CN105296673A - 一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域,具体涉及一种甲型流感病毒反转录-重组酶多聚酶扩增(RT-RPA)检测试剂盒及其制备方法。本发明涉及的检测试剂盒由RT-RPA反应体系、RNA酶抑制剂、甲型流感病毒M片段阳性质粒Puc-AM、阴性质控品、M片段RPA引物和exo探针组成。用特异性引物和探针,通过配制RT-RPA反应体系,置入Twista实时荧光检测仪进行实时荧光检测,建立了一种快速、敏感、特异的甲型流感病毒等温实时荧光核酸检测方法。本发明涉及特异性RPA引物和exo探针在甲型流感病毒感染临床鉴别诊断和病毒分离株鉴定中的用途。

Description

一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域,具体涉及一种甲型流感病毒反转录-重组酶多聚酶扩 增检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
[0002] 甲型流感病毒属于正粘病毒科,基因组由8个负链单股RNA节段组成,至少编码11 种蛋白。甲型流感病毒的宿主分布广,可感染禽、人、猪、马、狗、猫、海洋哺乳动物(海豹、鲸 等)等。在整个甲型流感病毒的生态分布中,野生水禽和海岸鸟是主要的自然贮存宿主和 基因库,目前发现的大多数甲型流感病毒亚型(16个Η亚型和9个N亚型)都存在于野生 水禽中。20世纪人类经历了 3次流感大流行,分别是1918年西班牙流感(Η1Ν1)、1957年亚 洲流感(Η3Ν2)和1968年香港流感(Η3Ν2)。据WHO估计,全球每年约有25-50万人死于季 节性流感引发的疾病。甲型流感是人类季节性流感病毒主要成员,可以感染所有人群,对一 些特殊人群(如孕妇、老年人和基础性疾病患者)能引起严重疾病乃至死亡。季节性流感 是由流感病毒引起的一种人类重要的全球性呼吸道传染病,热带地区常年流行,而在温带 地区主要发生在冬季,具有一定的季节性流行特点。目前在人群中流行主要是甲型H1N1和 H3N2亚型流感病毒。WHO在全球建立了季节性流感监测网络,以了解病毒流行情况,为流感 全球防控和疫苗研制提供科学依据。
[0003] 甲型流感病毒是人类流感监测和临床诊断关注的重点病毒。甲型流感病毒的检 测方法主要包括血清学和核酸检测,血清学方法主要用标准血清对分离到的病毒株进行 抗原分型,耗时费力,不适合临床快速分型诊断。目前核酸检测方法主要包括普通PCR法、 Real-timetimePCR法和环等温扩增(LAMP)法等。Real-timetimePCR法和LAMP法具 有很好的特异性和敏感性,但前者依赖昂贵的仪器和试剂;而后者法难以实现多重检测。相 比之下,普通PCR敏感性较差且需要琼脂糖电泳进行结果判定,不适合大规模标本的检测。 因此,需要建立快速敏感、不依赖于昂贵仪器的甲型流感核酸检测方法,以提高流感监测和 临床诊断水平。
发明内容
[0004] 本发明需要解决的问题是提供一种甲型流感病毒反转录-重组酶多聚酶扩增 (RT-RPA)检测试剂盒及其制备方法。
[0005] 本发明提供的甲型流感病毒RT-RPA检测试剂盒由RT-RPA反应体系、Μ片段阳性质 粒Puc-AM、阴性质控品、Μ片段RPA引物和exo探针组成,Μ片段RPA引物和exo探针为:
[0006] M-rpaF, 5'ACCGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCGTTCC3' ;
[0007] M-rpaR, 5'CCAAACAAAAGTGCGAGTGGCACGGGTCACTC3' ;
[0008] M-exo-probe,5'GGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAA[dT-FAM]TC[THF] G[dT-BHQ]CACCTCTGACTAAGG[3'-block]3'
