剂成为登革热疫情控制中急需解决的难题。

人感染了登革病毒后，一般经过3～10天(通常4～5天)的潜伏期后，受感染者会出现以发热、疼痛为主要症状的登革热，同时，机体的免疫系统会产生一系列的免疫应答反应，初次感染登革病毒，机体产生抗体的速度较慢，滴度也较低，IgM为最初应答的抗体。IgG在发病的第一周末才出现，滴度很低，上升速度也慢。根据泛美卫生组织标准，到发病的第五天，80％可查到检测水平的IgM，发病的第6-10天，93-99％可查到检测水平的IgM，IgM可持续存在90天以上。二次感染登革病毒的病人，由于IgM抗体远低于初次感染产生的抗体水平，约有20～30％的病人在二次感染登革病毒后的第10天未能检测到IgM抗体；而IgG抗体发病后1～2天可迅速上升到远远高于初次感染产生抗体的水平，故可以通过检测登革病毒IgG抗体对二次感染登革的病人进行诊断，并根据抗体滴度高低对近期感染或继往感染进行判断，IgG抗体可以终生维持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒，通过检测血清中登革病毒IgG抗体，可对二次或以上多次感染登革热的病人进行早期诊断和对健康人群的血清流行病学调查，并可对初次感染登革热的病人进行最后确诊(双份血清特异性IgG抗体出现4倍或超过4倍的增长)。

本发明所述的一种登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒，包括酶标记板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标记物、样品稀释液、浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、封板胶，所述酶标记物包含羊抗人IgG-HRP，即羊抗人IgG-辣根过氧化物酶；所述酶标记板上的包被抗原为基因工程重组表达的登革病毒包膜蛋白特异性抗原，所述抗原包括：氨基酸序列为SEQ ID No.1的重组1型登革病毒包膜蛋白特异性抗原；氨基酸序列为SEQ IDNo.3的重组2型登革病毒包膜蛋白特异性抗原；氨基酸序列为SEQ ID No.5的重组3型登革病毒包膜蛋白特异性抗原；氨基酸序列为SEQ ID No.7的重组4型登革病毒包膜蛋白特异性抗原。

所述重组1型登革病毒包膜蛋白特异性抗原是由SEQ ID No.2的DNA序列所编码的；所述重组2型登革病毒包膜蛋白特异性抗原是由SEQ ID No.4的DNA序列所编码的；所述重组3型登革病毒包膜蛋白特异性抗原是由SEQ ID No.6的DNA序列所编码的；所述重组4型登革病毒包膜蛋白特异性抗原是由SEQ ID No.8的DNA序列所编码的。

所述的阳性对照血清是在含20％山羊血清和0.02％叠氮钠的10mM的pH7.4的PBS中，加入确定浓度的阳性血清制成，阳性对照的A值应大于1.5；阴性对照血清是在含20％山羊血清和0.02％叠氮钠的10mM的pH7.4的PBS中，按5％的比例加入混合好的阴性血清制成，阴性对照的A值应小于0.1。

所述酶标记板的制备方法是：将所述的基因工程重组表达的登革病毒包膜蛋白特异性抗原按确定的浓度用0.05M的pH9.6的CP即碳酸盐缓冲液稀释后，按0.1ml/孔包被到微孔板内，在2℃～8℃吸附24～26小时后，用10mM PBST即吐温磷酸缓冲液按0.25ml/孔洗板，再用封闭液按0.15ml/孔在2℃～8℃封闭18～20小时，弃除多余的封闭液，经真空干燥处理后用铝膜袋密封，置2～8℃保存。

所述的封闭液的组成为：含20％山羊血清和0.02％叠氮钠的pH7.4的10mM磷酸缓冲液即PBS。

所述的酶标记物是用酶标稀释液按工作浓度配制的羊抗人IgG-HRP工作液，所述的酶标稀释液的组成为：pH7.4的10mM PBS即磷酸缓冲液，其中含10％山羊血清、0.2％吐温-20和0.02％叠氮钠。

