CN103710466B - 一种hbv的ymdd荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents
一种hbv的ymdd荧光pcr检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103710466B CN103710466B CN201310744594.2A CN201310744594A CN103710466B CN 103710466 B CN103710466 B CN 103710466B CN 201310744594 A CN201310744594 A CN 201310744594A CN 103710466 B CN103710466 B CN 103710466B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hbv
- ymdd
- probe
- yvdd
- yidd
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title abstract description 62
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title abstract 7
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 title abstract 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 71
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 49
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 42
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 24
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 23
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 23
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 15
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 7
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 claims description 7
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 claims description 5
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 claims description 3
- DBLXOVFQHHSKRC-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid;2-piperazin-1-ylethanol Chemical compound CCS(O)(=O)=O.OCCN1CCNCC1 DBLXOVFQHHSKRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 abstract description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 abstract description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 abstract 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 102100037111 Uracil-DNA glycosylase Human genes 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 5
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N lamivudine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 4
- 229960001627 lamivudine Drugs 0.000 description 4
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 4
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 108091036055 CccDNA Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700739 Hepadnaviridae Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940121657 clinical drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种HBV的YMDD荧光PCR检测试剂盒，包括两种PCR反应液和含磁珠的DNA提取溶液，其中一种PCR反应液中含YIDD上游引物、YIDD下游引物和YIDD探针，另一种PCR反应液中含YVDD上游引物、YVDD下游引物和YVDD探针。本发明提供的HBV YMDD荧光PCR检测试剂盒操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽。应用该试剂盒，可以对临床HBV血清等样本中的HBV YMDD DNA进行快速检测，为诊断HBV YMDD突变提供可靠的实验依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种HBV耐药突变的检测试剂盒，更具体涉及一种HBV的YMDD荧光PCR检测试剂盒；其目的是诊断含HBV的样本是否已经产生YMDD突变，且进一步的，还可定量检测已产生YMDD突变的HBV病毒比例。
背景技术
