CN103103293A - 登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量pcr检测试剂盒及核苷酸序列 - Google Patents
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Abstract
本发明一种登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列，试剂盒含有纳米磁性微粒，用于分离提取登革2型病毒RNA，所述纳米磁性微粒为表面包裹了硅羟基的Fe3O4纳米粒子。本试剂盒将纳米磁微粒分离核酸技术与实时荧光定量PCR技术有机结合，在标本核酸提取方面具有操作方便、快捷、高效的特点，尤其在提取微量核酸方面具有很大优势，实现了最大程度降低漏检率的目标，本试剂盒的检测限可以达到29copies/μl。
Description
技术领域
本发明属于检验检疫领域，涉及检测临床样品中登革热病原体登革病毒（Dengue Virus，DV）2型（DV-2），是一种登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列。
背景技术
登革病毒（dengue virus，DV）是以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，引起登革热（dengue fever，DF）和登革出血热（dengue hemorrhagic fever，DHF）或登革休克综合征（dengue shock syndrome，DSS）的病原体。每年的登革病毒感染者超过1亿，登革病毒感染已成为全球严重的公共卫生问题。登革热主要流行于全球热带和亚热带地区。目前除欧洲以外所有大陆均有登革热的流行，尤其是东南亚、太平洋岛屿和加勒比海地区最为严重，我国主要是海南、广东、广西、台湾、福建等南方沿海地区。目前，全球登革热疫情不容乐观，必须加强对登革热在内的各种虫媒病毒病的控制和研究。随着人群对登革病毒一种血清型的自然免疫力的逐渐消退，以及登革病毒基因型多样性的增加和毒力增强变异株的出现，可能引起新的DF/DHF流行和暴发疫情，因此，做好登革热病例的早期检测、媒介监测等方面的研究至关重要。
登革病毒的自然宿主是人、某些低等灵长类动物和蚊。患者是主要传染源。一般在发病前一天至发病后第3～5日内传染性最强。在流行期间还有众多的轻型患者和隐性感染者，也是重要的传染源。人群对登革病毒普遍易感，感染后对同型病毒株有巩固的免疫力，并可维持多年，但对异型登革病毒仅有短暂的交叉免疫，故临床上有患两次以上登革热的可能。
DV是黄病毒属的单股正链RNA病毒，根据登革病毒E蛋白不同的抗原特性，利用血清中和试验将其分为1、2、3和4型四种血清型。当前世界范围内DV-2和DV-3是流行优势株，并可以发生复合感染。
DV的四个血清型（DV-1、DV-2、DV-3和DV-4），任何一种DV感染均可导致登革热（DF）、登革出血热（DHF）或登革体克综合征（DSS）。登革病毒在人体中，主要在单核-吞噬细胞内生长繁殖，在感染早期可出现特异性IgM抗体，4-5d后出现血凝抑制抗体，8-10d后出现中和抗体。IgG抗体可维持5-15年。人初次感染登革病毒后，可表现为隐性感染或一般的发热，症状不明显；机体可对同型病毒产生免疫力，而且可能持续终生，但对异型病毒感染的保护作用持续时间较短。初次感染登革病毒后二次感染异型登革病毒易发生登革出血热和登革休克综合征。
由于缺乏有效的同时针对四个血清型DV的疫苗，早期诊断成为降低DHF和DSS发病率和死亡率的关键。此外，DV感染的临床症状无特异性，很难与其他的急性发热疾病，如疟疾、黄热病、西尼罗热及地方性脑炎等热带病相区别。对确定有DHF/DSS症状的病人，及时有效的医疗护理成为减轻症状、避免死亡的唯一有效措施。因此，在疾病的早期，对不明原因的急性发热疾病和出血热进行鉴别诊断显得特别重要。
目前登革病毒诊断方法主要包括病毒分离、分子生物学检测和血清学检测。其中，病毒分离作为登革病毒诊断的金标准，不但可以检出病毒的存在，还能对病毒的型别进行鉴定，但该方法耗时，灵敏度低，而且需要特殊的仪器设备和专业技术人员。从Banditti早期报道的巢式RT-PCR检测到现在实时荧光PCR检测的应用，分子生物学检测技术最近十几年来有了较大的发展。目前，对DV感染的早期诊断、分型诊断以及区分其他相关黄热病毒的感染中，分子诊断技术在很大程度上代替了传统的病毒分离方法。
分子生物学检测技术的发展，为登革热的早期诊断提供了可能。应用普通RT-PCR方法可在1d内进行登革病毒的鉴定和分型诊断，但该方法易造成标本间的交叉污染而得到假阳性结果，因而在使用上受到一定限制。
实时荧光定量PCR技术是1996年首次由美国Applied Biosystems公司推出的，与传统的PCR技术相比，实时定量PCR检测方法实现了低拷贝数靶基因的定量分析，而且还具有特异性和敏感性更强、自动化程度更高以及污染可能性更小等优点。