登革病毒为单股正链RNA病毒，长度约为11Kb，编码3400个氨基酸，分子量为4200KDa。基因组含有一个长的开放读码框架，编码病毒的全部蛋白：包括3种结构蛋白和7个非结构(NS)蛋白。其中E结构蛋白是一种包膜糖蛋白，亚群特异和型特异的抗原决定簇及中和、血凝抑制作用的主要抗原表位均位于包膜蛋白E上，因此E结构蛋白对病原诊断具有重要意义。

本发明所述的登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒采用重组登革病毒1-4型E蛋白B区的型特异性抗原(约120个氨基酸)，避免与黄热病毒、乙型脑炎病毒抗原产生交叉反应。国外商品化登革病毒抗体酶联免疫诊断试剂多采用纯化的全病毒抗原，这些试剂缺点是本底高，与黄病毒科病毒存在交叉反应，最常见者为乙型脑炎病毒与黄热病毒。本发明研制的试剂盒克服了国外试剂的缺点。

与国内外同类产品比较

在国内尚无检测登革病毒抗体的酶免试剂。在国外，常用的登革热酶联免疫诊断试剂全部采用细胞培养后纯化的全病毒抗原。如目前唯一获得美国FDA批准文号的澳大利亚PanBio公司生产的Dengue IgG ELISA诊断试剂盒，其不足在于本底高，因而需要借助酶标比色仪检测，阈值(cut-off值)为0.4-0.65，与黄病毒科病毒如乙型脑炎病毒存在交叉反应。本发明制备的登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂是间接法IgG-ELISA，方法简便、易操作，灵敏性高，与黄热病毒、乙型脑炎病毒抗原不产生交叉反应。

本发明的研究成果填补了我国登革热诊断试剂的空白，为我国登革热的临床诊断、血清学监测和流行病学调查提供了新的技术手段，具有广泛的推广应用前景。

附图说明

图1为表达质粒的构建示意图。

图2为登革重组抗原纯化过程SDS-PAGE蛋白电泳图谱；1：蛋白标准P7708V；2：超声后离心的上清；3：亲和层析纯化的蛋白；4：阳离子交换纯化的蛋白；5：分子筛纯化的蛋白。

图3为重组蛋白Western Blot鉴定结果；M：蛋白质marker P7708V；1-3：WB反应带；4：阴性对照。

具体实施方式

实施例一：登革抗原的克隆、表达和纯化

(一)材料

1.标准毒株：登革1型(Hawaii株)，简称D1；登革2型(NGC株)，简称D2；登革3型(H87株)，简称D3；登革4型(H241株)，简称D4；购自中国药品生物制品检定所，由广东省疾病预防控制中心保存。

2.质粒：克隆载体BM13质粒购自TaKaRa公司，表达质粒pET22b(+)是Novagen产品。由广东省疾病预防控制中心微生物检验所保存。

3.菌株：受体菌E.coli TOP10F′和表达用的大肠杆菌BL21 Star^TM(DE3)购自Invitrogen公司，由广东省疾病预防控制中心微生物检验所保存。

4.酶类：限制性内切酶、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和dNTP分别购自New-England、Invitrogen、BOEHRINGER MANNHEIM以及大连宝生物工程有限公司等。

5.其它试剂：Yeast Extract(酵母粉)、TRYPTONE(蛋白胨)和IPTG诱导剂是BBI产品，购自上海生物工程有限公司。

(二)方法

1.病毒RNA的提取及cDNA合成

采用QIAGEN公司QIAamp Viral RNA mini Kit。按试剂盒要求，提取病毒RNA，以随机引物逆转录合成cDNA。

2.PCR扩增基因

参照上述登革病毒1-4型毒株的包膜蛋白基因序列(来自Genbank)，设计引物，在引物的5’端加上EcoRI酶切位点，在引物的3’端加上XhoI酶切位点，以利于克隆入表达载体。

针对登革1型包膜蛋白基因的引物为：

D1E-F：5’-GGAGGAATTCAAAATGGACAAACTGACTCT-3’

D1E-R：5’-CCCACCTCGAGACGACGTGCACCACGGGCAGTCGC-3’

针对登革2型包膜蛋白基因的引物为：

D2E-F：5’-GGAGGAATTCCGTATGGACAAACTACAGCT-3’

