CN101195843A - 一种hbv dna基因分型荧光pcr多通道检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种HBV DNA基因分型荧光PCR多通道检测方法及其试剂盒，其方法特征在于，从GenBank中找出已作基因分型的HBV DNA全序列进行序列联配；根据序列联配结果找出HBV基因型的型特异性碱基的聚集区域；根据型特异性碱基的聚集区域设计探针及配套的引物，采用多色标记探针在一个PCR管中进行多通道基因型和通用型检测，根据型和通用型检测Ct值的差值，对临床样本中HBV病毒中型病毒的比例含量进行判断。本发明的试剂盒性能稳定、操作简便、检测快速，能很好地判断HBV DNA的型别，有助于更全面的判断慢性乙型肝炎病毒感染者的预后和选择更合适的治疗方案。

Description

一种HBV DNA基因分型荧光PCR多通道检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及一种乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus，HBV)基因分型的荧光PCR多通道检测方法及其试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)流行世界各地，估计全球有20亿人感染，其中慢性感染者3.5亿，我国约占半数，全球每年约有100万人死于HBV感染。此种感染最终可发展为肝硬化、肝癌，是当前WHO公布的人类疾病死亡原因中居第九位的疾病。

乙型肝炎病毒主要通过宿主免疫机制引起肝脏损害，机体细胞识别病毒抗原并攻击受感染的肝细胞引起炎症，这个过程受宿主与病毒的多个因素影响。病毒基因异质性影响着抗原的表达，可能也从中扮演了重要的角色。不同的毒株出现某些变异的频率不同，不同毒株对机体免疫清除抵抗力不同以及其它的因素可能导致了不同基因型具有不同的感染后疾病谱，从目前的研究来看，HBV C基因型与较重的肝脏病变相关，B型则与较轻的病变相关；A型与慢性肝炎相关，D型与急性自限型肝炎相关；其它基因型与疾病谱的关系还有待发现。

Kao发现C型与重症如肝硬化和肝细胞癌有关，B型多存在于年轻的非肝硬化患者中。C型患者多是HBeAg(+)并且血清DNA含量高于B型，C型患者在HBV的免疫清除阶段血清转化比B型延迟，同时C型比B型有更高的C基因启动子突变率。在抗病毒治疗中，B型比C型对拉咪呋啶敏感，不过两型产生药抗性的几率是一样的。Mayerat等比较了35例急性肝炎及30例慢性肝炎病人中的基因型分布，发现在慢性肝炎组中，A型占80％(28/35)，D型占11％(4/35)；急性肝炎组D型占80％(24/30)，A型占10％(3/30)，提示病毒基因型在病毒一宿主相互作用中有一定差异，这可能是因为基因型A所产生的抗原性要弱于基因型D，诱导机体产生免疫清除的能力也较弱，导致感染迁延。Lindh等对东亚地区的43名基因型为C的HBV漫性感染者的基因型及CP变异的研究表明，T1762变异更易出现在C基因型，感染C型后更易出现较重的肝脏炎症。

对HBV进行基因分型有利于对HBV感染的流行病学、病因学和临床诊治进行更加深入细致的研究，现有研究表明不同亚型的HBV感染的临床病程和对治疗的反应都存在着一定的差异。病毒变异是生物遗传进化的基本因素之一，乙型肝炎病毒变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的，也可发生于应用药物或接种疫苗后。HBV在复制中利用RNA中间体，病毒聚合酶和逆转录酶活性是有效而迅速的，病毒聚合酶缺乏校对酶活性，发生核苷酸替代变异后难以修正。已发现HBV序列的变异在基因组各个区域均可发生。不同的病人机体和不同的药物与不同的变异毒株长期相互作用表现出不同的基因型。虽然没有确切数据表明HBV的变异比例，但病毒变异是高频并永恒的，现在已经由最初的A～D四型发展到了A～H八型，病毒与机体的继续斗争将会出现更多的变异热点和基因型。尽管HBV分型、变异与临床表征有着一定关联度，但是目前仍然没有完全阐明清楚。大规模的系统流行病学分子特征普查将更有助人们认识HBV与机体以及药物的辨证关系，这就依赖于简便快速的HBV基因分型方法。