作为一种新的核酸检测方法，实时荧光PCR技术已广泛应用于转基因检测、药物疗效评价、基因表达研究、传染病诊断等诸多领域，是目前国际公认的最灵敏、特异、重复性最好的核酸定性、定量检测方法。国内外已有多篇文章报道采用TaqMan实时荧光定量PCR技术检测登革病毒。随着技术的发展，实时荧光定量PCR正取代传统PCR，成为急性期患者血标本快速诊断登革病毒感染的新标准。
与传统的PCR相对比，TaqMan实时荧光定量PCR技术依据目的基因设计合成了一条能够与之特异性杂交的探针，探针结合位置位于上下游引物之间，当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5’→3’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光基团从探针上解离下来，破坏了两个荧光基团之间的荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET），而发出荧光，解离下来的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此根据反应体系中的荧光强度即可计算初始模板的数量。
这项新技术对于早期发现登革热病人十分有利。研究表明，在患者出现症状的第7d，采用免疫学检测，血清IgM抗体疑似阳性，第13d呈阳性，而采用实时荧光定量PCR检测，第2d血清中检出登革病毒，应用这项新技术可以实现登革热病人的早期诊断。
DV的实时荧光定量PCR检测，包括两大步骤，首先是从各种标本中将DV病毒的核酸提取出来，然后再用实时荧光定量PCR技术对目的基因进行检测。DV是RNA病毒，病毒核酸极易在标本处理的过程中降解，而导致假阴性的检测结果，导致DV的漏检。传统的核酸分离方法，不仅需接触有毒试剂，而且步骤繁杂、费时、费力，难以自动化操作；现有的商业化核酸提取试剂盒，通常价格昂贵，不适合现场大批量使用。
纳米磁微粒（MNP）是一种优良的磁性分离介质，具有比表面积大，磁响应性强，可应用于生物大分子（如蛋白质、核酸等）的快速分离提取，尤其是其表面进行化学修饰或高分子化合物包裹后，分离提取效率可大为提高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种快速高效、灵敏度高、操作方便、快捷的登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒。
本发明还提供一种与该特异性强、灵敏度高的登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测相关的核苷酸序列。
本发明实现目的的技术方案如下：
本发明建立了登革病毒的纳米磁分离的核酸提取纯化技术；设计了登革2型病毒特异的引物和探针，优化了实时荧光PCR检测体系；针对登革2型病毒自身的序列特征和实时荧光PCR反应引物和探针的序列特征，设计了另外一对引物用于构建质粒标准品，结合普通PCR技术和分子克隆技术，构建了登革2型病毒质粒标准品，建立了目的基因拷贝数与荧光检测信号之间关系的标准曲线，实现了登革2型病毒的实时荧光定量检测，具体如下：
一种登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒含有Fe3O4纳米磁性微粒，用于分离提取登革2型病毒RNA，所述的Fe3O4纳米磁性微粒为表面硅羟基改性的Fe3O4纳米粒子。
而且，所述Fe3O4纳米磁微粒分离提取登革2型病毒RNA的步骤如下：
⑴取10μl纳米磁微粒MNP（25μg/μl）溶液，用磁铁吸附MNP，弃上清；加入裂解液250μl，将MNP吹打混匀，加入登革热疑似病人血浆或血清标本50μl，混匀，60℃5min，室温静置2min；
⑵加入300μl结合液，涡旋或颠倒混匀，室温静置10min，用磁铁吸附MNP，弃上清；
⑶加入洗液清洗MNP，用磁铁吸附MNP，弃上清；重复清洗一次；3000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液；
⑷加入洗脱液50μl，将MNP吹打混匀，65℃5min，取出后立即用磁铁吸附MNP，吸取上清液备用。
而且，所述Fe3O4纳米磁微粒的制备方法为：利用热分解法分解乙酰丙酮铁，合成Fe3O4纳米粒子，在碱性条件下水解四乙氧基硅烷，包裹Fe3O4纳米粒子，形成表面为硅羟基的纳米磁性微粒。
而且，所述试剂盒还包括如下组分：纳米磁微粒、裂解液、结合液、洗液、洗脱液、逆转录反应液、实时荧光PCR反应液、阳性对照、阴性对照；
所述结合液为无水乙醇；
所述洗液为70%乙醇；
所述洗脱液为TE pH8.0；
所述逆转录反应液包括下游引物R1，见序列2；