D2E-R：5’-CCCACCTCGAGACGCTTCGCACCACGCATTGTTGT-3’

针对登革3型包膜蛋白基因的引物为：

D3E-F：5’-GGAGGAATTCAAGATGGACAAATTGAAACT-3’

D3E-R：5’-CCCACCTCGAGACGACGTGCACCACGGGCAGTGGC-3’

针对登革4型包膜蛋白基因的引物为：

D4E-F：5’-GGAGGAATTCCGTATGGAGAAATTGCGTATTAAGG-3’

D4E-F：5’-CCCACCTCGAGACGCTTTGCGCCACGGTATGTGGA-3’

循环程序为：用Invitrogen高保真酶，95℃15分钟热起动，94℃变性15s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共22个循环，68℃再作用5min，冷却至4℃。

3.PCR片段的纯化与回收

采用QIAGEN Gel Extraction Kit纯化PCR片段。

4.基因的克隆

基本操作参照《Molecular Cloning》(Sambrook et al.，1989)进行。包括酶切和连接；质粒DNA的转化、重组质粒的筛选及重组质粒的鉴定。克隆的基因片段经序列测定确认。将纯化的PCR片段先克隆在BM13质粒上测片段核苷酸序列，重组表达登革1-4型包膜蛋白抗原(E)分别表示为D1E-D4E，其中，D1E-D3E序列为372个核苷酸，编码124个氨基酸，D4E序列369个核苷酸，编码123个氨基酸，具体序列如下：

D1E的核苷酸及氨基酸序列(372个核苷酸，编码124个氨基酸)

核苷酸序列(SEQ ID No.2)

AAAATGGACAAACTGACTCTAAAAGGGATGTCATATGTTATGTGCACAGGCTCATTCAAGCTAGAGAAAGAAGTGGCTGA

GACCCAACATGGAACCGTTCTAGTGCAGATTAAATACGAAGGAACAGATGCACCATGCAAGATCCCTTTTTCGACCCAAG

ATGAAAGAGGAGTAACCCAGAACGGGAGATTAATAACAGCCAACCCTATAGTTACTGACAAAGAAAAACCAGTCAACATT

GAGGCAGAACCACCTTTTGGTGAGAGTTACATCGTGATAGGAGCAGGTGAAAAAGCTTTGAAACTAAGTTGGTTCAAGAA

AGGAAGCAGCATAGGGAAAATGTTTGAGGCGACTGCCCGTGGTGCACGTCGT

氨基酸序列(SEQ ID No.1)

KMDKLTLKGMSYVMCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQIKYEGTDAPCKIPFSTQDERGVTQNGRLITANPIVTDKEKPVNI

EAEPPFGESYIVIGAGEKALKLSWFKKGSSIGKMFEATARGARR

D2E的核苷酸及氨基酸序列(372个核苷酸，编码124个氨基酸)

核苷酸序列(SEQ ID No.4)

CGTATGGACAAACTACAGCTCAAAGGAATGTCATACTCTATGTGCACAGGAAAGTTTAAAGTTGTGAAGGAAATAGCAGA

AACACAACATGGAACAATAGTTATCAGAGTACAATATGAAGGGGACGGTTCTCCATGTAAGATCCCTTTTGAGATAATGG

ATTTGGAAAAAAGACATGTTTTAGGTCGCCTGATTACAGTCAACCCAATCGTAACAGAAAAAGATAGCCCAGTCAACATA

GAAGCAGAACCTCCATTCGGAGACAGCTACATCATCATAGGAGTAGAGCCGGGACAATTGAAGCTCAACTGGTTTAAGAA

AGGAAGTTCTATCGGCCAAATGATTGAGACAACAATGCGTGGTGCGAAGCGT

氨基酸序列(SEQ ID No.3)

RMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNI

EAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMIETTMRGAKR

D3E的核苷酸及氨基酸序列(372个核苷酸，编码124个氨基酸)

核苷酸序列(SEQ ID No.6)

