CN1710098A - 一种检测拉米夫定耐药hbv dna的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测HBV DNA的方法及其试剂盒，特别是涉及拉米夫定耐药性的检测。根据耐药相关两种主要的突变基因(YMDD突变为YVDD和YIDD)设计特异性突变检测引物和病毒特异性引物及公用的配套探针，或设计特异性突变检测探针和病毒特异性检测探针，分别在三个PCR管中通过相同的PCR程序对同一样本进行实时荧光检测。根据I反应管、V反应管检测Ct值分别与C反应管检测Ct值的差值(ΔCt－i＝Ct－i－Ct－c，ΔCt－v＝Ct－v－Ct－c)，对临床样本中HBV病毒发生YVDD和YIDD耐药突变情况进行判断。本发明的试剂盒性能稳定、灵敏度高于测序，能更精确判断耐药和敏感病毒的共存比例关系，适用于对耐药病毒和总病毒数量关系进行半定量分析。

Description

一种检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测HBV DNA的方法及其试剂盒，特别是涉及应用荧光标记探针及特异性引物进行乙肝病毒拉米夫定(Lamivudine)耐药性的检测。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)流行世界各地，估计全球有20亿人感染，其中慢性感染者3.5亿，我国约占半数，全球每年约有100万人死于HBV感染。此种感染最终可发展为肝硬化、肝癌，是当前WHO公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。

目前对HBV感染的治疗主要有干扰素和拉米夫定。干扰素疗程长、总的应答率较低，非选择病人中仅有20％～30％乙肝病毒e抗原(HBeAg)消失，经过筛选的病人疗效也仅有40％～60％的疗效，且价格昂贵以及需长期肌肉注射给药，副作用明显，临床应用范围较为狭窄。拉米夫定是治疗乙型肝炎的有效核苷类药物，已在全球广泛使用，在中国已成为销量最大的处方药。

拉米夫定是嘌呤核苷类药物，它是HBV复制强有力的抑制剂。能够与HBV脱氧核糖核酸(DNA)多聚酶C区YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)结构域特异性结合，从而起到抑制病毒复制的作用。正因为拉米夫定只能抑制病毒的复制而不能杀灭病毒，因此，一般推荐的治疗方法是长期持续给药。但长期使用拉米夫定会引起HBV的DNA多聚酶基因的YMDD结构域发生突变，DNA多聚酶功能改变，拉米夫定失去HBV复制抑制功能，从而逐渐产生临床常见的HBV拉米夫定耐药。拉米夫定耐药主要是由HBV P基因C区YMDD变异所引起，YMDD变异分为两种，一种是HBV P基因第550位氨基酸由Met突变为Val，此乃YVDD变异；另一种是HBV P基因第550位氨基酸由Met突变为Ile，此乃YIDD变异。另外YVDD突变时常伴有528位的突变(核苷酸A669→C，使氨基酸由Leu528→Met)。YVDD和YIDD两种变异分别由HBV第739位碱基A→G和741位G→T突变所引起。大量的临床流行病学研究证实，使用拉米夫定六个月后，病毒变异株开始明显增多。使用一年以上的人群中，其耐药突变的发生率约17-45％，使用三年以上的人群耐药突变发生率达到60％。拉米夫定对耐药突变株复制的抑制作用减弱万倍以上，临床表现为降低的HBV DNA反跳，伴转氨酶(ALT)水平升高。根据目前的研究，HBV P基因C区一些基因发生变异后，可能使乙肝的病情加重，容易发性重型肝炎。故临床大量、广泛地使用拉米夫定及其类似药，需要动态地监测病毒基因的变异情况，以便及时调整和更改治疗方案。