所述实时荧光PCR反应液包括上游引物F1，见序列1，下游引物R1，见序列2和荧光探针P1，见序列3；
所述的阳性对照为登革2型病毒质粒标准品；
所述的阴性对照为灭活的正常人阴性血清。
而且，所述荧光探针的5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记淬灭荧光基团TAMRA,或其他配对的荧光标记均可。
一组登革2型病毒实时荧光定量PCR检测的核苷酸序列，其核苷酸序列为序列1、序列2、序列3，其中序列1为上游引物、序列2为下游引物、序列3为荧光探针。
而且，所述荧光探针的5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记淬灭荧光基团TAMRA，或其他配对的荧光标记均可。
一种登革2型病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，含有一登革2型病毒实时荧光定量PCR检测的核苷酸序列。
而且，由以下组成：裂解液、逆转录反应液、实时荧光PCR反应液、质粒标准品、阳性对照、阴性对照。
所述的阳性对照为质粒浓度为1×106copies/μl的质粒标准品；
所述的阴性对照为灭活的正常人阴性血清；
所述逆转录反应液包括下游引物R1，见序列2；
所述实时荧光PCR反应液包括上游引物F1，见序列1、下游引物R1见序列2和荧光探针P1，见序列3；
所述的阳性对照为质粒浓度为登革2型病毒质粒标准品；
所述的阴性对照为灭活的正常人阴性血清。
10、根据权利要求8所述的登革2型病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：上游引物、下游引物、荧光探针的浓度为：上游引物200nM，下游引物200nM，荧光探针120nM。
本发明的优点和积极效果如下：
1、本试剂盒将纳米磁分离提取核酸技术与实时荧光定量PCR技术进行有机结合，在标本提取方面具有操作方便、快捷、高效的特点，尤其在提取微量病毒核酸方面具有很大优势，实现了最大程度降低漏检率的目标，本试剂盒的检测限可以达到29copies/μl。
2、本发明首次采取了纳米磁微粒分离提取登革病毒核酸的方法，可以最大程度地减少提取过程中病毒核酸的损失，快速高效地分离纯化标本中的登革病毒RNA，再通过设计的实时荧光PCR检测体系对DV-2进行检测，通过构建质粒标准品，建立实时荧光PCR标准曲线，实现对DV-2的定量检测。
3、本发明选取登革2型病毒（DV-2）基因组外膜蛋白保守区基因序列，设计特异性引物及荧光探针进行靶序列扩增，扩增片段长度为91bp。使用逆转录体系将标本模板RNA逆转录为cDNA后，对cDNA进行实时荧光PCR扩增，再利用质粒标准品构建的标准曲线，定量推算标本中的登革2型病毒（DV-2）RNA水平。实例检测结果表明，本发明的方法可用于登革2型病毒（DV-2）感染的诊断及其登革2型病毒型别的确定。
4、本发明应用纳米磁微粒分离提取病毒核酸和实时荧光定量PCR方法，解决了短时间内快速高效提取病毒核酸并准确定量检测的方法学问题，实验结果显示，根据本发明方法生产的产品灵敏度达到29copies/μl。登革病毒感染的特点为：登革病毒一般在发病前一天至发病后3-5d内病毒载量较高，而在登革病毒感染的初期，病毒载量较低，以及发病后6-10d内，随着登革病毒抗体的产生，病毒载量迅速下降，最终病毒被机体清除，此外，在登革热流行期间还有众多的轻型患者和隐性感染者，其体内也会出现登革病毒，也是重要的传染源。本发明提供的试剂盒完全可以检测出登革病毒感染初期的感染者或众多的轻型患者等，筛查传染源。
5、本试剂盒在开发过程中参考GeneBank中登革2型病毒外膜蛋白序列，应用先进的分子生物学软件，设计得到了荧光定量PCR引物与探针，并应用于登革2型病毒的检测和定量分析，减少和避免了检测结果的假阴性或假阳性，提高了检测方法的准确性。
附图说明：
图1显示的是标准曲线，质粒标准品拷贝数在2.9×102～2.9×109时，Ct值范围是13.75～36.56，质粒拷贝数的对数值与Ct值之间呈现良好的对数线性关系。实时荧光定量PCR反应体系标准曲线斜率为-3.26，截距为45.28，R2＝0.99。
图2显示强中弱三个阳性标本实时荧光PCR扩增曲线；三个标本的Ct值分别是19.27，27.84，32.18，经标准曲线推算其病毒载量分别为，9.33×107copies/μl、2.21×105copies/μl、1.03×104copies/μl；反应曲线为典型的实时荧光PCR扩增曲线，均能够判定为阳性。
图3显示方法特异性曲线，从荧光扩增曲线上可以看到，登革2型病毒出现了明显的扩增曲线，Ct值为23.68，而甲肝病毒（HAV）疫苗株、丙肝病毒（HCV）、黄热病毒（YFV）疫苗株以及阴性对照的扩增曲线均没有上升。