AAGATGGACAAATTGAAACTCAAGGGGATGAGCTATGCAATGTGCTTGAATACCTTTGTGTTGAAGAAAGAAGTCTCCGA

AACGCAGCATGGGACAATACTCATTAAGGTTGAGTACAAAGGGGAAGATGCACCCTGCAAGATTCCTTTCTCCACGGAGG

ATGGACAAGGGAAAGCTCACAATGGCAGACTGATCACAGCCAATCCAGTGGTGACCAAGAAGGAGGAGCCTGTCAACATT

GAGGCTGAACCTCCTTTTGGGGAAAGTAATATAGTAATTGGAATTGGAGACAAAGCCCTGAAAATCAACTGGTACAGGAA

GGGAAGCTCGATTGGGAAGATGTTCGAGGCCACTGCCCGTGGTGCACGTCGT

氨基酸序列(SEQ ID No.5)

KMDKLKLKGMSYAMCLNTFVLKKEVSETQHGTILIKVEYKGEDAPCKIPFSTEDGQGKAHNGRLITANPVVTKKEEPVNI

EAEPPFGESNIVIGIGDKALKINWYRKGSSIGKMFEATARGARR

D4E的核苷酸及氨基酸序列(369个核苷酸，编码123个氨基酸)

核苷酸序列(SEQ ID No.8)

CGTATGGAGAAATTGCGTATTAAGGGAATGTCATACACGATGTGCTCAGGAAAGTTCTCAATTGACAAAGAGATGGCAGA

AACACAGCATGGGACAACAGTGGTAAAAGTCAAGTATGAGGGTGCTGGAGCTCCATGTAAAGTTCCCATAGAGATAAGAG

ATGTGAACAAGGAAAAAGTGGTAGGGCGTATCATCTCACCTACCCCTTTTGCTGAGAATACCAACAGTGTAACCAACATA

GAATTAGAACGCCCTTTGGACAGCTACATAGTAATAGGTGTTGGAGACAGCGCATTAACACTCCATTGGTTCAGGAAAGG

GAGTTCCATTGGCAAGATGTTTGAGTCCACATACCGTGGCGCAAAGCGT

氨基酸序列(SEQ ID No.7)

RMEKLRIKGMSYTMCSGKFSIDKEMAETQHGTTVVKVKYEGAGAPCKVPIEIRDVNKEKVVGRIISPTPFAENTNSVTNI

ELERPLDSYIVIGVGDSALTLHWFRKGSSIGKMFESTYRGAKR

5.表达质粒的构建

选择D1E、D2E、D3E和D4E测序结果正确的质粒和载体pET22b(+)质粒进行酶切，回收酶切产物，将经纯化的酶切片段和载体于16℃连接2小时。表达质粒的构建示意图见图1。

6.转化感受态细胞

迅速将20μl连接产物加至感受态细胞中，冰浴30min；然后42℃2min，加1ml LB培养基；37℃水浴1hr并不时摇动；然后将600μl培养基用玻璃棒分别涂布在含120μg/ml氨苄青霉素LB平板上；平板干燥后37℃倒置过夜。

7.DNA提取

从平板上挑取重组子至2ml含120μg/ml氨苄青霉素LB培养基摇床过夜培养；用QIAprep Spin miniprep Kit提取质粒DNA，用PCR和酶切鉴定片段的大小是否正确。

8.接种及培养

用登革病毒1-4型重组质粒转化大肠杆菌BL21 Star^TM(DE3)，各挑取单一菌落接种到20ml含120μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振摇至第二天上午8:30。各取8ml种子液，加200ml含120μg/ml氨苄青霉素LB培养液，37℃180转快摇至OD600为0.6左右，加IPTG至100μg/ml(IPTG浓度可以优化)，同时再补充一次新的氨苄青霉素至120μg/ml(两次共为240μg/ml)，继续震摇培养3-5小时，收集菌体。

大量发酵时，用上述方法等量发酵1-4型菌液，将菌液混合，超声后离心收集上清，混合蛋白经亲和层析，透析，阳离子交换和凝胶过滤等多步骤纯化。

9、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

将1-4型表达产物超声后离心的上清，亲和层析、阳离子交换和分子筛纯化收集的蛋白，走SDS-PAGE蛋白电泳。电泳图谱见图2。图2中，1：蛋白标准P7708V；2：超声后离心的上清；3：亲和层析纯化的蛋白；4：阳离子交换纯化的蛋白；5：分子筛纯化的蛋白。经过多步纯化，最后已看不出有杂带。最终得到目的蛋白大小约为16KDa。