乙型肝炎病毒（HBV）简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科（hepadnavividae）。据估计，目前全球共有4亿慢性乙型肝炎病毒感染患者，我国是乙型肝炎的高发区，既往的流行病学调查结果显示，我国HBV的感染率为57.63%，乙肝表面抗原（HBsAg）携带率为9.75%，我国主要存在的HBV基因型为B型和C型。尽管HBV疫苗的广泛应用和婴幼儿计划免疫项目的推广对乙肝的预防起到了积极的作用，但HBV的治疗仍然是公众关注的棘手问题。
目前，治疗慢性乙型肝炎（CHB）主要是以干扰素和核苷（酸）类似物（NA）等药物进行抗病毒治疗，进而改善肝脏组织学病变。现在临床应用的主要有拉米夫定（LAM）等核苷类似物治疗CHB，类似物治疗的主要原理是其作用于HBV-DNA cccDNA的复制期，抑制前基因组RNA逆转录为HBV-DNA的负链以及正链的合成。由于不能直接作用于感染细胞的病毒cccDNA，所以需要长期用药来控制病毒复制。但是，长期使用核苷（酸）类似物治疗CHB可引起HBV聚合酶基因rt保守区发生点突变，并导致临床耐药。HBVYMDD突变的方式主要有两种：YIDD突变和YVDD突变，即酪氨酸－甲硫氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸（YMDD）中的甲硫氨酸密码子（M）突变为异亮氨酸（I）和缬氨酸（V）。
随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子生物学方法应用于检测HBV耐药突变，主要包括测序、基因芯片、探针杂交技术等。而随着FQ-PCR技术的发展，其在HBV突变诊断领域的应用已越来越广泛，也越来越为人所重视，HBV YMDD突变的实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性。
运用荧光PCR技术检测HBV YMDD突变主要包括HBV核酸提取和核酸PCR扩增两方面。
目前国外临床上主要采用DNA提取试剂盒来提取HBV核酸，提取效果较好，但是由于价格昂贵，难以在国内应用。
临床上检测HBV YMDD-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定量检测）。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术检测HBV YMDD DNA的试剂盒应用于临床检测中。但这些试剂盒所提供的HBV DNA提取方法主要是煮沸法，其核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低。且这些试剂盒的检测灵敏度不高，约在500IU左右；还因没有设置阳性内对照（即内标），无法监控假阴性；和一般没有预防PCR产物污染的措施。另外，受限于其引物探针序列，本领域还需开发出一种检测HBV YMDD DNA特异性好且综合性能优良的PCR检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于解决现有HBV YMDD核酸荧光PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的HBV YMDD荧光PCR检测试剂盒。应用该试剂盒，可以对临床HBV血清等样本中的HBV YMDD DNA进行快速检测，为诊断HBVYMDD突变提供可靠的实验依据。
因此，本发明提供一种HBV的YMDD荧光PCR检测试剂盒，包括两种PCR反应液和含磁珠的DNA提取溶液，其中一种PCR反应液中含YIDD上游引物、YIDD下游引物和YIDD探针，另一种PCR反应液中含YVDD上游引物、YVDD下游引物和YVDD探针，且所述引物和探针的序列为，
YIDD上游引物：5'-TAGGGCTTTCCCCCACTGT-3'，
YIDD下游引物：5'-ACAGACTTGGCCCCCAAAA-3'，
YIDD探针：5'-TTCAGTTATATAGATGATGTG-3'；
YVDD上游引物：5'-TAGGGCTTTCCCCCACT-3'，
YVDD下游引物：5'-ACAGACTTGGCCCCCAAAA-3'，
YVDD探针：5'-CTTTCAGTTATGTGGATGATG-3'。
在一种具体的实施方式中，所述试剂盒中还包含内标，且所述两种PCR反应液中均包含内标上游引物、内标下游引物和内标探针，所述内标序列及其引物和探针的序列为，
内标：5’-ATGGCATTTGCTGGAACAATCAGCTTTTTATTACCTGTGTTGATACTACCAGAAGTACCAATTTAACTATTAGCACTGCCACTGCTGCAGTTTCCCCAACATTTACTCCCAGTAACTTTAAGC-3’；
内标上游引物：5’-ATGGCATTTGCTGGAACAATCA-3’，
内标下游引物：5’-GCTTAAAGTTACTTGGAGTAAATGTTGG-3’，
内标探针：5’-GGAAACCGCAGCAGTGGCAGTG-3’。
优选的，本发明所述试剂盒包括如下组分，
①DNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸钠、曲拉通和异硫氰酸胍；
②DNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠和100～400μg/ml的磁珠；
③DNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化钠；
④DNA提取溶液Ⅳ：含矿物油；
⑤DNA洗脱液：含Tris-HCl和EDTA；
⑥内标；
⑦PCR反应液：包括所述的两种PCR反应液；
⑧酶混合液；
⑨HBV YMDD阳性对照；
⑩HBV YMDD阴性对照。
更优选的，所述试剂盒中还包括组分(11)，即用于定量检测YMDD突变的HBV YMDD定量参考品。
在本发明一种具体的实施方式中，所述PCR反应液中还均包括PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸。
本发明还提供一种上述试剂盒用于检测HBV的YMDD突变的方法，包括：
步骤1，裂解病毒：向多个离心管均加入组分①，再在不同的离心管中分别加入组分⑨、⑩、(11)和待测样本，离心；
步骤2，磁珠吸附核酸：向上述每个离心管中均加入组分②+⑥的混合液，并离心和用磁珠分离器进行固液分离，此时离心管壁上的固体含磁珠和DNA；
步骤3，洗涤：去除液体留下固体后，向每个离心管加入组分③和组分④，再经离心和用磁珠分离器进行固液分离，此时离心管壁上的固体含磁珠和DNA；