图4显示14份从登革热流行区回国的入境人员标本检测曲线，其中2份标本Ct值为35.29、37.08，判断为DV-2病毒可疑阳性，经复测最终判断为DV-2病毒阳性。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本实施例使用的所有溶剂及试剂均为市售成品，引物及探针为委托基因公司合成，纳米磁微粒由北京出入境检验检疫局、国家纳米科学中心和东南大学联合研制。
本发明除了采用纳米磁微粒分离病毒RNA以外，还可以采用常规技术分离病毒RNA，然后根据本发明提供的上游引物（F1）、下游引物(R1)和荧光探针(P1)来检测登革2病毒，具体方法为本领域常规分离病毒RNA的方法，不再赘述。但是，在病毒载量较低时，使用常规技术分离病毒RNA，病毒的漏检率会增高。
本发明关于实时荧光定量聚合酶链反应技术定量检测临床样品中DV-2病毒的试剂盒，该试剂盒组成包括：(1)分别装纳米磁分离核酸体系、逆转录反应体系、经焦炭酸二乙酯处理的纯水、实时荧光PCR反应体系、阴性对照、阳性对照和质粒标准品并加盖密封的多个试剂瓶或离心管，(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或离心管的包装盒。
本发明中涉及的登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测的核苷酸序列，包括实时荧光PCR检测的上游引物（F1）、下游引物(R1)和荧光探针(P1)，以及构建质粒标准品的上游引物（F2）、下游引物(R2)和质粒标准品序列(S)，其具体序列如下：
F1：5′-CAGAGTTCCATCACAGAA-3′
R1：5′-CCATCTCATTGAAGTCAAG-3′
P1：5′-ACAGGCTATGGCACCGTCAC-3′，其中探针的5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记淬灭荧光基团TAMRA，或其他配对的荧光标记均可。
F2：5′-AGGAAAAATCGTGCAACCAG-3′
R2：5′-CATTCTCAGCCTGCACTTGA-3′
质粒标准品序列(S)如下：
AGGAAAAATCGTGCAACCAGAAAATTTGGAATACACCATCGTGATAACACCTCACTCAGGAGAAGAGCACGCTGTAGGTAATGACACAGGAAAACATGGTAAGGAAATCAAAATAACACCACAGAGTTCCATCACAGAAGCAGAACTGACAGGCTATGGCACCGTCACGATGGAGTGCTCTCCGAGAACGGGCCTTGACTTCAATGAGATGGTGCTGCTGCAGATGGAAGACAAAGCTTGGCTGGTGCACAGGCAATGGTTCCTAGACCTGCCGTTACCATGGCTACCCGGAGCGGACACACAAGGATCAAATTGGATACAGAAAGAGACATTGGTCACTTTCAAAAATCCCCACGCGAAGAAACAGGATGTCGTTGTTTTAGGATCTCAAGAAGGGGCCATGCACACGGCACTCACAGGGGCCACAGAAATCCAGATGTCATCAGGAAACTTACTATTCACAGGACATCTCAAGTGCAGGCTGAGAATG
本发明提供的登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，组成如下：
所述纳米磁微粒（简称MNP）为表面修饰的纳米磁性粒子，其制备过程为：首先利用热分解法分解乙酰丙酮铁（Ferric acetylacetonate），合成Fe3O4纳米粒子，在碱性条件下水解四乙氧基硅烷（Tetraethylorthosilicate，TEOS），包裹Fe3O4纳米粒子，形成表面为硅羟基的纳米磁性微粒。
纳米磁微粒具体制备方法为：在三口烧瓶中将0.500g乙酰丙酮铁溶解于20ml苯甲醇,室温抽真空，再在氩气保护下以平均6.5°C/min升温速率升至190°C，并在此温度下反应2h，得到黑色的胶体溶液。使用磁铁收集产物，用正己烷和乙醇分别洗涤数次，在真空干燥箱内抽真空，70℃干燥24h，即可制成四氧化三铁纳米磁微粒；将100mg四氧化三铁纳米磁微粒溶解在100ml乙醇水的混合溶液中，乙醇与水的体积比为4:1，再加入0.4ml TEOS、4ml氨水（浓度为25%），TEOS经水解、聚合，最后经无水乙醇洗涤、抽滤、干燥即可制成表面为硅羟基修饰的纳米磁微粒。纳米磁微粒保存在无水乙醇中或者DEPC处理的水中。
所述裂解液为：4M异硫氰酸胍、50mM Tris-HCl、20mM EDTA、1%Triton X-100，调节pH值至6.0。
所述结合液为无水乙醇。
所述洗液为70%乙醇。
所述洗脱液为TE（pH8.0）。
所述逆转录反应液：5×M-MLV buffer，Reverse Transcriptase MMLV（RNaseH-）(简称M-MLV)，Ribonuclease Inhibitor(简称RI)，dNTP Mixture(简称dNTPs)，DEPC处理的水、下游引物(R1)、标本RNA提取液。
