CN105420411A - 一种肠道病毒通用型、柯萨奇病毒a16型、肠道病毒71型核酸荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒，包括RNA提取溶液、RNA洗脱液、内标、PCR反应液、EV/CA16/EV71酶混合液、EV/CA16/EV71阳性对照品、EV/CA16/EV71阴性对照品；本试剂盒在同一样本中同时检测肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型三种肠道病毒，而不能检测出其他病原体RNA并且检测灵敏度可达400copie/ml，检测范围为4.0E+02～4.0E+08copies/ml，为早期诊断肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型感染提供可靠的实验证据。

Description

一种肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸荧光PCR检测试剂盒，尤其涉及肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒，属于手足口病的体外诊断领域。

背景技术

手足口病(Hand-foot-mouthdisease，HFMD)又名发疹性水疱口腔炎，是由一组肠道病毒引起的常见传染病，临床表现以发热和手、足、口腔等部位的皮疹为主要临床特征的一种急性传染病。绝大多数HFMD患者预后良好，一般可在5～7天痊愈，属于自限性疾病。病毒还可以侵犯呼吸系统、中枢神经系统等引起脑炎、肺水肿、弛缓性麻痹、心肌炎等症状，个别危重患儿可因多种原因导致死亡。该病全年均可发病，好发于夏秋季，常见于5岁以下的儿童。HFMD的主要传播途径是粪-口途径，亦可通过呼吸道传播。HFMD传染性强，易导致流行或暴发。HFMD分布极广泛，无严格地区性。HFMD全年均可发病，有明显的季节特点，以夏秋季多见。

引起HFMD的主要为小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A组的4型、5型、7型、9型、10型、16型；柯萨奇病毒B组的2型、5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)和肠道病毒71型。最常见为柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)及肠道病毒71型(EV71)。人对引起HFMD的肠道病毒普遍易感，各年龄组均可感染发病，但以隐性感染为主，隐性感染与显性感染之比约为100:1。由于机体受病毒感染后，产生的中和抗体可在体内存留较长时间，对同型病毒感染产生牢固的免疫力，因此，HFMD的患者主要为学龄前儿童，尤其是5岁以下儿童，占发病数90％以上。而大多数成人可携带病毒但不发病。1岁以内的儿童发生心肌炎、脑炎等重症的比例较1岁以上儿童高。

中国手足口病流行，1981年上海首次报道手足口病；1983年天津发生CoxA16引起的手足口病暴发；1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV71；1998年中国台湾地区129106例HFMD，其中405例为严重的中枢神经系统感染，78例死亡；1999年以来，中国广东、福建、上海、重庆等地区报告局部流行EV71感染；2007年山东临沂流行以EV71为主的手足口病；2008～2009年安徽阜阳、河南、山东等地大规模流行。主要为CoxA16和EV71共循环引起手足口病发，EV71在大部分省市为优势病毒。

实时荧光PCR技术(FQ-PCR)把PCR、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行。实时荧光PCR技术与其它检测技术相比具有以下优势：(1)与免疫学检测比较，具有更高的灵敏度，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以检测出来；(2)根据各种病原体独特的保守基因序列设计引物，能够保证PCR反应的高度特异性，避免交叉反应；(3)能对病毒进行定量检测，可反映出患者体内病原体拷贝数的高低和复制情况，定量检测有助于判断病原体感染与疾病发生和发展的关系，探讨药物对病原体的作用，了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况，这对理解发病机制和预测抗病毒治疗的有效性十分关键；(4)可扩大检测人群的范围，适用于大规模的流行病调查，对手足口病这类自然感染率极高的病原微生物尤其适用；(5)将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤；(6)全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染；(7)实时检测技术可连续不断的检测PCR过程中荣耀信号的变化，避免了传统PCR的“平台期效应”，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值算出，准确性和灵敏性都有提高。

