CN105296673A - 一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105296673A
CN105296673A CN201510875032.0A CN201510875032A CN105296673A CN 105296673 A CN105296673 A CN 105296673A CN 201510875032 A CN201510875032 A CN 201510875032A CN 105296673 A CN105296673 A CN 105296673A
Authority
CN
China
Prior art keywords
influenza
rpa
virus
add
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510875032.0A
Other languages
English (en)
Inventor
祁贤
宋勇春
焦永军
张洪英
汤奋扬
鲍倡俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Original Assignee
JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL filed Critical JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Priority to CN201510875032.0A priority Critical patent/CN105296673A/zh
Publication of CN105296673A publication Critical patent/CN105296673A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甲型流感病毒反转录-重组酶多聚酶扩增(RT-RPA)检测试剂盒及其制备方法。本发明涉及的检测试剂盒由RT-RPA反应体系、RNA酶抑制剂、甲型流感病毒M片段阳性质粒Puc-AM、阴性质控品、M片段RPA引物和exo探针组成。用特异性引物和探针，通过配制RT-RPA反应体系，置入Twista实时荧光检测仪进行实时荧光检测，建立了一种快速、敏感、特异的甲型流感病毒等温实时荧光核酸检测方法。本发明涉及特异性RPA引物和exo探针在甲型流感病毒感染临床鉴别诊断和病毒分离株鉴定中的用途。