HBV耐药突变基因有其独特的特点：1、耐药突变位点处于高突变区，其附近有很多非耐药的突变；2、患者体内的HBV病毒发生耐药突变是个缓慢而动态的过程，大部分患者体内同时含有耐药毒株和敏感毒株，只是各自的比例各不相同，拉米夫定对患者的治疗效果是由耐药毒株与敏感毒株之间的比例关系而不是它们的绝对数量决定的，临床上，常将耐药毒株占总HBV病毒含量10％作为耐药的界限，高于10％，认为病毒产生拉米夫定耐药，且拉米夫定治疗不能控制HBV病毒的复制；否则认为病毒依然敏感，接受拉米夫定治疗能很好控制HBV病毒的总量。正是基于HBV耐药基因突变的这两个特点，虽然，目前用于突变检测的技术包括有基因芯片、TaqMan(荧光基团双标记水解寡核苷酸探针)、Molecular Beacon(即分子信标，是一个发夹样结构的特异寡核苷酸探针，其环状区核苷酸序列与靶核酸互补，靠近两端的部分序列互补构成分子信标的茎部，两末端分别标记荧光基团与淬灭基团)、LCR(连接酶链式反应)、酶切RFLP、熔点曲线以及SSCP、基因测序等传统方法，但除我们特别设计的TaqMan探针和特异性引物检测体系外，仅有测序、熔点曲线、基因芯片和PCR-Elisa在部分科研领域和临床得以应用，而且它们都有各自的缺陷，广泛的应用受到限制。

测序法一度被视为突变检测的金标准。但一方面，测序反应灵敏度低导致假阴性率较高。另一方面，由于HBV耐药菌与敏感菌常共存于患者血清中，对于HBV耐药突变基因的检测，该方法有致命的缺陷。椐了解，当耐药株低于50％时，随耐药毒株比例的下降，基因测序的假阴性率迅猛增高，而实际临床中，当耐药毒株占总病毒10％以上时，拉米夫定已对该患者失去了疗效。

基因芯片是近年新起的一项技术，在高通量等方面有着其他技术无与伦比的优势，但重复性差、易污染、操作复杂的缺点及其昂贵的价格也使这项技术的推广受到严重制约，特别是对于突变位点不多的HBV耐药基因的检测。

熔点曲线法是利用特异性探针与靶序列结合，分析Tm值改变的原理进行突变。它具有很多TaqMan的优势，包括操作简便、成本低廉、灵敏度高等特点，但熔点曲线法有个显著的特点，就是特异性差，也就是说熔点曲线法无法正确区分待检基因突变和临近位点突变，该技术只能应用在附近区域非常保守的突变检测。HBV P基因为突变高发区域，除导致耐药的550位密码子发生YIDD和YVDD突变外，附近还有很多不导致耐药的基因突变。熔点曲线法应用在该项目上势必造成较高的假阳性率。另外，针对HBV耐药毒株与敏感毒株共存问题，熔点曲线也无法对敏感株和耐药株的比例关系进行准确鉴别，在临床上不能正确指导用药。

PCR-ELISA法，虽价格便宜，但烦琐的操作步骤及容易污染的特点已渐渐不为人们接受，另外，对于耐药共生的情况，PCR-ELISA也不能作出正确判断。

TaqMan PCR技术作为一种快速诊断技术，具有特异性高、灵敏度高、操作简便且价格较便宜等优点，已在科研和临床上得到广泛的应用。使用常规TaqMan技术进行HBV耐药基因检测设计，由于550位点两种突变的位置相隔很近(中间只各1个碱基)，不利于设计引物，同时，需合成较多简并引物以提高检出率，成本较高，反应体系也很难稳定，并且与其他技术一样无法对病毒的共生关系进行准确判断。所以，尽管TaqMan PCR技术已成功应用在如HBV定量等多项研究中，但使用本发明类似的技术方案在乙肝病毒耐药检测研究中的应用国内外尚未见报道，更未有引入ΔCt值概念对耐药毒株与敏感型病毒株间的共存关系进行半定量分析的报道。

目前现有的技术对准确掌握患者血清中YMDD、YIDD和YVDD的动态变化，进一步指导临床用药没有理想的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法及试剂盒，以克服现有技术对耐药毒株和敏感毒株的检出率低，成本较高和反应体系不稳定的缺陷。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