国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测EV、CA16、EV71RNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒存在很多不足之处：(1)检测灵敏度低，约在1000copie/ml左右；检测范围窄，一般在1.00E+03copie/ml～1.00E+07copie/ml之间，对于临床高值(大于5.00E+07copie/ml)和低值(小于1.00E+03copie/ml)的样本无法检测；(2)对于CA16的不同亚型存在一定的漏检现象；(3)酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；(4)无法有效去除样本中的PCR抑制物(如：全血、痰液等)，体系中一般没有阳性内对照(即内标)，无法预防假阴性；(5)国外试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展；(6)国内大部分试剂只能做单管检测，检测3个型需要用三管反应液。

发明内容

本发明的目的在于解决现有肠道病毒通用型(EV)、柯萨奇病毒A16型(CA16)、肠道病毒71型(EV71)荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种RNA提取得率高、检测灵敏度高、检测范围宽而准确的EV/CA16/EV71核酸荧光PCR检测试剂盒，可以对咽拭子等未知样本中的肠道病毒RNA进行快速、准确检测，并且可以区分CA16、EV71基因型，检测结果可用于EV/CA16/EV71感染的辅助诊断。

本发明实施例中提供了一种肠道病毒通用型EV/柯萨奇病毒CA16型/肠道病毒EV71型核酸荧光PCR检测试剂盒，其包括以下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、内标、PCR反应液、EV/CA16/EV71酶混合液、EV/CA16/EV71阳性对照品、EV/CA16/EV71阴性对照品，其中，所述PCR反应液包括0.1μmol/L～0.5μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上下游引物EV-F、CA16-F、EV71-F与EV-R、CA16-R、EV71-R以及用于靶多核苷酸检测的探针EV-P、CA16-P、EV71-P，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：

EV上游引物EV-F：5′-GACATGGTGTGAAGAGCCTATTG-3′；

EV下游引物EV-R：5′-CGGACACCCAAAGTAGTCGG-3′；

EV探针EV-P：5′-CY5-CCCCTGAATGCGGCTAATCCTAAC-BHQ2-3’；

CA16上游引物CA16-F：5′-TATGTTAATTGGGACATTGATTTGA-3′；

CA16下游引物CA16-R：5′-ACCATTGGGTTTGGCTACG-3′；

CA16探针CA16-P：5′-FAM-ATATGCTCAGCTGCGGCGG-BHQ1-3′；

EV71上游引物EV71-F：5′-TCCCACATTCGGAGAACACA-3′；

EV71下游引物EV71-R：5′-AAGGGTACTTGGACTTGGAGGT-3′；

EV71探针EV71-P：5′-HEX-AGGAGAAAGATCTTGAATACGGGGC-BHQ1-3′。

优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述内标为插入pUC18T载体的一段长为90碱基对的人工合成DNA序列的重组体，其浓度为1.00E+03copies/ml～1.00E+06copies/ml；90碱基对的序列如下所示：

5′-CAGCTTGTTGTAACAAAGCATCCGCTCCCCCATTCATGTTGCTGGGTACAGACAGTTACCTCTCCACTAGGCAAATCTCAACAGGATCAG-3′。

优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述RNA提取溶液包括如下组分：

RNA提取溶液I：十二烷基硫酸钠，质量/体积0.3％～1.2％、曲拉通，体积/体积1.0％～5.0％，异硫氰酸胍0.1mol/L～1.2mol/L、50μg/ml～350μg/ml的磁珠；

RNA提取溶液II：4-羟乙基哌嗪乙磺酸150mmol/L～350mmol/L、pH6.5±0.2，氯化钠150mmol/L～400mmol/L；

RNA提取溶液III：曲拉通，体积/体积0.5％～3.0％、氯化钠100mmol/L～400mmol/L；

RNA提取溶液IV：矿物油。

优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述RNA洗脱液为Tris-HCl0.5mol/L～1.5mol/L、EDTA0.2mol/L～1.5mol/L。

优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述PCR反应液还包括5×PCR反应缓冲液10μl，2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.1μmol/L～0.4μmol/L用于检测内标的上下游引物IC-F与IC-R，0.1μmol/L～0.4μmol/L用于检测内标的探针IC-P。