Description

一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甲型流感病毒反转录-重组酶多聚酶扩增检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
甲型流感病毒属于正粘病毒科，基因组由8个负链单股RNA节段组成，至少编码11种蛋白。甲型流感病毒的宿主分布广，可感染禽、人、猪、马、狗、猫、海洋哺乳动物(海豹、鲸等)等。在整个甲型流感病毒的生态分布中，野生水禽和海岸鸟是主要的自然贮存宿主和基因库，目前发现的大多数甲型流感病毒亚型(16个H亚型和9个N亚型)都存在于野生水禽中。20世纪人类经历了3次流感大流行，分别是1918年西班牙流感(H1N1)、1957年亚洲流感(H3N2)和1968年香港流感(H3N2)。据WHO估计，全球每年约有25-50万人死于季节性流感引发的疾病。甲型流感是人类季节性流感病毒主要成员，可以感染所有人群，对一些特殊人群(如孕妇、老年人和基础性疾病患者)能引起严重疾病乃至死亡。季节性流感是由流感病毒引起的一种人类重要的全球性呼吸道传染病，热带地区常年流行，而在温带地区主要发生在冬季，具有一定的季节性流行特点。目前在人群中流行主要是甲型H1N1和H3N2亚型流感病毒。WHO在全球建立了季节性流感监测网络，以了解病毒流行情况，为流感全球防控和疫苗研制提供科学依据。
甲型流感病毒是人类流感监测和临床诊断关注的重点病毒。甲型流感病毒的检测方法主要包括血清学和核酸检测，血清学方法主要用标准血清对分离到的病毒株进行抗原分型，耗时费力，不适合临床快速分型诊断。目前核酸检测方法主要包括普通PCR法、Real-timetimePCR法和环等温扩增(LAMP)法等。Real-timetimePCR法和LAMP法具有很好的特异性和敏感性，但前者依赖昂贵的仪器和试剂；而后者法难以实现多重检测。相比之下，普通PCR敏感性较差且需要琼脂糖电泳进行结果判定，不适合大规模标本的检测。因此，需要建立快速敏感、不依赖于昂贵仪器的甲型流感核酸检测方法，以提高流感监测和临床诊断水平。
发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种甲型流感病毒反转录-重组酶多聚酶扩增(RT-RPA)检测试剂盒及其制备方法。
本发明提供的甲型流感病毒RT-RPA检测试剂盒由RT-RPA反应体系、M片段阳性质粒Puc-AM、阴性质控品、M片段RPA引物和exo探针组成，M片段RPA引物和exo探针为：
M-rpaF,5`ACCGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCGTTCC3`；
M-rpaR,5`CCAAACAAAAGTGCGAGTGGCACGGGTCACTC3`；
M-exo-probe,5`GGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAA[dT-FAM]TC[THF]G[dT-BHQ]CACCTCTGACTAAGG[3`-block]3`
本发明所述甲型流感病毒RT-RPA检测试剂盒的制备方法；
(1)病毒核酸提取：采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：取临床鼻咽拭子标本或病毒培养物核酸100μL，加入含有200ul水饱和酚的1.5mlEP中，剧烈震荡混匀，静置3min，加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g室温离心15分钟；吸取上清液，加入两倍上清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积3M醋酸钠35-45ul，充分混匀后-20℃静置2h；取出于4℃下，12000g，离心20min；弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，12000g，离心20min；弃上清，室温干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA，-70℃冰箱放置备用；
(2)RT-RPA反应：采用英国TwistDx公司的TwistAmpRTexos试剂盒，取29.5μL反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-rpaF(10mM)和L-rpaR(10mM)各2.1μL，2.6μLRPAexo探针(10mM),1μLRNA酶抑制剂(5U),7.2μL超纯水，5μL标本RNA模板，涡旋震荡，短暂离心，再加入2.5μL醋酸镁(280mM)。混合离心后，放入Twista实时荧光检测仪中，反应温度为40℃，时间为20min。本实验同时设阳性对照和空白阴性对照组。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
设计针对甲型流感病毒M基因的RPA引物和exo探针，通过反转录-重组酶多聚酶扩增方法，反应温度为40℃等温条件下，20min即可对临床流感标本和病毒分离物进行核酸分子鉴定，无需昂贵仪器设备，便于操作，具有快速、敏感、特异等特点，为甲型流感监测和临床救治提供一种新的检测方法。
附图说明
图1检测甲型流感病毒M节段RPA引物琼脂糖凝胶电泳筛选
具体实施方式
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。
实施例1：靶基因质粒构建
设计针对甲型流感病毒M片段的特异性引物，通过PCR法扩增获得1027bp基因片段，回收纯化后的与T载体连接，获得靶基因阳性质粒，命名为Puc-AM。
实施例2：引物探针设计与筛选
通过序列分析软件分析，以甲型流感病毒较为保守的M片段序列为模板，共设计8条正向引物和12条反向引物，引物长度为30-35bp；同时设计1条exo探针(命名为M-exo-probe)，长度为53bp，其中33位碱基T标记荧光物质FAM，36位碱基由四氢呋喃代替，38位碱基标记荧光物质BHQ，同时封闭3`末端碱基。
采用TwistAmpBasickit(TwistDx公司，英国)，以靶基因克隆质粒Puc-AM为模板，以琼脂糖凝胶电泳为结果指示手段，对上述设计的引物进行筛选。引物优劣的评价指标包括特异性、敏感性、扩增效率和引物噪音等。取29.5μL反应缓冲液，分别加入下列组分：上下游引物(10mM)各2.4μL，12.2μL超纯水，1μL质粒Puc-L模板。再加入2.5μL醋酸镁(280mM)。混合离心后，放入40℃，温育5min。涡旋震荡8-10次，短暂离心，放入40℃，反应20min。取反应产物2ul放入18ul水中，用酚-氯仿法对DNA进行纯化。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测纯化DNA产物，结果筛选到一组引物，命名为L-rpaF和L-rpaR(图1)。
实施例3：RT-RPA的敏感性
将靶基因克隆质粒Puc-AM稀释100倍，再按10倍梯度稀释成10-2-10-9共八个浓度，以此为模板，进行RT-RPA反应：采用TwistAmpRTexos试剂盒(TwistDx公司，英国)。取29.5μL反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-rpaF(10mM)和L-rpaR(10mM)各2.1μL，2.6μLRPAexo探针(10mM),1μLRNA酶抑制剂(5U),7.2μL超纯水，5μL标本RNA模板。涡旋震荡，短暂离心。再加入2.5μL醋酸镁(280mM)。混合离心后，放入Twista实时荧光检测仪中，反应温度为40℃，时间为20min。
本实验中所建立的RT-RPA方法可以检测下限是15copies/μL，具有较好的敏感性。
实施例3：RT-RPA的特异性
以乙型流感、登革热病毒、呼吸道冠状病毒、鼻病毒、呼吸道合胞体病毒核酸为模板、，用设计的RPA引物和exo探针进行RT-RPA实验。结果对上述毒核酸都没有荧光信号检出，表明建立的RT-RPA方法具有较好的特异性。。
实施例3：临床标本检测
收集45份甲型流感病毒临床样本，所有标本都通过细胞培养进行病毒分离。
(1)病毒RNA提取
采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：1.取血清标本100μL，加入含有200ul水饱和酚的1.5mlEP中，剧烈震荡混匀，静置3min，加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g室温离心15分钟。2.吸取上清液，加入两倍上清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积3M醋酸钠约40ul，充分混匀后-20℃静置2h；取出于4℃下，12000g，离心20min。3.弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，12000g，离心20min。4.弃上清，室温干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA。
(2)RT-RPA反应：采用公司的TwistAmpRTexos试剂盒(TwistDx公司，英国)。取29.5μL反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-rpaF(10mM)和L-rpaR(10mM)各2.1μL，2.6μLM-exo探针(10mM),1μLRNA酶抑制剂(5U),7.2μL超纯水，5μL标本RNA模板。涡旋震荡，短暂离心。再加入2.5μL醋酸镁(280mM)。混合离心后，放入Twista实时荧光检测仪中，反应温度为40℃，时间为20min时间为20min。本实验同时设阳性对照和空白阴性对照组。
结果45份临床样本，RT-RPA检测阳性的有30份，阴性15份，结果与病毒分离结果完全一致。