[0009] 本发明所述甲型流感病毒RT-RPA检测试剂盒的制备方法;
[0010] (1)病毒核酸提取:采用酚氯仿法提取病毒RNA,具体步骤:取临床鼻咽拭子标本 或病毒培养物核酸100μL,加入含有200ul水饱和酚的1. 5mlEP中,剧烈震荡混匀,静置 3min,加入200ul氯仿,充分震荡混匀,12000g室温离心15分钟;吸取上清液,加入两倍上 清体积的异丙醇,再加入1/10上清体积3M醋酸钠35-45ul,充分混匀后-20°C静置2h;取 出于4°C下,12000g,离心20min;弃上清,加入75%乙醇lml,4°C,12000g,离心20min;弃上 清,室温干燥,加入40ulDEPC水溶解RNA,-70°C冰箱放置备用;
[0011] (2)RT-RPA反应:采用英国TwistDx公司的TwistAmpRTexos试剂盒,取29.5yL 反应缓冲液,分别加入下列组分:引物L-rpaF(lOmM)和L-rpaR(lOmM)各2. 1μL,2. 6μL RPAexo探针(10mM),1μLRNA酶抑制剂(5U),7. 2μL超纯水,5μL标本RNA模板,涡旋震 荡,短暂离心,再加入2. 5μL醋酸镁(280mM)。混合离心后,放入Twista实时荧光检测仪 中,反应温度为40°C,时间为20min。本实验同时设阳性对照和空白阴性对照组。
[0012] 与现有技术相比,本发明的有益效果是:
[0013] 设计针对甲型流感病毒Μ基因的RPA引物和exo探针,通过反转录-重组酶多聚 酶扩增方法,反应温度为40°C等温条件下,20min即可对临床流感标本和病毒分离物进行 核酸分子鉴定,无需昂贵仪器设备,便于操作,具有快速、敏感、特异等特点,为甲型流感监 测和临床救治提供一种新的检测方法。
附图说明
[0014] 图1检测甲型流感病毒Μ节段RPA引物琼脂糖凝胶电泳筛选
具体实施方式
[0015] 下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案,但本发明技术的应用不限于 实施例。
[0016] 实施例1 :靶基因质粒构建
[0017] 设计针对甲型流感病毒Μ片段的特异性引物,通过PCR法扩增获得1027bp基因片 段,回收纯化后的与T载体连接,获得靶基因阳性质粒,命名为Puc-AM。
[0018] 实施例2 :引物探针设计与筛选
[0019] 通过序列分析软件分析,以甲型流感病毒较为保守的Μ片段序列为模板,共设计 8条正向引物和12条反向引物,引物长度为30-35bp;同时设计1条exo探针(命名为 M-exo-probe),长度为53bp,其中33位碱基T标记荧光物质FAM,36位碱基由四氢呋喃代 替,38位碱基标记荧光物质BHQ,同时封闭3'末端碱基。
[0020] 采用TwistAmpBasickit(TwistDx公司,英国),以革巴基因克隆质粒Puc-AM为模 板,以琼脂糖凝胶电泳为结果指示手段,对上述设计的引物进行筛选。引物优劣的评价指标 包括特异性、敏感性、扩增效率和引物噪音等。取29. 5μL反应缓冲液,分别加入下列组分: 上下游引物(10mM)各2. 4yL,12. 2yL超纯水,lyL质粒Puc-L模板。再加入2. 5yL醋酸 镁(280mM)。混合离心后,放入40°C,温育5min。涡旋震荡8-10次,短暂离心,放入40°C, 反应20min。取反应产物2ul放入18ul水中,用酚-氯仿法对DNA进行纯化。1.5%琼脂糖 凝胶电泳检测纯化DNA产物,结果筛选到一组引物,命名为L-rpaF和L-rpaR(图1)。
[0021] 实施例3 :RT-RPA的敏感性