优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述用于检测内标的上下游引物以及用于检测内标的探针，其碱基对序列分别为：

内标上游引物IC-F：5′-CAGCTTGTTGTAACAAAGCA-3′；

内标下游引物IC-R：5′-CTGATCCTGTTGAGATTTGCC-3′；

内标探针IC-P：5′ROX-CTCCCCCATTCATGTTGCTGGG-BHQ13′。

优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述EV/CA16/EV71酶混合液为mMLV酶10U/μl～150U/μl和H-TaqDNA聚合酶1U/μl～10U/μl。

优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述EV/CA16/EV71阳性对照品为经过标定的已知浓度的慢病毒，其浓度为1.00～5.00E+05copie/ml。

优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述EV/CA16/EV71阴性对照品为经过灭菌处理的生理盐水。

本发明实施例中提供了使用所述的检测试剂盒用于检测样本中EV/CA16/EV71-RNA的方法，包括如下步骤：

(1)试剂准备；

按照提取溶液I200μl～1ml/人份，EV/CA16/EV71-内标1μl/人份的比例，取相应量的RNA提取溶液I及EV/CA16/EV71-内标，充分混匀得提取溶液I-mix，瞬时离心后备用；

根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按照PCR反应液38μl/人份，EV/CA16/EV71-酶混合液2μl/人份的比例，取相应量的PCR反应液及EV/CA16/EV71-酶混合液，充分混匀，得PCR-mix，瞬时离心后备用；

(2)RNA提取：磁珠法提取EV/CA16/EV71-RNA；

S01裂解病毒：每个离心管中加入100μl～1mlRNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待测样本，盖上管盖，震荡混匀，瞬时离心后备用；

S02磁珠吸附核酸：在步骤S01瞬时离心后背埇的溶液中加入30μl～400μlRNA提取溶液II，震荡混匀，室温静置10～30分钟；

S03去除废液：静止结束瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出弃用，磁珠备用；

S04洗涤：在步骤S03中留有备用磁珠的离心管内加入200μl～1mlRNA提取溶液III和100μl～400μlRNA提取溶液IV，震荡混匀，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；

S05去除废液：将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃，磁珠备用；

S06洗脱核酸：在步骤S05留有备用磁珠的离心管内加入10μl～100ulRNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于分离器上2～5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；

S07点样：根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每个反应管加入40μlPCR-mix，并吸取步骤S06的新的灭菌离心管中已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照各10μl加入PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；

(3)荧光PCR反应：采用实时荧光定量PCR技术，CA16、EV71以病毒蛋白外壳VP1基因为扩增靶目标、肠道病毒通用型EV以5′非编码区为扩增靶目标，使用所述试剂盒，在实时荧光PCR仪上通过PCR扩增对待测样品中EV\CA16\EV71RNA进行定性检测；

(4)结果分析：选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测CA16；选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检测EV71；3)选择CY5通道(Reporter:CY5,Quencher:none)检测肠道病毒通用型；4)选择ROX通道(Reporter:ROX,Quencher:none)检测内标；利用仪器自带的软件进行自动分析或者手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析，然后记录样本Ct值结果，根据各样本Ct值大小，判断检测结果。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)磁珠法是近年发展迅速且被广泛应用的一种核酸提取方法，相对于传统方法具有下列优点：提取体积可变性大、吸附核酸专一性强、纯度高、可实现自动化操作；

(2)本发明以肠道病毒5′非编码区、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型衣壳蛋白基因为检测靶区，设计特异性引物和特异性荧光探针，经引物探针筛选，获得了检出率、特异性较好的引物探针，对反应体系进行了优化，试剂盒的扩增效率高、灵敏度好，获得了在1管反应液中同时检测肠道病毒、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型三种肠道病毒的反应体系；

(3)同时，对肠道病毒RNA的提取方法进行了优化，选择了吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性，检测灵敏度可达400copie/ml，检测范围为4.0E+02～4.0E+08copies/ml；