对HBV进行基因分型以及变异检测已成为比较热点的检测，在临床上选择合适的药物或制订治疗方案等方面都有重要的指导作用。目前临床检测市场迫切需要有相关成就的技术方案，尤其是针对病毒分子特征以及机理的方法，可进一步指导乙肝的临床治疗。虽然有很多实验室都在研究HBV基因分型及变异的检测方法，但国内外市场上还没有检测HBV基因型的临床诊断产品。

国内外对HBV进行基因分型的方法可分为全基因序列比对和片段基因序列比对两大类。全基因序列比对是以生物系统发生学中的基因同源性为基础的，它主要是通过HBV全基因序列测定来进行基因分型，另外，也可应用对HBV全基因进行限制性片段长度多态性分析技术(RFLP)。片段基因序列比对是利用HBV中的代表性片段的序列类型来反映全基因序列的类型，主要技术类型有片段基因序列测定、PCR-RFLP、型特异引物(SSP)扩增法和型特异探针(SSO)检测法等。序列测定虽然结果准确可靠，但是由于其技术复杂、实验流程长、实验条件要求高、耗时长和费用昂贵难以作临床常规使用，目前只作为实验室研究使用；RFLP技术相对简单，但是酶切位点易受基因变异影响，且遇混合感染或酶切不完全，会出现复杂条带，影响分型结果判断：应用SSP法进行PCR扩增需要多个扩增管，使用常规的PCR后产物电泳的方法也容易污染，其灵敏性比特异性探针低；应用SSO法可通过对单管的PCR产物进行检测来分型，因此具有操作相对简单和费用较低等特点，最具有实用价值。基因芯片技术是近几年发展起来的新技术，也能建立乙型肝炎毒基因分型诊断的方法，但费用较高，检测时需要昂贵的芯片扫描仪，且检测探针固定技术、检测灵敏度等关键技术还未取得重大突破，目前尚未见有基因芯片进行HBV基因分型的产品上市。

实时荧光PCR反应是在常规PCR的一对引物之外，加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。在探针完好的状态下，5’端报告荧光基团的激发光被3’端的淬灭荧光基团所抑制。PCR反应过程中，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，由于它的5’-＞3’外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一条新生链，就有一个报告基团的信号释放，被释放的激离报告荧光基团的数目和PCR产物是一对一的关系。通过荧光PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线，找到PCR扩增的对数期，可以对样本作定性定量检测。HBV的变异是不断产生的，目前的分型方法均只能基于现在已取得的研究成果，分型依据和分型方法均在不断发展中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种更有效又简便的乙型肝炎病毒基因分型的检测方法；本发明另一目的在于提供用于该方法的检测试剂盒，以克服现有技术对HBV基因分型检测比较烦琐复杂的缺陷。

技术方案

为达到上述目的，本发明提供的技术方案之一是一种乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR多通道检测方法，即在聚合酶链式反应中，使用以下结构的多聚核苷酸序列作为检测探针：

序列B 5’-CAAAT CTCCA-3’

序列C 5’-CGTGT CCTGG-3’

序列D 5’-GGCAG AATCT-3’

采用包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列，只要包含了述分型特异性序列B、C和/或D，即可同样达到本发明的技术效果；同样，与上述序列B、C、D和包含B、C、D的同源性大于75％的序列，事实上也可以达到HBV基因分型的目的，但本发明需要指出的是，其替代效果不一定比上述明确指出的序列更好；同理，不管上述序列B、C、D还是包含B、C、D的序列还是同源性大于75％的序列，其碱基互补序列只是碱基形式上的变化，并未改变本发明技术方案的实质性。

上述的各种序列还可以经添加互站臂形成分子信标探针，以利用分子荧光进行HBV基因分型检测，这种分子信标探针是上述各种序列所构成的发明方案的一种合理延伸，也是上述序列的一种理所当然可以利用的方式。在实际应用中，还有一种可能是使用上述所有序列中的任意一条或一条以上的组合，来达到检测HBV某一型或一型以上的目的。