提供一种检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法，即在PCR过程中使用以下多聚核苷酸：

引物1(上游引物)5’TGTATTCCCATCCCATCATCCT 3’、

引物2(HBV检测引物1)5’ATGTTGTACAGATTTGGTCCC 3’、

引物3(HBV检测引物2)5’TTGGCTTCCAGTACCACATCATC 3’、

引物4(YIDD检测引物1)5’CCCCAGTACCACATCATCA 3’、

引物5(YIDD检测引物2)5’CCCAGAACCACATCATCA 3’、

引物6(YVDD检测引物1)5’CCCAGTACCACATCATTCAC 3’、

引物7(YVDD检测引物2)5’CCCAGAACCACATCATTCAC 3’、

探针15’TCCTATGGGAGTGGGCCTCAG 3’、

探针25’CCATTTGTTCGGTGGTTCGTAG 3’、

探针3(I)5’ACCACATCATCAATATAACTGAAAGCC 3’、

或探针4(V)5’ACCACATCATCCACATAACTGAAAGC 3’、

或者与上述序列同源性大于75％的序列、或者上述所有序列的碱基互补序列，使用其中的任意一种或一种以上的组合。

提供上述的检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法的一种优选方案，即标记上述探针的荧光发光基团为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的任意一种或一种以上的组合；荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一种或一种以上的组合。

提供上述的检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法的另一种优选方案，即在上述各探针序列经添加互补臂形成的分子信标探针。

本发明还提供上述引物和探针在PCR反应过程中的使用方法，即分三管在同一时间运行同一PCR扩增程序，进行实时荧光检测，三管均使用探针1、探针2中任一探针和引物1，并分别添加其他相应引物，序列分别为：

第一管(C反应管)：引物2或引物3；

第二管(I反应管)：引物4和引物5；

第三管(V反应管)：引物6和引物7。

或者，用另一种使用方法为，分三管在同一时间运行同一PCR扩增程序，进行实时荧光检测，三管均使用引物1和引物2并分别添加相应探针，序列分别为：

第一管(C反应管)：探针1或探针2；

第二管(I反应管)：探针3；

第三管(V反应管)：探针4。

本发明还提供上述技术方案中任意一种的检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法的结果数据处理方案，即根据I反应管检测Ct值(Ct-i)与C反应管检测的Ct值(Ct-c)的差值(ΔCt-i＝Ct-i-Ct-c)(其中，Ct值的“C”代表Cycle，“t”代表threshold，其含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)、V反应管检测Ct值(Ct-v)与C反应管检测的Ct值(Ct-c)的差值(ΔCt-v＝Ct-v-Ct-c)，由此分别判断样本里HBV病毒中DNA发生YIDD突变和发生YVDD突变的病毒相对量，最终判断样本里病毒的耐药情况。