(4)设置了内标监控系统，在样本提取过程中增加了内标，利用内标监控RNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止检测结果出现假阴性；荧光PCR扩增结束后，经仪器自带软件自动分析样本的Ct值，可为灵敏、早期诊断肠道病毒通用型、柯萨奇病毒CA16型和肠道病毒EV71型感染提供可靠的实验证据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1.本发明实施例提供的肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒对EV/CA16/EV71近似病原体的检测(目标通道)；

图2.本发明实施例提供的肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒对EV/CA16/EV71近似病原体的检测(内标通道)；

图3.本发明实施例提供的肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒对EV梯度样本检测(EV通道)

图4.本发明实施例提供的肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒对CA16梯度样本检测(CA16通道)；

图5.本发明实施例提供的肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒对EV71梯度样本检测(EV71通道)；

图6.本发明实施例提供的肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒中EV参考品扩增曲线；

图7.本发明实施例提供的肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒中CA16参考品扩增曲线；

图8.本发明实施例提供的肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒中EV71参考品扩增曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种肠道病毒通用型EV/柯萨奇病毒A16型/肠道病毒EV71型核酸荧光PCR检测试剂盒，包括以下各组分：RNA提取溶液，RNA洗脱液，内标，PCR反应液，EV/CA16/EV71酶混合液，EV/CA16/EV71阳性对照品，EV/CA16/EV71阴性对照品，用于靶多核苷酸扩增的上下游引物EV-F、CA16-F、EV71-F与EV-R、CA16-R、EV71-R，用于靶多核苷酸检测的探针EV-P、CA16-P、EV71-P，用于检测内标的上下游引物IC-F与IC-R，用于检测内标的探针IC-P。

所述内标为插入pUC18T载体的一段长为90碱基对的人工合成DNA序列的重组体，其浓度为1.00E+03copies/ml～1.00E+06copies/ml；90碱基对的序列如下所示：

5′-CAGCTTGTTGTAACAAAGCATCCGCTCCCCCATTCATGTTGCTGGGTACAGACAGTTACCTCTCCACTAGGCAAATCTCAACAGGATCAG-3′。

所述RNA提取溶液包括如下组分：

RNA提取溶液I：十二烷基硫酸钠，质量/体积0.3％～1.2％、曲拉通，体积/体积1.0％～5.0％，异硫氰酸胍0.1mol/L～1.2mol/L、50μg/ml～350μg/ml的磁珠；

RNA提取溶液II：4-羟乙基哌嗪乙磺酸150mmol/L～350mmol/L、pH6.5±0.2，氯化钠150mmol/L～400mmol/L；

RNA提取溶液III：曲拉通，体积/体积0.5％～3.0％、氯化钠100mmol/L～400mmol/L；

RNA提取溶液IV：矿物油。

所述RNA洗脱液为Tris-HCl0.5mol/L～1.5mol/L、EDTA0.2mol/L～1.5mol/L。

所述PCR反应液为5×PCR反应缓冲液10μl，2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.1μmol/L～0.5μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上下游引物CA16-F、EV71-F与CA16-R、EV71-R，0.1μmol/L～0.5μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针CA16-P、EV71-P，0.1μmol/L～0.4μmol/L用于检测内标的上下游引物IC-F与IC-R，0.1μmol/L～0.4μmol/L用于检测内标的探针IC-P。