Claims (2)

1.一种基于反转录-重组酶多聚酶扩增的甲型流感病毒检测试剂盒，其特征是试剂盒由RT-RPA反应体系、RNA酶抑制剂、M片段阳性质粒Puc-AM、阴性质控品、M片段RPA引物和exo探针组成，M片段RPA引物和exo探针为：
M-rpaF,5`ACCGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCGTTCC3`；
M-rpaR,5`CCAAACAAAAGTGCGAGTGGCACGGGTCACTC3`；
M-exo-probe,5`GGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAA[dT-FAM]TC[THF]G[dT-BHQ]CACCTCTGACTAAGG[3`-block]3`。
2.根据权利要求1所述一种基于反转录-重组酶多聚酶扩增的甲型流感病毒检测试剂盒的制备方法，其特征是由以下步骤构成：
(1)病毒核酸提取：采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：取临床鼻咽拭子标本或病毒培养物核酸100μL，加入含有200ul水饱和酚的1.5mlEP中，剧烈震荡混匀，静置3min，加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g室温离心15分钟；吸取上清液，加入两倍上清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积3M醋酸钠35-45ul，充分混匀后-20℃静置2h；取出于4℃下，12000g，离心20min；弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，12000g，离心20min；弃上清，室温干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA，-70℃冰箱放置备用；
(2)RT-RPA反应：采用TwistAmpRTexos试剂盒，取29.5μL反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-RPAF10mM和L-RPAR10mM各2.1μL，2.6μLRPAexo探针10mM,1μLRNA酶抑制剂5U,7.2μL超纯水，5μL标本RNA模板；涡旋震荡，短暂离心；再加入2.5μL醋酸镁280mM，混合离心后，放入Twista实时荧光检测仪中，反应温度为40℃，时间为20min。
CN201510875032.0A 2015-12-03 2015-12-03 一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法 Pending CN105296673A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510875032.0A CN105296673A (zh) 2015-12-03 2015-12-03 一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510875032.0A CN105296673A (zh) 2015-12-03 2015-12-03 一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105296673A true CN105296673A (zh) 2016-02-03

