CN102277447A - 登革热病毒ⅰ型/ⅱ型双重荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了登革热病毒I型/II型双重荧光PCR检测试剂盒，属于登革热病毒血清型的检测领域。本发明检测试剂盒包括以下各组分：RT-PCR反应液、酶混合液、登革热病毒I型/II型双重反应液、去RNA酶水。本发明还公开了该试剂盒检测登革热病毒I型/II型的使用方法。本发明试剂盒解决了现有登革热病毒体外检测试剂盒无法同时检测登革热病毒不同血清型的问题，能够在同一反应管中同时检测出登革热病毒I型和II型，具有特异性强、灵敏性高、操作简便、可重复性强、检测结果快速客观等优点。

Description

登革热病毒Ⅰ型/Ⅱ型双重荧光PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种登革热病毒体外检测试剂盒，尤其涉及登革热病毒I型/II型双重荧光PCR检测试剂盒，本发明属于登革热病毒血清型的体外检测领域。 

背景技术

登革热(Classical dengue fever，DF)是由登革热病毒(dengue virus)的4个血清型引起的一种急性传染病，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，临床上以高热、出血、全身肌肉和关节痛等为主要症状，可伴有皮疹、淋巴腺肿和白细胞减少。登革热病毒感染除引起登革热外，严重的还可导致登革出血热(denguehemorrhagic fever，DHF)或登革休克综合症(dengue shocksyndrome，DSS)等症状。DHF以高热、出血、休克和高病死率为特征，是较为严重的一种临床类型。由于全球气候变暖、国际旅游频繁和对蚊虫缺乏有效的控制，登革热在世界范围内发生过多次大流行，全球有100多个国家出现流行，据WHO统计，每年登革热感染人数有5000万，全世界有25亿人正受到感染登革病毒的威胁，每年均出现几百万病例，是较为严重的公共卫生问题。 

登革病毒是黄病毒科(flaviviridae)黄病毒属(flavivirus)登革亚组的重要成员，自然界中存在的登革病毒可分为4个血清型。登革热的传 染源主要是处于病毒血症期的显性和隐性的感染者，在城市型疫源地区患者和隐性感染者是主要的传染来源。在新疫区普遍易感。但以青壮年发病率最高。在地方性流行区，20岁以下的居民100％在血清中能检出抗登革热病毒的中和抗体，因而发病者多为儿童。 

登革热的发现已有200多年的历史，早期记载的报道是1779年埃及开罗、印度尼西亚雅加达及美国费城，根据症状命名为关节热和骨折热。1869年由英国伦敦皇家内科学会命名为登革热。中国于1978年在广东流行，并分离出IV型登革热病毒。此后，1979年、1980年、1985年小流行中分离出I型、II、III型病毒。目前各地区主要以散在暴发或散发为主，并且以输入型病例引发的流行居多。 

实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied biosystems公司推出，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(cDNA)的起始浓度进行定量的方法。如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时PCR，即实时PCR法(Real-time RT-PCR)，它是指对DNA或经过反转入(RT-PCR)的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA(RNA)起始量存在相关性，从而实现定量检测。RealTime PCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定 量。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏性和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等优点。此外，通过在该体系中加入两条或者两条以上引物及对应的探针，便可实现对多种病原体的同时检测。 

现有的登革热的体外诊断试剂盒大多存在特异性和灵敏性较低、检测步骤繁琐等缺陷，有待改进。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有的登革热的体外诊断试剂盒所存在的检测步骤繁琐以及特异性和灵敏性较低等缺陷，提供一种能够同时在一个反应管中分别检测出登革热病毒I型和II型的双重荧光PCR检测试剂盒，具有特异性强、灵敏性高等优点。 