上述的HBV基因分型的荧光PCR多通道检测方法的一种优选方案为：以所说的探针之一或一条以上作为引物参与聚合酶链式反应。其原理是，以上各种探针是特异地与目标序列严格互补的，所以同时也可以作为引物作用。这种可以省略引物的使用技术方案，也是本领域的普通技术人员常用的手段之一。

上述的HBV基因分型的荧光PCR多通道检测方法的另一种优选方案为：可以采用标记探针技术，即所说的检测探针。用来标记的荧光发光基团可以为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Lluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine 6G、Orengon Green 488、Orengon Green 500、Orengon Green514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的任意一种或一种以上的组合；荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一种或一种以上的组合。荧光发光基团和荧光淬灭基团的不同选择将影响到检测的灵敏度和使用的成本，但不影响本发明所提供检测方案的实质。

本发明同时还提供上述探针在PCR反应过程中的使用方法，即采用单管PCR反应检测HBV多个型，具体说明如下：

上述的HBV基因分型的荧光PCR多通道检测方法的实现方式是，由一个反应管同时加入序列B、序列C和序列D进行实时荧光聚合酶链式反应检测。

上述的HBV基因分型的荧光PCR多通道检测方法的实现方式的优选方案为，在上述反应管之外增加一个总HBV反应管，与型检测反应管在同一时间运行同一PCR扩增程序进行实时荧光检测，并且使用的检测探针为：

探针U 5’-GGATG TGTCT GCGGC GTTTT ATC-3’

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于75％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者上述序列经添加互补臂形成的分子信标探针；

上述的HBV基因分型的荧光PCR多通道检测方法的PCR反应程序如下：反应管先在45-55℃反应1-3分钟，然后93-95℃保温3-6分钟，再按93-97℃15-30秒和55-65℃30-40秒循环35-45次。其中最优选的运行程序为：反应管先在50℃反应1-3分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃ 30秒循环40次。

上述的HBV基因分型的荧光PCR多通道检测方法的结果处理可以采取如下方案：即根据基因型管与U管检测的Ct值的差值判断样本中HBV DNA中B基因型病毒、C基因型病毒、D基因型病毒与总病毒的病毒相对量。其中，Ct值的“C”代表Cycle，“t”代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。

上述的HBV基因分型检测方法另一种检测形式的优选方案为：使用序列B、序列C、序列D中的任意一条或一条以上的组合，固定在膜载体或其它固相载体上，与包含特异性互补序列的DNA进行杂交。

本发明提供的技术方案之二为HBV基因分型实时荧光PCR多通道检测试剂盒，所述的试剂盒组成包括：核酸提取试剂、反应液、荧光标记探针、耐热DNA聚合酶和对照品，其特征在于，反应液使用的引物序列为引物1和引物2；荧光标记探针序列B为5’端用FAM标记、3’端用TAMRA标记；荧光标记探针序列C为5’端用JOE标记、3’端用TAMRA标记；荧光标记探针序列D为5’端用Cy5标记、3’端用BHQ-1标记。

其中，引物1为5’AGACT CGTGG TGGAC TTCTC-3’

引物2为5’TGAGG CATAG CAGCA GGATG-3’

上述试剂盒的具体组成包括：

核酸提取试剂

PCR扩增试剂，其组成为：

反应液

荧光检测探针

耐热DNA聚合酶

对照品

其中，反应液使用的引物序列为引物1和引物2；

荧光检测探针序列为序列B和序列C的混合物，其中序列B 5’端用FAM标记、3’端用TAMRA标记；序列C 5’端用JOE标记、3’端用TAMRA标记。

PCR运行程序为：反应管先在50℃反应1-3分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃ 30秒循环40次。