所述实时荧光PCR反应液为Premix Ex Taq、上游引物(F1)和下游引物(R1)、荧光探针(P1)、cDNA（与标本RNA模板互补的DNA）和水。
质粒标准品为不同浓度的含有DV-2基因片段（S）的质粒，分别为1×103、1×104、1×105、1×106、1×107copies/μl。
所述的阳性对照为质粒浓度为1×106copies/μl的质粒标准品。
所述的阴性对照为灭活的正常人阴性血清。
具体操作方法如下：
1、质粒标准品构建步骤如下：
分离提取DV-2病毒RNA，逆转录反应合成cDNA，普通PCR反应扩增目的基因片段（S）；
对扩增片段进行切胶回收、连接、转化、筛选阳性克隆，测序，确认插入目的序列片段的准确性；
纯化质粒，测定并计算质粒浓度；此次制备质粒浓度为2.9×1010copies/μl；
对质粒标准品进行10倍梯度稀释，质粒浓度为2.9×109、2.9×108、2.9×107、2.9×106、2.9×105、2.9×104、2.9×103、2.9×102和2.9×101copies/μl，Ct值依次为13.75、17.36、21.21、24.67、28.26、31.24、33.52、36.56和39.72，检测灵敏度为29copies/μl。选定合适的质粒标准品浓度范围（2.9×102copies/μl～2.9×109copies/μl），以实时荧光PCR的Ct值为纵坐标（y），以病毒拷贝数的对数值为横坐标（x），构建标准曲线。
上述的逆转录反应液为：5×M-MLV buffer，M-MLV，RI，dNTPs，DEPC处理的水、下游引物(R2)、DV-2RNA模板。
上述的普通PCR反应液为：10×PCR buffer、上游引物（F2）、下游引物(R2)、Taq酶、dNTPs、DV-2cDNA和水。
逆转录反应步骤：在0.2ml离心管中加入5μl DV-2RNA模板、1μl下游引物（R2，10μM），70℃10min，立即置于冰上2min，然后依次加入2μl5×M-MLVBuffer、0.5μl dNTPs（10mM）、0.2μl M-MLV（200U/μl）、0.2μlRI（40U/μl），补水至10μl，42℃60min，70℃15min，冰上放置2min。
普通PCR反应步骤：在0.2ml离心管中，依次加入2.5μl10×PCR buffer，0.5μl dNTPs（10mM），上游引物（F2，10μM）和下游引物（R2，10μM）各1μl，0.2μl Taq酶（5U/μl）、2μl上述逆转录反应产物（DV-2cDNA），补水至25μl。反应条件为：95℃1min；95℃30s，55℃30s，72℃40s，35个循环；72℃10min，4℃保存备用。
2、纳米磁微粒（MNP）分离登革病毒RNA步骤如下：
⑴取10μl MNP（25μg/μl）置于1.5ml洁净的离心管中，用磁铁吸附MNP后弃上清；
⑵加入250μl的裂解液，将MNP吹打混匀，加入50μl登革热疑似病人血清/血浆标本或阴性对照，吹打混匀，60℃5min，室温静置2min；
⑶加入300μl无水乙醇，涡旋或颠倒混匀，室温静置10min，用磁铁吸附MNP，弃上清；
⑷加入300μl70%乙醇清洗MNP，用磁铁吸附MNP，弃上清；重复清洗一次，3000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液；
⑸加入50μl的洗脱液，将MNP吹打混匀，65℃5min，离心管取出后立即用磁铁吸附MNP，吸取上清液备用，上清液即为病毒RNA提取液。
3、逆转录反应：
在0.2ml离心管中加入5μl RNA模板（即上述病毒RNA提取液）、1μl下游引物（R1，10μM），70℃10min，立即置于冰上2min，然后依次加入2μl5×M-MLV Buffer、0.5μl dNTPs（10mM）、0.2μl M-MLV（200U/μl）、0.2μlRI（40U/μl），补水至10μl，42℃60min，70℃15min，置于冰上2min。反应结束后获得逆转录反应产物（即DV-2cDNA）。
4、实时荧光PCR：
在0.2ml离心管中，依次加入12.5μl2×Premix Ex Taq，0.5μl上游引物（F1，10μM）、0.5μl下游引物（R1，10μM），0.3μl荧光探针(P1，10μM)、2μl上述逆转录反应产物（DV-2cDNA），补水至25μl。如采用ABI7900实时荧光PCR仪进行实时荧光PCR反应，则使用实时数据采集模式，数据采集分析系统为SDS2.3。
循环反应参数为95°C30s；95°C5s，60°C30s，40个循环。
5、反应系统的质量控制：