在上述检测拉米夫定耐药HBV DNA方法的基础上，本发明进一步提供一种检测试剂盒

1，其组成包括：

核酸提取试剂

核酸扩增试剂，其组成包括：

        C反应液

        I反应液

        V反应液

        荧光探针

        耐热DNA聚合酶

对照品

        I/V阳性对照品

        阴性对照品

其中，C反应液使用的引物序列为引物1、引物2或(和)引物3；

I反应液使用的引物序列为引物1、引物4和引物5；

V反应液使用的引物序列为引物1、引物6和引物7；

荧光探针序列为探针1，其5`端用FAM标记，其3`端用TAMRA标记。

PCR运行程序：反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→53℃30秒循环40次。

在上述检测拉米夫定耐药HBV DNA方法的基础上，本发明进一步提供一种检测试剂盒

2，其组成包括：

核酸提取试剂

核酸扩增试剂

        PCR反应液

        荧光标记探针A

        荧光标记探针B

        荧光标记探针C

        耐热DNA聚合酶

对照品

        I/V阳性对照品

        阴性对照品

其中，PCR反应液使用的引物序列为引物1、引物2；

荧光标记探针A序列为探针1或和探针2；

荧光标记探针B序列为探针3；

荧光标记探针C序列为探针4；

荧光标记探针序列的5`端均用FAM标记、3`端均用TAMRA标记。

PCR运行程序：反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→53℃30秒 循环40次

本发明还提供在三个PCR管中，通过相同的聚合酶链式反应程序，对同一样本进行实时荧光检测后的结果处理方法：

C反应管使用HBV病毒DNA特异性检测引物及相应探针，或使用HBV病毒DNA特异性检测探针及相应引物，能扩增所有型别的HBV DNA，其Ct值反映样本中总的HBV病毒DNA的浓度；

I反应管使用YIDD特异性突变检测引物及相应探针或使用YIDD特异性突变检测探针及相应引物，能特异性扩增扩增YIDD突变的DNA而因其3`端与YVDD突变的基因序列不同，退火温度(表现为Tm值)低于PCR扩增过程中的退火温度而不能进行延伸，因此不能产生荧光信号。其Ct值反映样本中HBV病毒发生YIDD突变DNA的浓度；

同样，V反应管使用YVDD特异性突变检测引物及相应探针或使用YVDD特异性突变检测探针及相应引物，只能扩增YVDD突变的DNA，其Ct值反映样本中HBV病毒发生YVDD突变DNA的浓度；

根据I反应管检测Ct值(Ct-i)、V反应管检测Ct值(Ct-v)分别与C反应管检测的Ct值(Ct-c)差值(ΔCt-i＝Ct-i-Ct-c，ΔCt-v＝Ct-v-Ct-c)可以对临床样本中HBV病毒发生YVDD和YIDD耐药突变情况进行判断。

由于临床上一般将耐药病毒占总乙肝病毒10％作为耐药与否的判断标准，本发明根据大量实验结果设定如下判断标准：

实验计算结果	结果判定	耐药判定
			ΔCt-i≤3.5(包括＜0)	突变型(YIDD)	耐药
ΔCt-v≤3.5(包括＜0)	突变型(YVDD)	耐药
			ΔCt-i＞3.5且ΔCt-v＞3.5	野生型(YMDD)	不耐药
ΔCt-i≤3.5且ΔCt-v≤3.5	YIDD与YVDD共生	耐药

其中进行判断的前提是总HBV病毒含量在本发明灵敏度之上，也即HBV总量检测管Ct值Ct-c≤35时才对耐药情况进行判断。该方法不仅能从血清中检测出500拷贝/ml以上的HBV病毒，并能正确区分YIDD突变和YVDD突变。

本发明与现有HBV DNA拉米夫定耐药检测方法相比，具有以下有益的技术效果：

通过精心设计检测反应，优化设计引物和探针序列，针对每种突变基因只需要两条简并引物即可对所有已报道的非耐药突变基因进行检测，且不影响耐药判断，对739A→G和741G→T两种耐药突变检出率达100％，同时由于TaqMan技术已成功应用于HBV DNA等定量项目，本发明的三管反应体系均使用同一上游引物和探针，下游引物间的差异也比较小，有利于使三管的扩增效率达到一致，因此引入ΔCt值概念对耐药毒株与敏感型病毒株间的共存关系进行半定量分析。更准确掌握患者血清中YMDD、YIDD和YVDD的动态变化，进一步指导临床用药。

本发明采用公用引物或公用荧光探针，合理改造特异性探针或引物，分三管对HBV拉米夫定耐药基因突变进行检测，即检测总的HBV病毒浓度和分别检测两种发生基因突变的HBV病毒浓度，PCR扩增条件趋于统一。在保证高检出率的同时，减少了简并引物的数量，从而减少了因引物合成的批间差导致的产品性能的不稳定，提高了实验、生产、质检及临床使用的稳定性，同时也降低了生产成本。