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的： 

一种登革热病毒I型/II型双重荧光PCR检测试剂盒，包括以下各组分：RT-PCR反应液、酶混合液、登革热病毒I型/II型双重反应液、去RNA酶水。 

其中，所述的登革热病毒I型/II型双重反应液由以下2组组分组成： 

组分(1)：由一对检测登革热病毒I型的引物和一条用检测登革热病毒I型的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。 

组分(2)：由一对检测登革热病毒II型的引物和一条检测登革热病毒II型的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.6所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。 

其中，所述的荧光报告基团包括FAM、HEX、ROX、CY3或CY5等荧光报告基团；所述的荧光淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或BHQ 3等荧光淬灭基团； 

本发明对上述引物和探针的配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，本发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果： 

检测登革热病毒I型的引物及探针的配比分别为：SEQ ID No.1∶SEQ ID No.2∶SEQ ID No.3＝500nM∶500nM∶300nM； 

检测登革热病毒II型的引物及探针的配比分别为：SEQ ID No.4∶SEQ IDNo.5∶SEQ ID No.6＝500nM∶500nM∶400nM。 

表1登革热病毒I型/II型引物探针 

表2登革热病毒I型/II型双重反应液组分 

试剂名称	加入体积(μl)/50反应
		登革热病毒I型FP(SEQ ID No.1)	6.25
登革热病毒I型RP(SEQ ID No.2)	6.25
		登革热病毒I型P(SEQ ID No.3)	3.75
登革热病毒II型FP(SEQ ID No.4)	6.25

[0021] 

登革热病毒II型RP(SEQ ID No.5)	6.25
		登革热病毒II型P(SEQ ID No.6)	5

为了达到更好的检测效果，本发明试剂盒中还可含有登革热病毒I型/II型的阳性参考品(购自北京三博远志生物科技有限公司或上海捷瑞生物工程有限公司)。 

所述的酶混合液包括RNA酶抑制剂、Taq酶、逆转录酶、10×缓冲液、去RNA酶水。逆转录酶和DNA聚合酶在PCR扩增中起着非常重要的作用，包括逆转录、扩增的效率和特异性，为了达到更好的效果，本发明优选采用M-MLV逆转录酶和热启动酶。 

本发明的另一个目的是提供本发明试剂盒在登革热病毒I型/II型的使用方法，包括： 

(1)提取样本的RNA； 

(2)准备以下组分：RT-PCR反应液12.5ul，酶混合液1ul，登革热病毒I型/II型反应液4ul，去RNA酶水2.5ul，RNA样本5ul。 

(3)RT-PCR扩增：按照以下程序进行RT-PCR扩增 

(4)结果判定：在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为登革热病毒I型为阳性；无典型“S”型扩增或CT＞35.0，判断为登革热病毒I型为阴性。在VIC通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为登革热病毒II型为阳性；无典型“S”型扩增或CT＞35.0，判断为登革热 病毒II型为阴性。 

检测前，先按照常规的RNA提取方法对样本提取RNA，将待测标本加入准备好的登革热病毒I型/II型试剂的PCR反应管中，在荧光定量PCR扩增仪中扩增检测。扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染革热病毒I型或II型。 

本发明登革热病毒I型/II型核酸检测试剂盒能够同时检测出登革热病毒I型、II型，解决了现有产品只能在一管反应中检测一种亚型登革热病毒的问题。本发明还具有操作简便、可重复性强、检测结果快速客观等优点，在登革热体外诊断领域具有极大的应用前景。 

附图说明

图1本发明试剂盒检测五组样本的曲线图。 

图2本发明试剂盒检测登革热病毒I型的灵敏性试验结果。 

图3本发明试剂盒检测登革热病毒II型的灵敏性试验结果。 

图4本发明试剂盒检测登革热病毒I型的特异性试验结果。 

图5本发明试剂盒检测登革热病毒II型的特异性试验结果。 

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 

试验例1 本发明试剂盒临床样本的检测试验 

1样本处理(RNA提取) 

1.1取200ul登革热临床样品，加入400ul Binding Buffer supplemented with Poly(A)，充分混匀后转入高纯化过滤管，8000rmp离心15s，弃去收集管中的废液。 

1.2加入500ul Inhibitor Removal Buffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃去收集管中的废液。 

1.3加入450ul Washing Buffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃去收集管中的废液。 

1.4重复步骤1.3，然后高速离心10s，此步骤务必将废液去除干净. 