Family

ID=55194492

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510875032.0A Pending CN105296673A (zh) 2015-12-03 2015-12-03 一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105296673A (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105861749A (zh) * 2016-05-10 2016-08-17 江苏省疾病预防控制中心 甲型流感病毒高通量测序模板制备试剂盒及制备方法和应用
CN106555012A (zh) * 2016-10-25 2017-04-05 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 用于a型动物流感病毒检测的试剂、检测方法及应用
CN107267665A (zh) * 2017-05-23 2017-10-20 华南农业大学 用于h5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用
CN107574262A (zh) * 2017-10-25 2018-01-12 宁波国际旅行卫生保健中心 一种用于检测甲型h1n1病毒的荧光rt‑raa引物、探针及检测方法
CN110468238A (zh) * 2019-09-11 2019-11-19 深圳市芯思微生物科技有限公司 一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组、试剂盒及应用
CN111118219A (zh) * 2020-02-06 2020-05-08 广州普世利华科技有限公司 一种快速检测甲型流感病毒的rda方法及试剂盒
CN112063765A (zh) * 2020-11-11 2020-12-11 北京欣颂生物科技有限公司 一种核酸抗体双重检测病毒的试剂盒及其制备方法
CN112280901A (zh) * 2020-11-11 2021-01-29 北京欣颂生物科技有限公司 一种改进的核酸检测技术在制备病毒检测试剂盒中的用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101560574A (zh) * 2009-05-22 2009-10-21 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101560574A (zh) * 2009-05-22 2009-10-21 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VIRUSAHMED ABD EL WAHED等: "Diagnostics-in-a-Suitcase: Development of a portable and rapid assay for the detection of the emerging avian influenza A (H7N9) virus", 《JOURNAL OF CLINICAL VIROLOGY》 *
陈继明等: "甲型流感病毒荧光RT-PCR检测方法的设计和检定", 《中华实验和临床病毒学杂志》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105861749A (zh) * 2016-05-10 2016-08-17 江苏省疾病预防控制中心 甲型流感病毒高通量测序模板制备试剂盒及制备方法和应用
CN106555012A (zh) * 2016-10-25 2017-04-05 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 用于a型动物流感病毒检测的试剂、检测方法及应用
CN107267665A (zh) * 2017-05-23 2017-10-20 华南农业大学 用于h5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用
CN107574262A (zh) * 2017-10-25 2018-01-12 宁波国际旅行卫生保健中心 一种用于检测甲型h1n1病毒的荧光rt‑raa引物、探针及检测方法
CN110468238A (zh) * 2019-09-11 2019-11-19 深圳市芯思微生物科技有限公司 一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组、试剂盒及应用
CN111118219A (zh) * 2020-02-06 2020-05-08 广州普世利华科技有限公司 一种快速检测甲型流感病毒的rda方法及试剂盒
CN112063765A (zh) * 2020-11-11 2020-12-11 北京欣颂生物科技有限公司 一种核酸抗体双重检测病毒的试剂盒及其制备方法
CN112280901A (zh) * 2020-11-11 2021-01-29 北京欣颂生物科技有限公司 一种改进的核酸检测技术在制备病毒检测试剂盒中的用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105296673A (zh) 一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法
CN104862425B (zh) 鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式rt-pcr检测试剂盒
CN103060478B (zh) 一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重rt-pcr方法
CN104232798B (zh) 鸭甲型肝炎病毒检测与基因a型和c型鉴别的多重荧光定量pcr方法及试剂盒
CN105296674A (zh) 发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒及制备方法
CN105543414B (zh) 一种呼吸道合胞病毒a/b亚型多重荧光定量pcr检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法
CN104878124A (zh) 鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒多重pcr检测试剂盒
CN103290144A (zh) 一种借助rt-lamp检测人感染h7n9亚型禽流感病毒的引物及应用
CN104498629A (zh) H3n2亚型禽流感病毒双重实时荧光定量pcr检测试剂盒
CN107574261B (zh) 用于检测汉坦病毒的检测引物、检测试剂盒及检测方法
CN102251061A (zh) 甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光pcr检测试剂盒
CN101250592A (zh) 丙型肝炎病毒(hcv)一步荧光定量rt-pcr检测方法及其试剂盒
CN105463136A (zh) 用于鸡传染性支气管炎病毒rt-pcr分型检测的试剂盒
CN102286639A (zh) 甲型h1n1/甲型流感病毒核酸双重荧光pcr检测试剂盒
CN102071263B (zh) 禽流感病毒h5亚型套式荧光rt-pcr检测试剂及检测试剂盒
CN102643931B (zh) 鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的rt-pcr法
CN105296675A (zh) 一种乙型流感病毒核酸检测试剂盒及其制备方法
CN104131009A (zh) 一种检测不同流感病毒的引物组合物及其应用
CN105176980A (zh) 一种可同步检测7种鱼类病毒的多重pcr方法
CN105002169A (zh) 3型鸭肝炎病毒荧光定量rt-lamp检测试剂盒及其应用和方法
CN102827952A (zh) 柯萨奇病毒a10核酸检测用引物、探针及试剂盒
CN107287352A (zh) 鸭肠炎病毒和鸭肝炎病毒快速检测的探针引物组及其方法
CN102146485B (zh) 流感病毒一步rt-pcr检测试剂盒
CN115323075B (zh) 一种检测鸡传染性支气管炎病毒及基因分型的rt-raa引物探针组、试剂盒及其应用
CN105671209A (zh) 一种检测牛冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160203