根据使用不同的实时荧光PCR仪设定好基线（baseline），设定的一般原则以阈值线刚好超过正常阴性对照反应曲线的最高点，也可根据仪器噪音情况调整。反应结果应同时符合以下2个条件：即阴性对照无扩增曲线而阳性对照Ct<35并有明显扩增曲线。否则，试验结果无效。
阴性结果：样品无Ct值或Ct＞40，且无明显扩增曲线，报告为DV-2实时荧光PCR检测结果为阴性。
阳性结果：样品Ct值≤35，并有明显扩增曲线，报告为DV-2实时荧光PCR检测结果为阳性。
可疑结果：样品Ct值在35～40之间的标本必须重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则该标本判断为DV-2实时荧光PCR检测结果为阳性，否则为阴性。
值得特别说明的是，为了实现本发明的DV-2病毒定量检测，我们参考GeneBank中登革病毒2型外膜蛋白序列，利用DNAMAN6.0进行序列比对，通过软件Primer Express3.0设计实时荧光PCR引物与探针和设计构建质粒标准品的引物。构建质粒标准品的上、下游引物位于实时荧光PCR上、下游引物的外侧，质粒标准品基因片段为490bp。借助这些质粒标准品制作外标定量标准曲线，以实现DV-2的定量检测。
具体检测实例
实施例1：登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及其使用
⑴制备包括下列组成成分的试剂盒：
纳米磁微粒、裂解液、结合液、洗液、洗脱液、逆转录反应液、实时荧光PCR反应液、DEPC水、阴性对照、阳性对照、质粒标准品。
⑵标本采集、运送和保存：
无菌操作采集疑似登革热病人发病早期的血标本，分离血清或血浆置于合适的容器中备用。抗凝剂可选用EDTA钠盐或钾盐或枸橼酸钠。4天内进行病毒检测的可存放于4℃，长时间保存应置于-20℃或-70℃以下。
⑶检测步骤和结果分析：
病毒核酸分离提取：取10μl MNP（25μg/μl），用磁铁吸附MNP后弃上清；加入250μl的裂解液，混匀，吸取50μl病人血浆/血清标本或阴性对照，60℃5min，室温静置2min；加入300μl无水乙醇，涡旋或颠倒混匀，室温静置10min，用磁铁吸附MNP，弃上清；加入300μl70%乙醇清洗，用磁铁吸附MNP，弃上清；重复清洗一次，3000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液；加入50μl的TE洗脱液，将MNP吹打混匀，65℃5min，取出立即用磁铁吸附MNP，吸取上清液（即病毒RNA提取液）备用。阴性对照血清与病人血标本提取核酸步骤相同。
逆转录反应：在0.2ml离心管中加入5μl上述病毒RNA提取液、1μl下游引物（R1，10μM），70℃10min，立即置冰上2min，然后依次加入2μl5×M-MLV Buffer、0.5μl dNTPs（10mM）、0.2μl MMLV（200U/μl）、0.2μl RI（40U/μl），补水至10μl，42℃60min，70℃15min，冰上放置2min。反应结束后获得逆转录反应产物。
实时荧光PCR：分别取2μl上述逆转录反应产物、或2μl阳性对照或系列梯度稀释的质粒标准品，加入实时荧光PCR反应管中，反应总体积为25μl，其中上游引物（F1）200nM，下游引物（R1）200nM，荧光探针（P1）120nM。采用ABI7900实时荧光PCR仪进行实时荧光PCR反应，使用实时数据采集模式，数据采集分析系统为SDS2.3。
循环反应参数为95°C30s；95°C5s，60°C30s，40个循环。
反应结束后保存检测数据文件，并对数据文件进行分析。由图2可见强、中和弱三个阳性标本的扩增曲线，三个标本的Ct值分别是19.27，27.84，32.18，经标准曲线推算其病毒载量分别为，9.33×107copies/μl、2.21×105copies/μl、1.03×104copies/μl；反应曲线为典型的实时荧光扩增曲线，均能够判定为阳性。
图3显示该检测方法的特异性曲线。DV-2标本检测Ct值为23.68，根据标准曲线推算出标本中DV-2病毒的RNA含量，为4.15×106copies/μl。
图4显示采用本试剂盒，检测从登革热流行区回国的入境人员DV-2感染情况，其中2份标本Ct值为35.29、37.08，判断为DV-2病毒可疑阳性，经复测验证最终判断为DV-2病毒阳性。
Claims (10)
1.一种登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：试剂盒含有Fe3O4纳米磁性微粒，用于分离提取登革2型病毒RNA，所述的Fe3O4纳米磁性微粒为表面硅羟基改性的Fe3O4纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述Fe3O4纳米磁微粒分离提取登革2型病毒RNA的步骤如下：
⑴取10μl纳米磁微粒MNP（25μg/μl）溶液，用磁铁吸附MNP，弃上清；加入裂解液250μl，将MNP吹打混匀，加入登革热疑似病人血浆或血清标本50μl，混匀，60℃5min，室温静置2min；