所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：

CA16上游引物CA16-F：5′-TATGTTAATTGGGACATTGATTTGA-3′；

CA16下游引物CA16-R：5′-ACCATTGGGTTTGGCTACG-3′；

CA16探针CA16-P：5′-FAM-ATATGCTCAGCTGCGGCGG-BHQ1-3′；

EV71上游引物EV71-F：5′-TCCCACATTCGGAGAACACA-3′；

EV71下游引物EV71-R：5′-AAGGGTACTTGGACTTGGAGGT-3′；

EV71探针EV71-P：5′-HEX-AGGAGAAAGATCTTGAATACGGGGC-BHQ1-3′。

所述用于检测内标的上下游引物以及用于检测内标的探针IC-P，其碱基对序列分别为：

内标上游引物IC-F：5′-CAGCTTGTTGTAACAAAGCA-3′；

内标下游引物IC-R：5′-CTGATCCTGTTGAGATTTGCC-3′；

内标探针IC-P：5′ROX-CTCCCCCATTCATGTTGCTGGG-BHQ13′。

所述EV/CA16/EV71酶混合液为mMLV酶10U/μl～150U/μl，H-TaqDNA聚合酶1U/μl～10U/μl。

所述EV/CA16/EV71阳性对照品为经过标定的已知浓度的假病毒，其浓度为1.00～5.00E+05copie/ml。

所述EV/CA16/EV71阴性对照：品为经过灭菌处理的生理盐水。

使用上述试剂盒检测肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型近似病原体，即腺病毒、流感病毒、EB病毒、巨细胞病毒、肺炎支原体、解脲脲原体、结核杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念球菌，具体检测步骤如下。

(1)试剂准备；

按照提取溶液I200μl～1ml/人份，EV/CA16/EV71-内标1μl/人份的比例，取相应量的RNA提取溶液I及EV/CA16/EV71-内标，充分混匀得提取溶液I-mix，瞬时离心后备用；

根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按照PCR反应液38μl/人份，EV/CA16/EV71-酶混合液2μl/人份的比例，取相应量的PCR反应液及EV/CA16/EV71-酶混合液，充分混匀，得PCR-mix，瞬时离心后备用；

(2)RNA提取：磁珠法提取EV\CA16\EV71-RNA；

S01裂解病毒：每个离心管中加入100μl～1mlRNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待测样本，盖上管盖，震荡混匀，瞬时离心后备用；

S02磁珠吸附核酸：在步骤S01瞬时离心后背埇的溶液中加入30μl～400μlRNA提取溶液II，震荡混匀，室温静置10～30分钟；

S03去除废液：静止结束瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出弃用，磁珠备用；

S04洗涤：在步骤S03中留有备用磁珠的离心管内加入200μl～1mlRNA提取溶液III和100μl～400μlRNA提取溶液IV，震荡混匀，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；

S05去除废液：将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃，磁珠备用；

S06洗脱核酸：在步骤S05留有备用磁珠的离心管内加入10μl～100ulRNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于分离器上2～5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；

S07点样：根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每个反应管加入40μlPCR-mix，并吸取步骤S06的新的灭菌离心管中已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照各10μl加入PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；

(3)荧光PCR反应：采用实时荧光定量PCR技术，CA16、EV71以病毒蛋白外壳VP1基因为扩增靶目标、肠道病毒通用型EV以5′非编码区为扩增靶目标，使用所述试剂盒，在实时荧光PCR仪上通过PCR扩增对待测样品中EV/CA16/EV71RNA进行定性检测；

荧光定量PCR反应条件为：

(4)结果分析：选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测CA16；选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检测EV71；选择CY5通道(Reporter:CY5,Quencher:none)检测肠道病毒通用型；选择ROX通道(Reporter:ROX,Quencher:none)检测内标；

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cyclethreshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果，按照表1进行：

表1

上述检测基于目标通道和内标通道的检测结果如图1和图2所示，由图中分析可知，腺病毒、流感病毒、EB病毒、巨细胞病毒、肺炎支原体、解脲脲原体、结核杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念球菌通过EV、CA16和EV71目标通道均为阴性，说明无交叉反应特异性良好，同时内标通道均为阳性，说明本实施例中的RNA提取和检测正常，不是假阴性结果，说明该试剂盒具有良好的特异性以及具有很高的准确性。

实施例2

本实施例提供一种肠道病毒通用型EV/柯萨奇病毒CA16型/肠道病毒EV71型核酸荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒的组成同实施例1相同，检测咽拭子样本中的EV-RNA、CA16-RNA和EV71-RNA，检测方法和步骤同实施例1相同。