步骤4，DNA洗脱：去除液体留下固体后，向每个离心管加入组分⑤，将管壁的固体冲洗至管中，且使得磁珠和DNA在组分⑤的作用下洗脱分开，并再离心和用磁珠分离器进行固液分离，此时离心管壁上的固体为磁珠，DNA进入液体中；
步骤5，待荧光PCR分析：将上述离心管中的液体均各自转移至一个新的离心管中待用；取一定数量的PCR反应管，其中每管均加入组分⑦+⑧，再分别向不同的反应管中加入上述待用的⑨、⑩、(11)和待测样本；其中也可以先向PCR反应管中加入待用的⑨、⑩、(11)和待测样本，再向PCR反应管中均加入组分⑦+⑧；盖好管盖，用于荧光PCR分析。
本发明还提供一种HBV的YMDD荧光PCR检测试剂盒，包括两种PCR反应液，其中一种PCR反应液中含YIDD上游引物、YIDD下游引物和YIDD探针，另一种PCR反应液中含YVDD上游引物、YVDD下游引物和YVDD探针，且所述引物和探针的序列为，
YIDD上游引物：5'-TAGGGCTTTCCCCCACTGT-3'，
YIDD下游引物：5'-ACAGACTTGGCCCCCAAAA-3'，
YIDD探针：5'-TTCAGTTATATAGATGATGTG-3'；
YVDD上游引物：5'-TAGGGCTTTCCCCCACT-3'，
YVDD下游引物：5'-ACAGACTTGGCCCCCAAAA-3'，
YVDD探针：5'-CTTTCAGTTATGTGGATGATG-3'。
本发明还提供一种磁珠法核酸提取纯化方法在HBV的YMDD检测中的应用。
具体实施方式
实施例1
本实施例中提供一种本发明之HBV YMDD荧光PCR检测试剂盒，包括：
①DNA提取溶液Ⅰ：十二烷基硫酸钠0.2%～1.0%（质量/体积），曲拉通1.0%～4.0%(体积/体积)，异硫氰酸胍0.2mol/L～1.0mol/L。
②DNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸100～300mmol/L、pH6.5±0.2，氯化钠100～300mmol/L，磁珠100～400μg/ml。
③DNA提取溶液Ⅲ：曲拉通0.1%～1.0%(体积/体积)、氯化钠100～300mmol/L。
④DNA提取溶液Ⅳ：矿物油。
⑤DNA洗脱液：Tris-HCl0.8～1.2mol/L、EDTA0.1～1.0mol/L。
⑥内标（阳性内对照）：为插入pUC18T载体的一段长为123碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为1.00E+05copies/ml～5.00E+05copies/ml，作为PCR扩增体系中的阳性内对照，预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性；123碱基对的序列如下所示：
5’-ATGGCATTTGCTGGAACAATCAGCTTTTTATTACCTGTGTTGATACTACCAGAAGTACCAATTTAACTATTAGCACTGCCACTGCTGCAGTTTCCCCAACATTTACTCCCAGTAACTTTAAGC-3’。
⑦PCR反应液：包括两种PCR反应液，分别检测YIDD突变和YVDD突变。
YIDD突变检测反应液：10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物YMF-G1与YMR-G1，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针YIGP-1，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于内标片段扩增的上下游引物HPH51-F1与HPH51-R1，0.1μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的探针HPH51-P1。
YVDD突变检测反应液：10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物YMF-G2与YMR-G2，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针YVGP-2，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于内标片段扩增的上下游引物HPH51-F1与HPH51-R1，0.1μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的探针HPH51-P1。
所述10×PCR反应缓冲液包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2%(体积/体积)曲拉通溶液和10%(体积/体积)甲酰胺溶液；所述脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、dCTP、dUTP、dGTP或dTTP。
且上述引物和探针的碱基序列分别为：
YIDD上游引物YMF-G1：5'-TAGGGCTTTCCCCCACTGT-3'；
YIDD下游引物YMR-G1：5'-ACAGACTTGGCCCCCAAAA-3'；
YIDD探针YIGP-1：5'-FAM-TTCAGTTATATAGATGATGTG-BHQ1-3'；
YVDD上游引物YMF-G2：5'-TAGGGCTTTCCCCCACT-3'；
YVDD下游引物YMR-G2：5'-ACAGACTTGGCCCCCAAAA-3'；
YVDD探针YVGP-2：5'-FAM-CTTTCAGTTATGTGGATGATG-BHQ1-3'；
内标上游引物HPH51-F1：5’-ATGGCATTTGCTGGAACAATCA-3’；
内标下游引物HPH51-R1：5’-GCTTAAAGTTACTTGGAGTAAATGTTGG-3；
内标探针HPH51-P1：5’-HEX-GGAAACCGCAGCAGTGGCAGTG-BHQ1-3’。
⑧酶混合液耐热DNA聚合酶（Taq酶）1U/μl～5U/μl，尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶）0.05U/μl～0.2U/μl；其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用。
⑨HBV YMDD阳性对照：为临床医院收集的已灭活的强阳性HBV YMDD血清样本，经合格的HBV YMDD试剂盒检测并定值后，稀释至浓度为4.00E+05IU/ml，其中突然为YIDD和突然为YVDD的两种病毒的浓度均为4.00E+05IU/ml。