⑵加入300μl结合液，涡旋或颠倒混匀，室温静置10min，用磁铁吸附MNP，弃上清；
⑶加入洗液清洗MNP，用磁铁吸附MNP，弃上清；重复清洗一次；3000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液；
⑷加入洗脱液50μl，将MNP吹打混匀，65℃5min，取出后立即用磁铁吸附MNP，吸取上清液备用。
3.根据权利要求1所述的登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述Fe3O4纳米磁微粒的制备方法为：利用热分解法分解乙酰丙酮铁，合成Fe3O4纳米粒子，在碱性条件下水解四乙氧基硅烷，包裹Fe3O4纳米粒子，形成表面为硅羟基的纳米磁性微粒。
4.根据权利要求1所述的登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下组分：纳米磁微粒、裂解液、结合液、洗液、洗脱液、逆转录反应液、实时荧光PCR反应液、阳性对照、阴性对照；
所述结合液为无水乙醇；
所述洗液为70%乙醇；
所述洗脱液为TE pH8.0；
所述逆转录反应液包括下游引物R1，见序列2；
所述实时荧光PCR反应液包括上游引物F1，见序列1，下游引物R1，见序列2和荧光探针P1，见序列3；
所述的阳性对照为登革2型病毒质粒标准品；
所述的阴性对照为灭活的正常人阴性血清。
5.根据权利要求4所述的登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述荧光探针的5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记淬灭荧光基团TAMRA,或其他配对的荧光标记均可。
6.一组登革2型病毒实时荧光定量PCR检测的核苷酸序列，其特征在于：其核苷酸序列为序列1、序列2、序列3，其中序列1为上游引物、序列2为下游引物、序列3为荧光探针。
7.根据权利要求6所述的登革2型病毒实时荧光定量PCR检测的核苷酸序列，其特征在于：所述荧光探针的5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记淬灭荧光基团TAMRA，或其他配对的荧光标记均可。
8.一种登革2型病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：含有一组如权利要求6所述的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的登革2型病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：由以下组成：裂解液、逆转录反应液、实时荧光PCR反应液、质粒标准品、阳性对照、阴性对照。
所述的阳性对照为质粒浓度为1×106copies/μl的质粒标准品；
所述的阴性对照为灭活的正常人阴性血清；
所述逆转录反应液包括下游引物R1，见序列2；
所述实时荧光PCR反应液包括上游引物F1见序列1，下游引物R1见序列2和荧光探针P1，见序列3；
所述的阳性对照为质粒浓度为登革2型病毒质粒标准品；
所述的阴性对照为灭活的正常人阴性血清。
10.根据权利要求8所述的登革2型病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：上游引物、下游引物、荧光探针的浓度为：上游引物200nM，下游引物200nM，荧光探针120nM。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN111549181A (zh) * | 2020-05-20 | 2020-08-18 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种检测禽腺病毒4型的纳米pcr方法、试剂盒及应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1258317A (zh) * | 1996-11-25 | 2000-06-28 | 遗传工程与生物技术中心 | 登革病毒基因表达的方法 |
| CN101308137A (zh) * | 2007-05-15 | 2008-11-19 | 广东省疾病预防控制中心 | 登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒 |
| CN101343319A (zh) * | 2008-04-10 | 2009-01-14 | 中国人民解放军第三军医大学 | 抗登革病毒e蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用 |