其中，EV、CA16、EV71的浓度梯度均为4.0E+08copies/ml～4.0E+02copies/ml，EV梯度样本检测(EV通道)结果如图3所示，CA16梯度样本检测(CA16通道)结果如图4所示，EV71梯度样本检测(EV71通道)结果如图5所示。由图中分析可知，本检测试剂盒检测的CA16和EV71梯度样本目标通道均为阳性，说明该试剂盒对EV、CA16和EV71样本的检测范围为4.0E+08copies/ml～4.0E+02copies/ml。

实施例3

本实施例提供一种肠道病毒通用型EV/柯萨奇病毒A16型/肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒样本中的EV-RNA、CA16-RNA和EV71-RNA检测极限。该试剂盒的组成同实施例1相同，检测方法和步骤同实施例1相同。

其中，EV参考品扩增曲线(EV通道)结果如图6所示，CA16参考品扩增曲线(CA16通道)结果如图7所示，EV71参考品扩增曲线(EV71通道)结果如图8所示，EV参考品、CA16参考品和EV71参考品的浓度均为400copies/ml。由图中分析可知，本检测试剂盒检测EV、CA16和EV71检的测灵敏度参考品20次均为阳性，说明该试剂盒对EV、CA16和EV71的检测灵敏度为400copies/ml。

实施例4

本实施例提供一种肠道病毒通用型EV/柯萨奇病毒A16型/肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒的临床应用。

本试剂盒与已上市的同类产品进行临床样本的检测结果对比如表2-表4所示：

表2

表3

表4

一致率统计如表5所示：

表5

	三联检EV	三联检EV71	三联检CA16
				阳性一致率	100％	100％	100％
阴性一致率	82.76％	98.23％	99.38％
				总一致率	97.65％	99.06％	99.53％

通过临床样本的对比检测可以看出，该发明试剂盒有较好的临床应用价值。

综上分析可知，本发明提供的肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒在同一样本中同时检测肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型三种肠道病毒，而不能检测出其他病原体RNA，采用磁珠法提取RNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性，检测灵敏度可达400copie/ml，检测范围为4.0E+02～4.0E+08copies/ml，为早期诊断肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型感染提供可靠的实验证据。

Claims (10)

1.一种肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、内标、PCR反应液、EV/CA16/EV71酶混合液、EV/CA16/EV71阳性对照品、EV/CA16/EV71阴性对照品，其中，所述PCR反应液包括用于靶多核苷酸扩增的上下游引物EV-F、CA16-F、EV71-F与EV-R、CA16-R、EV71-R以及用于靶多核苷酸检测的探针EV-P、CA16-P、EV71-P，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：

EV上游引物EV-F：5′-GACATGGTGTGAAGAGCCTATTG-3′；

EV下游引物EV-R：5′-CGGACACCCAAAGTAGTCGG-3′；

EV探针EV-P：5′-CY5-CCCCTGAATGCGGCTAATCCTAAC-BHQ2-3’；

CA16上游引物CA16-F：5′-TATGTTAATTGGGACATTGATTTGA-3′；

CA16下游引物CA16-R：5′-ACCATTGGGTTTGGCTACG-3′；

CA16探针CA16-P：5′-FAM-ATATGCTCAGCTGCGGCGG-BHQ1-3′；

EV71上游引物EV71-F：5′-TCCCACATTCGGAGAACACA-3′；

EV71下游引物EV71-R：5′-AAGGGTACTTGGACTTGGAGGT-3′；

EV71探针EV71-P：5′-HEX-AGGAGAAAGATCTTGAATACGGGGC-BHQ1-3′。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述内标为插入pUC18T载体的长为90碱基对的人工合成DNA序列的重组体，其浓度为1.00E+03copies/ml～1.00E+06copies/ml；90碱基对的序列如下所示：

5′-CAGCTTGTTGTAACAAAGCATCCGCTCCCCCATTCATGTTGCTGGGTACAGACAGTTACCTCTCCACTAGGCAAATCTCAACAGGATCAG-3′。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA提取溶液包括如下组分：

RNA提取溶液I：十二烷基硫酸钠，质量/体积0.3％～1.2％、曲拉通，体积/体积1.0％～5.0％，异硫氰酸胍0.1mol/L～1.2mol/L、50μg/ml～350μg/ml的磁珠；