⑩HBV YMDD阴性对照：以灭菌阴性血清为待测样本，经合格的HBV YMDD试剂盒检测为阴性后作为HBV YMDD-阴性对照。
(11)HBV YMDD定量参考品：来源于使用HBV YMDD企业定量线性参考品L1～L5定值后的HBV YMDD强阳性质粒，其特征在于该HBV YMDD定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为4.00E+07IU/ml（A）、4.00E+06IU/ml（B）、4.00E+05IU/ml（C）、4.00E+04IU/ml（D），且其中相应突然为YIDD和突然为YVDD的两种质粒的浓度均为上述A～D值。
实施例2
将实施例1中的检测试剂盒用于检测HBV血清等待测样本中的HBV YMDD-DNA的操作步骤是：
一、在试剂准备区进行试剂准备
1.1取出两个包装盒（一个包装盒装DNA提取的相关试剂、另一个包装盒中装DNA检测的相关试剂，两个包装盒可成套出售）中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温后，混匀后备用；
1.2根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D数量，按比例取相应量的DNA提取溶液2（100μl/人份）及HBV YMDD内标（0.4μl/人份），充分混匀成DNA提取溶液2-mix，瞬时离心后备用。
1.3根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D数量，按比例取相应量的HBV YMDD PCR反应液（不同管中分别取YIDD PCR反应液44μl/人份和YVDD PCR反应液44μl/人份）及酶混合液（1μl/人份），充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用，并分别标记为PCR-mix-I和PCR-mix-V。
1.4将上述准备好的试剂转移至样本处理区，待用。
二、在样本处理区进行样本处理（阴性对照、阳性对照、定量参考品与待测样本同步处理）
2.1取多个1.5ml灭菌离心管，分别标记为阴性对照、阳性对照、定量参考品A～D及待测样本，每管加入300μl DNA提取溶液1；
2.2每管分别加入200μl待测样本或阴性对照、阳性对照、定量参考品A～D；盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；
2.3将DNA提取溶液2-mix充分混匀后每次吸取100μl加入上述每个离心管中，震荡混匀10秒钟后室温静置10分钟；
2.4瞬时离心后将离心管置于磁珠分离器上，3分钟后固液完全分离，再缓慢将溶液吸出（注意不要碰到吸附于管壁的棕色物）；
2.5向上述每管各加入600μl DNA提取溶液3和200μl DNA提取溶液4，震荡混匀5秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于磁珠分离器上；
2.6约3分钟后固液完全分离，且上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1分钟后将管底残余液体完全吸出丢弃。
2.7向上述各离心管中均加入10μl～100ul DNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗到管底，吸打混匀3～4次，室温静置5～30分钟后，此时DNA已从磁珠上洗脱下来，将离心管再次置于磁珠分离器上2～5分钟使得固液完全分离，然后将洗脱下来的DNA（存在于液体中）吸至新的1.5ml灭菌离心管中。
2.8根据待测样本、阴性对照、阳性对照和定量参考品A～D的数量，每个PCR反应管加入45μlPCR-mix。（如果待测样本为3个，阴性对照、阳性对照各1个，定量参考品A～D共4个，则在9根PCR反应管中加入PCR-mix-I，在另外9根PCR反应管中加入PCR-mix-V。）吸取上述已处理的样本DNA、阴性对照、阳性对照和定量参考品A～D各5μl加入PCR-mix中，盖好管盖。也可在PCR反应管中先加入上述已处理的样本DNA、阴性对照、阳性对照和定量参考品A～D，再向PCR反应管中加入PCR-mix-I或PCR-mix-V。
三、在扩增与分析区进行PCR扩增（参照各仪器使用说明书进行设置）
3.1将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照、定量参考品A～D以及待测样本，并设置样本名称及定量参考品浓度。
3.2荧光检测通道选择（以ABI7300仪器为例）：选择FAM（Reportere:FAM,Quencher:None）检测通道检测阴性对照、阳性对照、定量参考品A～D以及待测样本；选择HEX或VIC通道（Reporter:VIC,Quencher:None）检测HBV YMDD内标。参比荧光（Passive Reference）设置为ROX。
3.3循环参数设定见表1，设置完毕后，保存文件，运行反应程序。
表1
3.4结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析（也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析），然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct（即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值）。如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且Ct≤39，可以判为HBVYMDD-DNA阳性；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示（Undet）显示，可以判为HBVYMDD-DNA阴性。相应的定值分析为使用PCR-mix-I和PCR-mix-V检测得到的定值之和，如果定量分析得到的结果是HBV YMDD突变概率已经很高，则需要更换拉米夫定以外的药物进行治疗。也就是说，本发明的检测结果可作为临床对乙型肝炎患者接受拉米夫定抗病毒治疗过程中病毒突变情况检测的参考，用做临床辅助诊断。