1.5加入50ul Elution Buffer至过滤管中，室温静置2min，8000rmp离心1min，离心所得溶液即为纯化的RNA。 

2试剂准备 

表3 

3PCR扩增程序 

4结果分析：5个临床样本具体结果见表4和图1。 

表4 

试验例2本发明试剂盒灵敏性试验结果 

对登革热病毒I型质粒(购自北京三博远志生物科技有限公司)和登革热病毒II型质粒(购自上海捷瑞生物工程有限公司)进行10倍倍比稀释；采用本发明试剂盒进行检测。 

检测结果表明本发明试剂盒具有良好的灵敏性，并且CT值随浓度减少呈梯度改变(图2、图3)。试验结果表明，本发明试剂盒对于登革热病毒I型/II型的诊断具有高度的灵敏性。 

试验例3本发明试剂盒特异性试验结果 

为了检测本发明登革热病毒I型/II型检测试剂盒的特异性，用本发明登革热病毒I型/II型检测试剂盒检测登革热病毒毒株、西尼罗病毒毒株、乙脑病毒毒株、基孔肯雅病毒毒株、黄热病毒毒株、辛德毕斯病毒毒株等。 

检测结果表明FAM通道仅对登革热病毒I型进行扩增(图4)，VIC通道仅对登革热病毒II型进行扩增(图5)。表明本发明检测试剂盒能特异性扩增登革热病毒，而不与其它病毒核酸发生交叉反应。 

序列表

                                      KLPI110253序列表

<110>江苏硕世生物科技有限公司

<120>登革热病毒I型/II型双重荧光PCR检测试剂盒

<130>klx10076

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>Artifical sequence

<400>1

tyatgaagga tgggaggg                                   18

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>Artifical sequence

<400>2

atcagctgcc acatytgtgc                                 20

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>Artifical sequence

<400>3

ccatgccgca accaagatga ac                              22

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>Artifical sequence

<400>4

tctwtcaata tgctgaaacg cg                              22

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>Artifical sequence

<400>5

aaagcaatcc aagtgagaat ctctt                           25

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>Artifieal sequence

<400>6

cgcgtgtcra ctgtgcaaca gct                             23

Claims (6)

1.一种登革热病毒I型/II型的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下各组分：RT-PCR反应液、酶混合液、登革热病毒I型/II型双重反应液和去RNA酶水。

2.按照权利要求1所述的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的登革热病毒I型/II型双重反应液由以下组分(1)和组分(2)组成：

组分(1)：由一对检测登革热病毒I型的引物和一条检测登革热病毒I型的探针组成；其中，所述引物对的碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；

组分(2)：由一对检测登革热病毒II型的引物和一条检测登革热病毒II型的探针组成；其中，所述引物对的碱基序列分别为SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5所示；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.6所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。

3.按照权利要求2所述的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的荧光报告基团包括FAM、HEX、ROX、CY3或CY5荧光报告基团；所述的荧光淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或BHQ3荧光淬灭基团。

4.按照权利要求2所述的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，组分(1)中各引物及探针的配比如下：SEQ ID No.1∶SEQ ID No.2∶SEQ ID No.3＝500nM∶500nM∶300nM。

5.按照权利要求2所述的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，组分(2)中各引物及探针的配比如下：SEQ ID No.4∶SEQ ID No.5∶SEQ IDNo.6＝500nM∶500nM∶400nM。

6.按照权利要求1-5任何一种所述的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还含有登革热病毒I型/II型的阳性参考品。

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