具体实施方式

实施例1

设计和制备引物、探针序列(针对HBV DNA P基因相关序列设计，GeneBank序列号为AF536524，下同)：

引物1(上游引物)5’TGTATTCCCATCCCATCATCCT 3’、

引物2(HBV检测引物1)5’ATGTTGTACAGATTTGGTCCC 3’、

引物3(HBV检测引物2)5’TTGGCTTCCAGTACCACATCATC 3’、

引物4(YIDD检测引物1)5’CCCCAGTACCACATCATCA 3’、

引物5(YIDD检测引物2)5’CCCAGAACCACATCATCA 3’、

引物6(YVDD检测引物1)5’CCCAGTACCACATCATTCAC 3’、

引物7(YVDD检测引物2)5’CCCAGAACCACATCATTCAC 3’、

探针1 5’TCCTATGGGAGTGGGCCTCAG 3’、

探针1的荧光标记为：荧光发光基团FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的一种或其组合；荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的一种或其组合。乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐药荧光PCR检测试剂盒组成

组成成分(10人份/盒)                      体积

提取液A                               500μl×1管

提取液B                               500μl×1管

C反应液                               280μl×1管

I反应液                                  280μl×1管

V反应液                                  280μl×1管

荧光探针                                 180μl×1管

MgCl₂溶液                               240μl×1管

Taq酶(含0.67U/μlTaq酶和0.02U/μlUNG酶)  90μl×1管

I/V阳性对照品                            20μl×1管

阴性对照品                               50μl×1管

试剂盒中三种反应液配方：

原材料	C反应管	I反应管	V反应管
				10×Buffer	1×	1×	1×
MgCl2	4mM	4mM	4mM
				d(AGC)TP	200μM	200μM	200μM
d(UTP)	300μM	300μM	300μM
				引物1	200nM	200nM	200nM
引物2	200nM
				引物4		200nM
引物5		200nM
				引物6			200nM
引物7			200nM
				探针1	300nM	300nM	300nM
Taq酶	2U	2U	2U
				UNG酶	0.06U	0.06U	0.06U
摸板(检测时另加)	5μl	5μl	5μl
				终体积	50μl	50μl	50μl

核酸提取试剂配方为：

提取液A：8％聚乙二醇、1mol/LNaCl

提取液B：10mmol/L NaOH、0.1％SDS、15％Chelex-100、1％Tween-20I/V阳性对照品为人工合成的YIDD突变和YVDD突变DNA片段等浓度混合液。使用方法

1、HBV DNA提取

取待测血清样本50μl，加入50μl核酸提取液A。振荡混匀15s。13,000rpm离心10min，弃上清。加入充分混匀的核酸提取液B 50μl，振荡混匀，100℃水浴10min，13,000rpm离心3min。取上清供PCR扩增用。

2、荧光PCR检测

按样本数[样本数＝标本数+质控品(1)+阴性对照]n分别配制三管反应液：

<C管>：取C反应液n×28ul、MgCl₂n×8ul、荧光探针n×6ul、Taq酶n×3ul混于一离心管中混匀

<I管>：取I反应液n×28ul、MgCl₂n×8ul、荧光探针n×6ul、Taq酶n×3ul混于一离心管中混匀

<V管>：取V反应液n×28ul、MgCl₂n×8ul、荧光探针n×6ul、Taq酶n×3ul混于一离心管中混匀

三种反应液均按45μl/管分装到反应管中，取质控品、待测样本DNA抽提产物及阴性对照各5μl依次加入上述三种反应液中，盖紧反应管，低速离心数秒。置全自动荧光检测仪上运行如下PCR程序：反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→53℃30秒 循环40次。

实施例2

设计和制备引物、探针序列：

引物1(上游引物)5’TGTATTCCCATCCCATCATCCT 3’、

引物2(HBV检测引物1)5’ATGTTGTACAGATTTGGTCCC 3’、

探针15’TCCTATGGGAGTGGGCCTCAG 3’、

探针3(I)5’ACCACATCATCAATATAACTGAAAGCC 3’、

探针4(V)5’ACCACATCATCCACATAACTGAAAGC 3’、

探针1、3、4的荧光标记分别可以为：荧光发光基团FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、OregonGreen 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的一种或其组合；荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的一种或其组合。

乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐药荧光PCR检测试剂盒组成

组成成分(10人份/盒)                           体积

提取液A                                    500μl×1管

提取液B                                    500μl×1管

PCR反应液                                  280μl×1管

荧光探针1                                  180μl×1管

荧光探针2                                  180μl×1管

荧光探针3                                  180μl×1管

MgCl₂溶液                                 240μl×1管

Taq酶(含0.67U/μlTaq酶和0.02U/μlUNG酶)    90μl×1管

I/V阳性对照品                              20μl×1管

阴性对照品                                 50μl×1管

试剂盒中各组成配方：

原材料	C反应管	I反应管	V反应管
				10×Buffer	1×	1×	1×
MgCl2	4mM	4mM	4mM
				d(AGC)TP	200μM	200μM	200μM
d(UTP)	300μM	300μM	300μM
				引物1	200nM	200nM	200nM
引物2	200nM	200nM	200nM
				探针1	300nM
探针3		300nM
				探针4			300nM
Taq酶	2U	2U	2U
				UNG酶	0.06U	0.06U	0.06U
摸板(检测时另加)	5μl	5μl	5μl
				终体积	50μl	50μl	50μl

核酸提取试剂配方为：

提取液A：8％聚乙二醇、1mol/LNaCl

提取液B：10mmol/L NaOH、0.1％SDS、15％Chelex-100、1％Tween-20

使用方法

1、HBV DNA提取

取待测血清样本50μl，加入50μl核酸提取液A。振荡混匀15s。13,000rpm离心10min，弃上清。加入充分混匀的核酸提取液B 50μl，振荡混匀，100℃水浴10min，13,000rpm离心3min。取上清供PCR扩增用。

2、荧光PCR检测

按样本数[样本数＝标本数+质控品(1)+阴性对照]n分别配制三管反应液：

<C管>：取PCR反应液n×28ul、MgCl₂n×8ul、荧光探针1n×6ul、Taq酶n×3ul混于一离心管中混匀

<I管>：取PCR反应液n×28ul、MgCl₂n×8ul、荧光探针2n×6ul、Taq酶n×3ul混于一离心管中混匀

<V管>：取PCR反应液n×28ul、MgCl₂n×8ul、荧光探针3n×6ul、Taq酶n×3ul混于一离心管中混匀

三种反应液均按45μl/管分装到反应管中，取质控品、待测样本DNA抽提产物及阴性对照各5μl依次加入上述三种反应液中，盖紧反应管，低速离心数秒。置全自动荧光检测仪上运行如下PCR程序：反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→53℃30秒 循环40次。

实施例3

上述两例实施方案使用相同的数据统计方法、结果判断和质控标准：Ct-c：C检测管的Ct值；Ct-v：V突变检测管的Ct值；Ct-i：I突变检测管的Ct值；ΔCt-i＝Ct-i-Ct-c；ΔCt-v＝Ct-v-Ct-c。

质控标准

如试剂质量完好且操作正确，相应的结果应当满足下表条件，否则实验无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。

对照品	质量控制
		质控品I/V	ΔCt-i≤3.5(包括≤0、ΔCt-v≤3.5(包括＜0)且Ct-c＜35
阴性对照	Ct-c、Ct-i和Ct-v均无或为40(视不同仪器默认)