本发明可检测出HBV突变（包括YIDD突变和YVDD突变），但不能检测出非HBVYMDD突变，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。同时，本发明对HBV YMDD-DNA的提取方法进行了比较和优化，选择了吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取DNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性，检测灵敏度可达100IU/ml。另外，对PCR反应体系进行了优化组合，利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性；在样本提取过程中增加了内标，利用内标监控DNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性。
另外，使用本发明的试剂盒检测企业工作参考品，阴阳性参考品符合率为100%，灵敏度参考品的检测结果符合质量标准。且本发明试剂盒的精密度试验表明：批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数<10%，浓度变异系数<50%。而对本发明试剂盒的特异性试验表明：本试剂盒与HCV、HIV、HBV野生型（未发生YMDD突变）、HCMV、EBV等样本无交叉反应。而本发明试剂盒对临床样本的检测试验表明：本发明试剂盒的定量线性范围为100IU/ml～4.00E+09IU/ml，检测下限即灵敏度为100IU/ml。
Claims (4)
1.一种HBV的YMDD荧光PCR检测试剂盒，包括两种PCR反应液和含磁珠的DNA提取溶液，其中一种PCR反应液中含YIDD上游引物、YIDD下游引物和YIDD探针，另一种PCR反应液中含YVDD上游引物、YVDD下游引物和YVDD探针，且所述引物和探针的序列为，
YIDD上游引物：5'-TAGGGCTTTCCCCCACTGT-3'，
YIDD下游引物：5'-ACAGACTTGGCCCCCAAAA-3'，
YIDD探针：5'-TTCAGTTATATAGATGATGTG-3'；
YVDD上游引物：5'-TAGGGCTTTCCCCCACT-3'，
YVDD下游引物：5'-ACAGACTTGGCCCCCAAAA-3'，
YVDD探针：5'-CTTTCAGTTATGTGGATGATG-3'；
所述试剂盒中还包含内标，且所述两种PCR反应液中均包含内标上游引物、内标下游引物和内标探针，所述内标序列及其引物和探针的序列为，内标：
5’-ATGGCATTTGCTGGAACAATCAGCTTTTTATTACCTGTGTTGATACT
ACCAGAAGTACCAATTTAACTATTAGCACTGCCACTGCTGCAGTTTCCCCAACATTTACTCCCAGTAACTTTAAGC-3’；
内标上游引物：5’-ATGGCATTTGCTGGAACAATCA-3’，
内标下游引物：5’-GCTTAAAGTTACTTGGAGTAAATGTTGG-3’，
内标探针：5’-GGAAACCGCAGCAGTGGCAGTG-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括如下组分，
①DNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸钠、曲拉通和异硫氰酸胍；
②DNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠和100～400μg/ml的磁珠；
③DNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化钠；
④DNA提取溶液Ⅳ：含矿物油；
⑤DNA洗脱液：含Tris-HCl和EDTA；
⑥PCR反应液：包括所述的两种PCR反应液；
⑦酶混合液；
⑧HBV YMDD阳性对照；
⑨HBV YMDD阴性对照。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括组分(11)，即用于定量检测YMDD突变的HBV YMDD定量参考品。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中还均包括PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310744594.2A CN103710466B (zh) | 2013-12-30 | 2013-12-30 | 一种hbv的ymdd荧光pcr检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310744594.2A CN103710466B (zh) | 2013-12-30 | 2013-12-30 | 一种hbv的ymdd荧光pcr检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103710466A CN103710466A (zh) | 2014-04-09 |
| CN103710466B true CN103710466B (zh) | 2015-04-08 |
Family
ID=50403816
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310744594.2A Active CN103710466B (zh) | 2013-12-30 | 2013-12-30 | 一种hbv的ymdd荧光pcr检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103710466B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105603122A (zh) * | 2016-01-22 | 2016-05-25 | 上海同科生物科技有限公司 | 一种乙型肝炎病毒ymdd基因突变检测试剂盒 |
| CN110656204A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-01-07 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种乙型肝炎病毒ymdd基因突变检测试剂盒及检测方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1710098A (zh) * | 2004-06-16 | 2005-12-21 | 上海复星医学科技发展有限公司 | 一种检测拉米夫定耐药hbv dna的方法及试剂盒 |