10、抗原活性的初步鉴定

Westem Blot(WB)实验：将重组蛋白稀释进行SDS-PAGE电泳，凝胶转NC膜，膜切成四条，取三条与登革病毒阳性血清反应，结果重组蛋白与阳性血清呈特异性反应，在约16×103处可见WB反应带，与SDS-PAGE重组蛋白带大小一致，健康人血清没有反应，WB实验图谱见图3。图3中，M：蛋白质marker P7708V；1-3：WB反应带；4：阴性对照。

实施例二：重组抗原对登革病毒IgG抗体反应活性的测定

用间接ELISA方法对纯化提取蛋白进行血清学检测，以确定其对登革病毒抗体阳性血清的反应性。

将实施例一所得的抗原按1∶500、1∶1000、1∶2000稀释后包被ELISA板，与登革阳性血清反应，确定包被抗原浓度。登革抗原的免疫活性达1∶1000。

重组抗原按选定浓度包被，用间接法ELISA检测登革热病人血清IgG抗体，测定重组抗原对登革病毒IgG抗体的反应活性。

1.重组抗原对2004年中山登革热疫情血清样本的反应活性

1-4型E蛋白重组抗原按选定浓度包被，用间接法ELISA检测2004年中山急性期、恢复期登革病人血清IgG抗体，30份急性期血清(发病时间3-13天)有7份阳性(OD值＞0.2判为阳性，有2例病人发病8天即可检测到IgG抗体)，17份阴性；这30份血清登革病毒IgM抗体检测结果也是阳性。28份恢复期血清IgG抗体全部阳性，13份病后37-60天采的恢复期血清的IgG抗体水平最高，15份病后59-86天采的恢复期血清IgG抗体水平略有下降，但仍维持在较高的水平。28份恢复期血清OD值明显高于急性期血清，有21份OD值呈4倍以上增长，说明重组抗原能检测出病人体内IgG抗体水平和变化情况，对中山登革病人恢复期血清IgG抗体检出率达100％，无一漏检。恢复期血清用澳大利亚PanBio登革试剂(Dengue IgG Capture ELISA)复查，结果也是阳性。说明1-4型E蛋白重组抗原对登革IgG抗体有良好的反应性，21例病人急性期、恢复期血清登革IgG抗体检测结果见表1。

表121例病人急性期、恢复期血清登革IgG抗体检测结果

2.广东省及各地级市CDC登革IgG抗体检测结果

将实施例一所得的重组抗原制备成登革病毒IgG抗体检测试剂盒(以下称自研试剂盒)，分发给全省各市级CDC(疾病预防控制中心)试用，共检测了4288份血清，检出299份阳性，在曾流行过登革热的疫区，可检出登革病毒IgG抗体阳性血清；广东省CDC检测了1675份血清(血清来源于虫媒病毒血清库，包括登革病人和登革监测血清)登革病毒IgG抗体，检出154份阳性，阳性率9.19％，从154份登革病毒IgG阳性血清中选出100份，用澳大利亚Panbio登革IgG试剂检测，只有2份结果呈现阴性，98份阳性，符合率98％；广州市和中山市CDC检测了360份血清(多数是登革热病人急性期血清)，各检出40份阳性，阳性率22.22％，其它市多数采用的是正常人群监测血清，阳性率都很低，清远和梅州未出现过登革疫情，此2地区血清检测结果全部阴性。深圳CDC检测的阳性标本用进口试剂澳大利亚PanBio登革试剂(Dengue IgG Capture ELISA)比对结果也是阳性。说明重组抗原具有较好的特异性，结果见表2。

表2广东省和各地级市CDC登革IgG抗体检测结果

3对其它虫媒病毒阳性血清的检测

用自研试剂盒检测41份(包括深圳市CDC 17份)乙脑IgG抗体阳性血清，结果全部阴性。证明重组抗原与乙脑IgG抗体无交叉反应，具良好的特异性。

上述结果表明，表达的抗原对登革IgG血清的反应良好。可用于研制登革病毒IgG抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)。