| CN102277447A (zh) * | 2011-05-27 | 2011-12-14 | 江苏硕世生物科技有限公司 | 登革热病毒ⅰ型/ⅱ型双重荧光pcr检测试剂盒 |
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2013
- 2013-02-01 CN CN201310041412.5A patent/CN103103293B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1258317A (zh) * | 1996-11-25 | 2000-06-28 | 遗传工程与生物技术中心 | 登革病毒基因表达的方法 |
| CN101308137A (zh) * | 2007-05-15 | 2008-11-19 | 广东省疾病预防控制中心 | 登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒 |
| CN101343319A (zh) * | 2008-04-10 | 2009-01-14 | 中国人民解放军第三军医大学 | 抗登革病毒e蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用 |
| CN102277447A (zh) * | 2011-05-27 | 2011-12-14 | 江苏硕世生物科技有限公司 | 登革热病毒ⅰ型/ⅱ型双重荧光pcr检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| 《Applied Microbiology and Biotechnology》 20061231 Sonja Berensmeier "Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids" 第73卷, 第3期 * |
| 《Nanotechnology》 20120328 A G Roca et.al. "Surface functionalization for tailoring the aggregation and magnetic behaviour of silica-coated iron oxide nanostructures" 第23卷, 第15期 * |
| 《中国媒介生物学及控制杂志》 20061231 徐昌平等 "TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测登革1、2型病毒" 第17卷, 第6期 * |
| 《分子诊断与治疗杂志》 20120531 罗雅艳等 "登革病毒TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用" 第4卷, 第3期 * |
| A G ROCA ET.AL.: ""Surface functionalization for tailoring the aggregation and magnetic behaviour of silica-coated iron oxide nanostructures"", 《NANOTECHNOLOGY》 * |
| SONJA BERENSMEIER: ""Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids"", 《APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY》 * |
| 徐昌平等: ""TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测登革1、2型病毒"", 《中国媒介生物学及控制杂志》 * |
| 罗雅艳等: ""登革病毒TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用"", 《分子诊断与治疗杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111549181A (zh) * | 2020-05-20 | 2020-08-18 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种检测禽腺病毒4型的纳米pcr方法、试剂盒及应用 |
| CN111549181B (zh) * | 2020-05-20 | 2023-08-25 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种检测禽腺病毒4型的纳米pcr方法、试剂盒及应用 |
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