有益效果

本发明与现有HBV基因分型检测方法相比，具有以下有技术效果：

本发明的HBV基因分型实时荧光PCR多通道检测方法是利用了HBV基因组有型别特异性位点，并证明这个位点应用于实际检测。应用特异性探针与配套的实时荧光多通道检测方法，解决了背景技术中所说的片段基因序列测定、PCR-RFLP、型特异性引物(SSP)扩增法和型特异探针(SSO)检测法等方法的缺陷，比DNA序列测定以及单管法荧光PCR测定更简便和快速，同时，还可以避免PCR产物进一步处理中产生的模板污染，简化实验室设置和防护的要求，减少实验失败的可能，提高生物安全性和检测的稳定性。

具有实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制发明的范围。在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

设计和制备引物、探针序列。(针对HBV基因组相关序列设计，GeneBank序列号为B型AF121244，C型AB033553，D型AY741794)

引物1(上游引物)5’-AGACT CGTGG TGGAC TTCTC-3’

引物2(上游引物)5’-TGAGG CATAG CAGCA GGATG-3’

B基因型探针5’CGCAG TCCCAAATC TCCAG TCAC-3’(包含序列B)、

C基因型探针5’-AGCACCCACGTGTCCTGGCCAA-3’(包含序列C)、

D基因型探针5’-GCATG GGGCAGAATC TTTCC ACC-3’(包含序列D)

B基因型探针荧光标记为：荧光发光基团FAM；荧光淬灭基团为TAMRA。

C基因型探针荧光标记为：荧光发光基团JOE；荧光淬灭基团为TAMRA。

D基因型探针荧光标记为：荧光发光基团Cy5；荧光淬灭基团为BHQ-1。

实施例2

制备HBV基因分型实时荧光PCR多通道检测试剂盒。

组成为(10人份/盒)：

试剂盒中反应液配方：

核酸提取液配方：

提取液A：8％聚乙二醇、1M NaCl

提取液B：10mM NaOH、0.1％SDS、15％Chelex-100、1％Tween-20

阳性对照品为人工合成的HBV B型、C型和D型DNA片段的混合液。

实施例3

HBV基因分型实时荧光PCR多通道检测方法，同时也是检测试剂盒的使用方法。

1、HBV DNA提取

取待测血清样本100μl，加入100μl提取液A，振荡10秒，13,000rpm离心10分钟，弃上清；加入充分混匀的提取液B 50μl，振荡混匀，100℃水浴10分钟，13,000rpm离心2分钟，取上清供PCR扩增用。

2、实时荧光PCR多通道检测

按样本数(样本数＝待测标本数+对照品)n分别配制反应液：

取反应液n×28μl、MgCl₂n×8μl、荧光探针B、C、Dn×6μl、Taq酶n×3μl混于一离心管中混匀。

反应液按45μl/管分装到反应管中，取待测样本DNA抽提产物及对照品各5μl依次加入上述反应液中，盖紧反应管，低速离心数秒。置于全自动多通道荧光PCR检测仪上运行如下程序：反应管先在50℃反应1-3分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃ 20秒→60℃ 30秒循环40次。

实施例4

HBV基因分型实时荧光PCR多通道定量检测方法，同时也是检测试剂盒的使用方法。

1、HBV DNA提取

取待测血清样本100μl，加入100μl提取液A，振荡10秒，13,000rpm离心10分钟，弃上清；加入充分混匀的提取液B 50μl，振荡混匀，100℃水浴10分钟，13,000rpm离心2分钟，取上清供PCR扩增用。

2、实时荧光PCR多通道检测

按样本数(样本数＝待测标本数+对照品)n分别配制反应液：

<分型管>：取反应液n×28μl、MgCl₂n×8μl、荧光探针B、C、Dn×6μl、Taq酶n×3μl混于一离心管中混匀。

<U管>：取反应液n×28μl、MgCl₂n×8μl、荧光探针Un×6μl、Taq酶n×3μl混于一离心管中混匀。

反应液按45μl/管分装到反应管中，取待测样本DNA抽提产物、HBV定量模板1-4号(浓度分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴U/ml)各5μl依次加入上述两种反应液中，盖紧反应管，低速离心数秒。置于全自动多通道荧光PCR检测仪上运行如下程序：反应管先在50℃反应1-3分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃ 20秒→60℃ 30秒循环40次。