4、对试剂的稳定性能检测

将自研试剂盒的抗原板放入37℃温箱，考核6天，检测其对热环境下的活性。检测项包括阴、阳性血清，厂内临界质控血清，其结果与4℃条件下保存的抗原板所检测的结果比较，抗原活性下降未超过25％。

5.干扰检测

-用自研试剂盒检测高血酯、高胆红素、高血红蛋白、黄疸和抗凝剂处理(EDTA、枸橼酸钠)的血浆样本，检测结果全部为阴性。说明这些血清对Dengue IgG的检测无明显干扰。对同属黄病毒科的HCV阳性血清无明显交叉反应，特异性好。

实施例三：本发明所述的登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒的生产工艺

(一)材料

1.登革抗原：制备见实施例一。所述抗原1∶1000包被时，对厂内参比品阳性符合率达到98％，特异性达到97％。

2.羊抗人IgG-HRP：深圳瑞桑公司产品。

3.TMB：德国柏林格产品。

4.阳性对照血清：所述的阳性对照血清是在含20％山羊血清和0.02％叠氮钠的10mM的pH7.4的PBS中，加入确定浓度的阳性血清制成，阳性对照的A值应大于1.5。

5.阴性对照血清：阴性对照血清是在含20％山羊血清和0.02％叠氮钠的10mM的pH7.4的PBS中，按5％的比例加入混合好的阴性血清制成。阴性对照的A值应小于0.1。

6.酶标板：12孔板条，CV(％)≤10％。可采用深圳金灿华有限公司的产品。

7.厂内参比品：自广东省疾病预防控制中心微检所虫媒病研究室的血清库中筛选和制备。

8.山羊血清：购自浙江三利生物制品厂，蛋白含量为3.3±0.5％，无菌试验阴性，对试剂盒反应系统无抑制。

9.其它试剂：均为国产分析纯试剂。

(二)制备过程

1.抗原制备及检定(见实施例一至二)

2.包被工艺的确定

(1)固相载体的筛选

CV值测定：包被后取1份Dengue-IgG弱阳性血清(CV血清)用间接法测定10孔CV值；

吸附性测定：取自制Dengue基因工程抗原自1∶250开始对倍稀释包被，取1份Dengue-IgG阳性血清用间接法测定，观察OD＞0.5的孔序。

(2)封闭条件的选择

选择现有的多种封闭液配方进行试验，最后选定用含20％山羊血清和0.02％叠氮钠的10mM PBS(pH7.4)，150ul/孔封闭，4℃过夜后扣干。

(3)包被板制备

将所述的基因工程重组表达的登革病毒包膜蛋白特异性抗原按确定的浓度用0.05M的pH9.6的CB即碳酸盐缓冲液稀释后，按0.1ml/孔包被到微孔板内，在2℃～8℃吸附24～26小时后，用10mM PBST即吐温磷酸缓冲液按0.25ml/孔洗板，再用封闭液按0.15ml/孔在2℃～8℃封闭18～20小时，弃除多余的封闭液，经真空干燥处理后用铝膜袋密封，置2～8℃保存。

3、酶标抗体稀释液的选择及效价滴定

采用经筛选的酶标稀释液(pH7.4的10mM PBS，含10％山羊血清和0.2％吐温-20、0.2％Bronidox)，按工作浓度配制羊抗人IgG-HRP工作液，其稳定性符合质检要求。经滴定，羊抗人IgG-HRP的效价为1∶10000。

4、cut-off值的确定

从中山市博爱医院、中医院、人民医院取回的正常体检的血清标本、门诊病人血清(非登革热患者)400份进行检测，并进行统计分析，得出均值为0.0351，SD＝0.0372，X+3SD＝0.147，确定cut-off值为0.15+阴性对照均值(该值不足0.050的以0.050计)。

5、制检规程的确定

根据以上实验及过程，参照《中国生物制品规程II部》的格式，制订本试剂盒的制造及检定规程。

SEQUENCE LISTING(序列表)