结果判断

                   YMDD突变判定表

实验计算结果	结果判定	耐药判定
			ΔCt-i≤3.5(包括＜0)	突变型(YIDD)	耐药
ΔCt-v≤3.5(包括＜0)	突变型(YVDD)	耐药

ΔCt-i＞3.5且ΔCt-v＞3.5	野生型(YMDD)	不耐药
			ΔCt-i≤3.5且ΔCt-v≤3.5	YIDD与YVDD共生	耐药

患者血清中HBV病毒常为YMDD野生型和突变型共生。当突变位点检测管Ct值(Ct-i或Ct-v)为40时，表明样本中无相应的突变型病毒或其含量低于该试剂盒灵敏度。当突变位点检测管Ct≤35时，对于3.5＜ΔCt＜4.5的情况，总HBV数与相应突变株的比例约为10∶1；对于6.5＜ΔCt＜8的情况，总HBV数与相应突变株的比例约为100∶1；对于9.5＜ΔCt＜11的情况，总HBV数与相应突变株的比例约为1000∶1。而灰区的界定由各实验室根据当地人群及HBV的分布状况而定。

Claims (9)

1、一种检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法，其特征在于使用以下多聚核苷酸：

引物1 5’TGTATTCCCATCCCATCATCCT 3’、

引物2 5’ATGTTGTACAGATTTGGTCCC 3’、

引物3 5’TTGGCTTCCAGTACCACATCATC 3’、

引物4 5’CCCCAGTACCACATCATCA 3’、

引物5 5’CCCAGAACCACATCATCA 3’、

引物6 5’CCCAGTACCACATCATTCAC 3’、

引物7 5’CCCAGAACCACATCATTCAC 3’、

探针1 5’TCCTATGGGAGTGGGCCTCAG 3’、

探针2 5’CCATTTGTTCGGTGGTTCGTAG 3’、

探针3 5’ACCACATCATCAATATAACTGAAAGCC 3’、

或探针4 5’ACCACATCATCCACATAACTGAAAGC 3’、

或者与上述序列同源性大于75％的序列、或者上述所有序列的碱基互补序列，使用其中的任意一种或一种以上的组合。

2、根据权利要求1所述的检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法，其特征在于标记探针的荧光发光基团为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的任意一种或一种以上的组合；荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一种或一种以上的组合。

3、根据权利要求1所述的检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法，其特征在上述各探针序列经添加互补臂形成的分子信标探针。

4、根据权利要求1所述的检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法，其特征在于分三个反应管在同一时间运行同一PCR扩增程序进行实时荧光检测，三管均使用探针1、探针2中任一探针和引物1，并分别添加相应引物分别为：

第一管：引物2或引物3；

第二管：引物4和引物5；

第三管：引物6和引物7。

5、根据权利要求1所述的检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法，其特征在于分三个反应管在同一时间运行同一PCR扩增程序进行实时荧光检测，三管均使用引物1和引物2，并分别添加相应探针分别为：

第一管：探针1或探针2；

第二管：探针3；

第三管：探针4。

6、根据权利要求1所述的检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法，其特征在于运行如下PCR程序：反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→53℃30秒循环40次。

7、根据权利要求1-6中任意一项所述的检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法，其特征在于根据第二管与第一管检测的Ct值的差值、第三管与第一管检测的Ct值的差值分别判断样本中HBV DNA发生YIDD突变和发生YVDD突变的病毒相对量。

8、根据权利要求1-4中任意一项所述的检测拉米夫定耐药HBV DNA的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒组成包括：核酸提取试剂、C反应液、I反应液和V反应液、荧光标记探针、耐热DNA聚合酶和对照品；

其中，C反应液使用的引物序列为引物1、引物2和或引物3；

I反应液使用的引物序列为引物1、引物4和引物5；

V反应液使用的引物序列为引物1、引物6和引物7；

荧光标记探针序列为5`端用FAM标记、3`端用TAMRA标记的探针1。

9、根据权利要求1-3或5中任意一项所述的检测拉米夫定耐药HBV DNA的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒组成包括：核酸提取试剂、PCR反应液、荧光标记探针A、荧光标记探针B、荧光标记探针C、耐热DNA聚合酶和对照品；

其中，PCR反应液使用的引物序列为引物1、引物2；

荧光标记探针A序列为探针1或和探针2；

荧光标记探针B序列为探针3；

荧光标记探针C序列为探针4；

荧光标记探针序列的5`端均用FAM标记、3`端均用TAMRA标记。