RNA提取溶液II：4-羟乙基哌嗪乙磺酸150mmol/L～350mmol/L、pH6.5±0.2，氯化钠150mmol/L～400mmol/L；

RNA提取溶液III：曲拉通，体积/体积0.5％～3.0％、氯化钠100mmol/L～400mmol/L；

RNA提取溶液IV：矿物油。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA洗脱液为Tris-HCl0.5mol/L～1.5mol/L、EDTA0.2mol/L～1.5mol/L。.

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括5×PCR反应缓冲液10μl，2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.1μmol/L～0.4μmol/L用于检测内标的上下游引物IC-F与IC-R，0.1μmol/L～0.4μmol/L用于检测内标的探针IC-P。

6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述用于检测内标的上下游引物以及用于检测内标的探针，其碱基对序列分别为：

内标上游引物IC-F：5′-CAGCTTGTTGTAACAAAGCA-3′；

内标下游引物IC-R：5′-CTGATCCTGTTGAGATTTGCC-3′；

内标探针IC-P：5′ROX-CTCCCCCATTCATGTTGCTGGG-BHQ13′。

7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述EV/CA16/EV71酶混合液为mMLV酶10U/μl～150U/μl和H-TaqDNA聚合酶1U/μl～10U/μl。

8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述EV/CA16/EV71阳性对照品为经过标定的已知浓度的慢病毒，其浓度为1.00～5.00E+05copie/ml。

9.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述EV/CA16/EV71阴性对照：品为经过灭菌处理的生理盐水。

10.使用根据权利要求1-9任一项所述的检测试剂盒用于检测样本中EV/CA16/EV71-RNA的方法，包括如下步骤：

(1)试剂准备；

按照提取溶液I200μl～1ml/人份，EV/CA16/EV71-内标1μl/人份的比例，取相应量的RNA提取溶液I及EV/CA16/EV71-内标，充分混匀得提取溶液I-mix，瞬时离心后备用；

根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按照PCR反应液38μl/人份，EV/CA16/EV71-酶混合液2μl/人份的比例，取相应量的PCR反应液及EV/CA16/EV71-酶混合液，充分混匀，得PCR-mix，瞬时离心后备用；

(2)RNA提取：磁珠法提取EV/CA16/EV71-RNA；

S01裂解病毒：每个离心管中加入100μl～1mlRNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待测样本，盖上管盖，震荡混匀，瞬时离心后备用；

S02磁珠吸附核酸：在步骤S01瞬时离心后背埇的溶液中加入30μl～400μlRNA提取溶液II，震荡混匀，室温静置10～30分钟；

S03去除废液：静止结束瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出弃用，磁珠备用；

S04洗涤：在步骤S03中留有备用磁珠的离心管内加入200μl～1mlRNA提取溶液III和100μl～400μlRNA提取溶液IV，震荡混匀，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；

S05去除废液：将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃，磁珠备用；

S06洗脱核酸：在步骤S05留有备用磁珠的离心管内加入10μl～100ulRNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于分离器上2～5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；

S07点样：根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每个反应管加入40μlPCR-mix，并吸取步骤S06的新的灭菌离心管中已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照各10μl加入PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；

(3)荧光PCR反应：采用实时荧光定量PCR技术，CA16、EV71以病毒蛋白外壳VP1基因为扩增靶目标、肠道病毒通用型EV以5’非编码区为扩增靶目标，使用所述试剂盒，在实时荧光PCR仪上通过PCR扩增对待测样品中EV\CA16\EV71RNA进行定性检测；

(4)结果分析：选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测CA16；选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检测EV71；3)选择CY5通道(Reporter:CY5,Quencher:none)检测肠道病毒通用型；4)选择ROX通道(Reporter:ROX,Quencher:none)检测内标；利用仪器自带的软件进行自动分析或者手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析，然后记录样本Ct值结果，根据各样本Ct值大小，判断检测结果。