<110>广东省疾病预防控制中心

<120>登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒

<130>

<141>2007-05-15

<160>16

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>124

<212>PRT

<213>登革病毒1型E蛋白B区

<400>1

Lys Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr

1 5 10 15

Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr

20 25 30

Val Leu Val Gln Ile Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile

35 40 45

Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu Arg Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu

50 55 60

Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile

65 70 75 80

Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Ile Gly Ala Gly

85 90 95

Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly

100 105 110

Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg

115 120

<210>2

<211>372

<212>DNA

<213>登革病毒1型E蛋白B区

<400>2

aaaatggaca aactgactct aaaagggatg tcatatgtta tgtgcacagg ctcattcaag 60

ctagagaaag aagtggctga gacccaacat ggaaccgttc tagtgcagat taaatacgaa 120

ggaacagatg caccatgcaa gatccctttt tcgacccaag atgaaagagg agtaacccag 180

aacgggagat taataacagc caaccctata gttactgaca aagaaaaacc agtcaacatt 240

gaggcagaac caccttttgg tgagagttac atcgtgatag gagcaggtga aaaagctttg 300

aaactaagtt ggttcaagaa aggaagcagc atagggaaaa tgtttgaggc gactgcccgt 360

ggtgcacgtc gt 372

<210>3

<211>124

<212>PRT

<213>登革病毒2型E蛋白B区

<400>3

Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr

1 5 10 15

Gly Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr

20 25 30

Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile

35 40 45

Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu

50 55 60

Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile

65 70 75 80

Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu

85 90 95

Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly

100 105 110

Gln Met Ile Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg

115 120

<210>4

<211>372

<212>DNA

<213>登革病毒2型E蛋白B区

<400>4

cgtatggaca aactacagct caaaggaatg tcatactcta tgtgcacagg aaagtttaaa 60

gttgtgaagg aaatagcaga aacacaacat ggaacaatag ttatcagagt acaatatgaa 120

ggggacggtt ctccatgtaa gatccctttt gagataatgg atttggaaaa aagacatgtt 180

ttaggtcgcc tgattacagt caacccaatc gtaacagaaa aagatagccc agtcaacata 240

gaagcagaac ctccattcgg agacagctac atcatcatag gagtagagcc gggacaattg 300

aagctcaact ggtttaagaa aggaagttct atcggccaaa tgattgagac aacaatgcgt 360

ggtgcgaagc gt 372

<210>5

<211>124

<212>PRT

<213>登革病毒3型E蛋白B区

<400>5

Lys Met Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu

1 5 10 15

Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr

20 25 30

Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile

35 40 45

Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu

50 55 60

Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile

65 70 75 80

Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly

85 90 95

Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly

100 105 110

Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg

115 120

<210>6

<211>372

<212>DNA

<213>登革病毒3型E蛋白B区

<400>6

aagatggaca aattgaaact caaggggatg agctatgcaa tgtgcttgaa tacctttgtg 60

ttgaagaaag aagtctccga aacgcagcat gggacaatac tcattaaggt tgagtacaaa 120

ggggaagatg caccctgcaa gattcctttc tccacggagg atggacaagg gaaagctcac 180

aatggcagac tgatcacagc caatccagtg gtgaccaaga aggaggagcc tgtcaacatt 240

gaggctgaac ctccttttgg ggaaagtaat atagtaattg gaattggaga caaagccctg 300

aaaatcaact ggtacaggaa gggaagctcg attgggaaga tgttcgaggc cactgcccgt 360

ggtgcacgtc gt 372