| CN1737164A (zh) * | 2004-08-27 | 2006-02-22 | 上海复旦悦达生物技术有限公司 | 一种快速检测乙型肝炎病毒耐药基因变异的方法 |
| CN101701267A (zh) * | 2009-11-26 | 2010-05-05 | 戴立忠 | 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 |
| CN102796828A (zh) * | 2007-10-30 | 2012-11-28 | 株式会社东芝 | 用于检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的核酸引物组、测定试剂盒及检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的方法 |
-
2013
- 2013-12-30 CN CN201310744594.2A patent/CN103710466B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1710098A (zh) * | 2004-06-16 | 2005-12-21 | 上海复星医学科技发展有限公司 | 一种检测拉米夫定耐药hbv dna的方法及试剂盒 |
| CN1737164A (zh) * | 2004-08-27 | 2006-02-22 | 上海复旦悦达生物技术有限公司 | 一种快速检测乙型肝炎病毒耐药基因变异的方法 |
| CN102796828A (zh) * | 2007-10-30 | 2012-11-28 | 株式会社东芝 | 用于检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的核酸引物组、测定试剂盒及检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的方法 |
| CN101701267A (zh) * | 2009-11-26 | 2010-05-05 | 戴立忠 | 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Mutation analysis of lamivudine resistant hepatitis B virus strains by TaqMan PCR;Sebastian Malmstrom等;《Journal of Virological Methods》;20070409;第143卷;第147-152页 * |
| 乙型肝炎病毒耐药及其防治;刘映霞;《中国感染控制杂志》;20070930;第6卷(第5期);第289-291页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103710466A (zh) | 2014-04-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101701267B (zh) | 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 | |
| CN102174660B (zh) | 乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN102154510B (zh) | 丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 | |
| CN103060451B (zh) | 一种肺炎支原体mp检测试剂盒 | |
| CN103060473B (zh) | 一种疱疹类病毒ebv检测试剂盒 | |
| CN103725799B (zh) | 一种检测风疹病毒rna的方法及试剂盒 | |
| CN103642941A (zh) | 一种乙型肝炎病毒（hbv）核酸定量检测试剂盒 | |
| CN102146487B (zh) | 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针 | |
| CN103740832B (zh) | 一种新型隐球菌检测试剂盒 | |
| CN103710465B (zh) | 一种乙型肝炎病毒基因分型pcr检测试剂盒 | |
| CN104846122A (zh) | 肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型核酸检测试剂盒(荧光pcr法) | |
| CN105441589A (zh) | 人副流感病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型四重pcr检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN103710464B (zh) | 一种丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒 | |
| CN103710338A (zh) | 一种人类全血白细胞中dna提取试剂盒 | |
| CN103122396B (zh) | 一种人巨细胞病毒hcmv检测试剂盒 | |
| CN102586473A (zh) | 一种乙型肝炎病毒基因分型pcr检测试剂盒 | |
| CN101550455A (zh) | 人副流感病毒分型及定量检测试剂盒 | |
| CN103773897A (zh) | 一种用于丙型肝炎病毒核酸检测和基因分型的多重荧光pcr检测试剂盒及其应用 | |
| CN103725800B (zh) | 一种人腺病毒检测试剂盒 | |
| CN103710466B (zh) | 一种hbv的ymdd荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN114250325A (zh) | 快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法 | |
| CN100422344C (zh) | 乙型肝炎病毒基因分型的荧光pcr检测方法及其试剂盒 | |
| CN105039599A (zh) | 分型定性检测乙型肝炎病毒的引物、探针及试剂盒 | |
| CN102851394B (zh) | 一种检测肠道病毒71型rna的方法及试剂盒 | |