根据HBV定量模板1-4号的Ct值和已知浓度可以模拟出定量标准曲线，并按此曲线，根据待测样本在分型管中所检测出基因型的Ct值和U管Ct值计算出该样本基因型DNA和总HBV DNA的量值，并相除得出基因型DNA占总HBV DNA的含量。

根据经验公式，Ct值与原始模板浓度存在线性关系，Ct值越大则原始模板数量越少，每3.3个Ct值的变化代表约10倍原始模板数量的变化。某样本的分型管所检出的某种基因型的Ct_-g大于U管的Ct_-u，差值为ΔCt＝Ct_-g-Ct_-u，则该样本基因型HBV占总HBV DNA的比例约为10的(-ΔCt/3.3)次幂。

Claims (9)

1.一种乙型肝炎病毒(HBV)DNA基因分型的荧光PCR多通道检测方法，其特征在于，在聚合酶链式反应中使用以下结构的多聚核苷酸序列作为检测探针：

序列B 5’-CAAAT CTCCA-3’

序列C 5’-CGTGT CCTGG-3’

序列D 5’-GGCAG AATCT-3’

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于75％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者上述序列经添加互补臂形成的分子信标探针；

2.根据权利要求1所述的HBV DNA基因分型检测方法，其特征在于，以所说的探针之一或一条以上作为引物参与聚合酶链式反应。

3.根据权利要求1所述的HBV DNA基因分型的荧光PCR多通道检测方法，其特征在于，标记探针的荧光发光基团为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Lluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine 6G、OrengonGreen 488、Orengon Green 500、Orengon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的任意一种或一种以上的组合；荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一种或一种以上的组合。

4.根据权利要求1所述的HBV DNA基因分型的荧光PCR多通道检测方法，其特征在于，序列B、序列C和序列D均加入同一反应管进行实时荧光聚合酶链式反应检测。

5.根据权利要求4所述的HBV DNA基因分型的荧光PCR多通道检测方法，其特征在于，增加一个通用型HBV反应管，与型检测反应管在同一时间运用同一PCR扩增程序进行实时荧光检测，并且使用如下检测探针：

探针U 5’-GGATG TGTCT GCGGC GTTTT ATC-3’

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于75％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者上述序列经添加互补臂形成的分子信标探针；

6.根据权利要求1-5所述的HBV DNA基因分型的荧光PCR多通道检测方法，其特征在于，聚合酶链式反应运行程序为：反应管先在45-55℃反应1-3分钟，然后93-95℃保温3-6分钟，再按93-97℃ 15-30秒和55-65℃ 30-40秒循环35-45次。

7.根据权利要求6所述的HBV DNA基因分型的荧光PCR多通道检测方法，其特征在于，根据基因型管与U管检测的Ct值的差值判断样本中HBVDNA中B基因型病毒、C基因型病毒、D基因型病毒与总病毒的病毒相对量。

8.根据权利要求1所述的HBV DNA基因分型的检测方法，其特征在于，使用序列B、序列C、序列D中的任意一条或一条以上的组合，固定在膜载体或其它固相载体上，与包含特异性互补序列的DNA进行杂交。

9.一种乙型肝炎病毒(HBV)DNA基因分型的荧光PCR多通道检测试剂盒，所述的试剂盒组成包括：核酸提取试剂、反应液、荧光标记探针、耐热DNA聚合酶和对照品，其特征在于，反应液使用的引物序列为引物1和引物2；荧光标记探针序列B为5’端用FAM标记、3’端用TAMRA标记；荧光标记探针序列C为5’端用JOE标记、3’端用TAMRA标记；荧光标记探针序列D为5’端用Cy5标记、3’端用BHQ-1标记。

其中，引物1为5’-AGACT CGTGG TGGAC TTCTC-3’

引物2为5’-TGAGG CATAG CAGCA GGATG-3’