<210>7

<211>123

<212>PRT

<213>登革病毒4型E蛋白B区

<400>7

Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser

1 5 10 15

Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr

20 25 30

Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val

35 40 45

Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile

50 55 60

Ile Ser Pro Thr Pro Phe Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile

65 70 75 80

Glu Leu Glu Arg Pro Leu Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asp

85 90 95

Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys

100 105 110

Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg

115 120

<210>8

<211>369

<212>DNA

<213>登革病毒4型E蛋白B区

<400>8

cgtatggaga aattgcgtat taagggaatg tcatacacga tgtgctcagg aaagttctca 60

attgacaaag agatggcaga aacacagcat gggacaacag tggtaaaagt caagtatgag 120

ggtgctggag ctccatgtaa agttcccata gagataagag atgtgaacaa ggaaaaagtg 180

gtagggcgta tcatctcacc tacccctttt gctgagaata ccaacagtgt aaccaacata 240

gaattagaac gccctttgga cagctacata gtaataggtg ttggagacag cgcattaaca 300

ctccattggt tcaggaaagg gagttccatt ggcaagatgt ttgagtccac ataccgtggc 360

gcaaagcgt 369

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成引物

<400>9

ggaggaattc aaaatggaca aactgactct 30

<210>10

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成引物

<400>10

cccacctcga gacgacgtgc accacgggca gtcgc 35

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成引物

<400>11

ggaggaattc cgtatggaca aactacagct 30

<210>12

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成引物

<400>12

cccacctcga gacgcttcgc accacgcatt gttgt 35

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成引物

<400>13

ggaggaattc aagatggaca aattgaaact 30

<210>14

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成引物

<400>14

cccacctcga gacgacgtgc accacgggca gtggc 35

<210>15

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成引物

<400>15

ggaggaattc cgtatggaga aattgcgtat taagg 35

<210>16

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成引物

<400>16

cccacctcga gacgctttgc gccacggtat gtgga 35

Claims

1、一种登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒，包括酶标记板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标记物、样品稀释液、浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、封板胶，其特征在于：

所述酶标记物包含羊抗人IgG-HRP，即羊抗人IgG-辣根过氧化物酶；

所述酶标记板上的包被抗原为基因工程重组表达的登革病毒包膜蛋白特异性抗原，所述抗原包括：

氨基酸序列为SEQ ID No.1的重组1型登革病毒包膜蛋白特异性抗原；

氨基酸序列为SEQ ID No.3的重组2型登革病毒包膜蛋白特异性抗原；

氨基酸序列为SEQ ID No.5的重组3型登革病毒包膜蛋白特异性抗原；

氨基酸序列为SEQ ID No.7的重组4型登革病毒包膜蛋白特异性抗原。

2、根据权利要求1所述的登革病毒抗体酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于：

所述重组1型登革病毒包膜蛋白特异性抗原是由SEQ ID No.2的DNA序列所编码的；

所述重组2型登革病毒包膜蛋白特异性抗原是由SEQ ID No.4的DNA序列所编码的；

所述重组3型登革病毒包膜蛋白特异性抗原是由SEQ ID No.6的DNA序列所编码的；

所述重组4型登革病毒包膜蛋白特异性抗原是由SEQ ID No.8的DNA序列所编码的。

3、根据权利要求1所述的登革病毒抗体酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于：

所述的阳性对照血清是在含20％山羊血清和0.02％叠氮钠的10mM的pH7.4的PBS中，加入确定浓度的阳性血清制成，阳性对照的A值应大于1.5；

阴性对照血清是在含20％山羊血清和0.02％叠氮钠的10mM的pH7.4的PBS中，按5％的比例加入混合好的阴性血清制成，阴性对照的A值应小于0.1。

4、根据权利要求1所述的登革病毒抗体酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于：所述酶标记板的制备方法是：将所述的基因工程重组表达的登革病毒包膜蛋白特异性抗原按确定的浓度用0.05M的pH9.6的CP即碳酸盐缓冲液稀释后，按0.1ml/孔包被到微孔板内，在2℃～8℃吸附24～26小时后，用10mM PBST即吐温磷酸缓冲液按0.25ml/孔洗板，再用封闭液按0.15ml/孔在2℃～8℃封闭18～20小时，弃除多余的封闭液，经真空干燥处理后用铝膜袋密封，置2～8℃保存。

5、根据权利要求4所述的登革病毒抗体酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的封闭液的组成为：含20％山羊血清和0.02％叠氮钠的pH7.4的10mM磷酸缓冲液即PBS。

6、根据权利要求1所述的登革病毒抗体酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于：所述的所述酶标记物是用酶标稀释液按工作浓度配制的羊抗人IgG-HRP工作液，所述的酶标稀释液的组成为：pH7.4的10mM PBS即磷酸缓冲液，其中含10％山羊血清、0.2％吐温-20和0.02％叠氮钠。