| CN105420411A (zh) | 一种肠道病毒通用型、柯萨奇病毒a16型、肠道病毒71型核酸荧光pcr检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: HUNAN SHENGWEIER MEDICAL INSPECTION CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: HUNAN SHENGXIANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20141119 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20141119 Address after: 410012, No. 680, Lu Song Road, Changsha hi tech Development Zone, Hunan Applicant after: Hunan company limited of Sheng Weier medical test institute Address before: 410012 No. 680, Lu Song Road, hi tech Industrial Development Zone, Hunan, Changsha Applicant before: Sansure Biotech Inc. |
|
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Dai Lizhong Inventor after: Wu Kang Inventor after: Deng Zhongping Inventor before: Dai Lizhong Inventor before: Wu Kang Inventor before: Deng Zhongping Inventor before: Wang Jun |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: DAI LIZHONG WU KANG DENG ZHONGPING WANG JUN TO: DAI LIZHONG WU KANG DENG ZHONGPING |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: HUNAN SHENGXIANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: HUNAN SHENGWEIER MEDICAL INSPECTION CO., LTD. Effective date: 20150526 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150526 Address after: 410012, No. 680, Lu Song Road, hi tech Development Zone, Hunan, Changsha Patentee after: Sansure Biotech Inc. Address before: 410012, No. 680, Lu Song Road, Changsha hi tech Development Zone, Hunan Patentee before: Hunan company limited of Sheng Weier medical test institute |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: YMDD (Tyrosine-Methionine-aspartate-aspartate) fluorescence PCR (Polymerase Chain Reaction) detection kit for HBV (Hepatitis B Virus) Effective date of registration: 20170711 Granted publication date: 20150408 Pledgee: Ningbo free trade zone Terry with equity investment partnership (limited partnership)|Suzhou equity equity investment center (limited partnership)|Ningbo Meishan Bonded Port District, Jun and equity investment partnership (limited partnership)|Chen Bang Pledgor: Hunan Gene Technology Co.|Hunan San Xiang Biological Technology Co. Ltd. Registration number: 2017430000042 |
|
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 410012 No. 680, Lu Song Road, hi tech Industrial Development Zone, Hunan, Changsha Patentee after: Shengxiang Biotechnology Co., Ltd Address before: 410012, No. 680, Lu Song Road, hi tech Development Zone, Hunan, Changsha Patentee before: Sansure Biotech Inc. |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20200217 Granted publication date: 20150408 Pledgee: Suzhou Lirui equity investment center (limited partnership)|Triton equity investment partnership (limited partnership)|JUNHE Tongrui equity investment partnership (limited partnership)|Chenbang Pledgor: SANSURE BIOTECH Inc. Registration number: 2017430000042 |