[0022] 将靶基因克隆质粒Puc-AM稀释100倍,再按10倍梯度稀释成10 2-10 9共八个 浓度,以此为模板,进行RT-RPA反应:采用TwistAmpRTexos试剂盒(TwistDx公司,英 国)。取29. 5μL反应缓冲液,分别加入下列组分:引物L-rpaF(lOmM)和L-rpaR(lOmM)各 2. 1μL,2. 6μLRPAexo探针(10mM),1μLRNA酶抑制剂(5U),7. 2μL超纯水,5μL标本 RNA模板。涡旋震荡,短暂离心。再加入2. 5yL醋酸镁(280mM)。混合离心后,放入Twista 实时荧光检测仪中,反应温度为40°C,时间为20min。
[0023] 本实验中所建立的RT-RPA方法可以检测下限是15copies/ μ L,具有较好的敏感 性。
[0024] 实施例3 :RT-RPA的特异性
[0025] 以乙型流感、登革热病毒、呼吸道冠状病毒、鼻病毒、呼吸道合胞体病毒核酸为模 板、,用设计的RPA引物和exo探针进行RT-RPA实验。结果对上述毒核酸都没有荧光信号 检出,表明建立的RT-RPA方法具有较好的特异性。。
[0026] 实施例3:临床标本检测
[0027] 收集45份甲型流感病毒临床样本,所有标本都通过细胞培养进行病毒分离。
[0028] (1)病毒RNA提取
[0029] 采用酚氯仿法提取病毒RNA,具体步骤:1.取血清标本100μL,加入含有200ul水 饱和酚的1. 5mlEP中,剧烈震荡混匀,静置3min,加入200ul氯仿,充分震荡混匀,12000g 室温离心15分钟。2.吸取上清液,加入两倍上清体积的异丙醇,再加入1/10上清体积3M 醋酸钠约40ul,充分混匀后-20°C静置2h;取出于4°C下,12000g,离心20min。3.弃上清, 加入75%乙醇lml,4°C,12000g,离心20min。4·弃上清,室温干燥,加入40ulDEPC水溶解 RNA〇
[0030] (2)RT-RPA反应:采用公司的TwistAmpRTexos试剂盒(TwistDx公司,英国)。取 29. 5yL反应缓冲液,分别加入下列组分:引物L-rpaF(lOmM)和L-rpaR(lOmM)各2.lyL, 2. 6μLM-exo探针(10mM),1μLRNA酶抑制剂(5U),7. 2μL超纯水,5μL标本RNA模板。 涡旋震荡,短暂离心。再加入2.5yL醋酸镁(280mM)。混合离心后,放入Twista实时荧光 检测仪中,反应温度为40°C,时间为20min时间为20min。本实验同时设阳性对照和空白阴 性对照组。
[0031] 结果45份临床样本,RT-RPA检测阳性的有30份,阴性15份,结果与病毒分离结 果完全一致。

Claims (2)

1. 一种基于反转录-重组酶多聚酶扩增的甲型流感病毒检测试剂盒,其特征是试剂盒 由RT-RPA反应体系、RNA酶抑制剂、Μ片段阳性质粒Puc-AM、阴性质控品、Μ片段RPA引物 和exo探针组成,Μ片段RPA引物和exo探针为: M-rpaF, 5'ACCGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCGTTCC3'; M-rpaR, 5'CCAAACAAAAGTGCGAGTGGCACGGGTCACTC3'; M-exo-probe, 5'GGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAA[dT-FAM]TC[THF]G[dT-BHQ]CAC CTCTGACTAAGG[3' -block]3'〇
2. 根据权利要求1所述一种基于反转录-重组酶多聚酶扩增的甲型流感病毒检测试剂 盒的制备方法,其特征是由以下步骤构成: (1) 病毒核酸提取:采用酚氯仿法提取病毒RNA,具体步骤:取临床鼻咽拭子标本或病 毒培养物核酸100μL,加入含有200ul水饱和酚的1. 5mlEP中,剧烈震荡混匀,静置3min, 加入200ul氯仿,充分震荡混匀,12000g室温离心15分钟;吸取上清液,加入两倍上清体积 的异丙醇,再加入1/10上清体积3M醋酸钠35-45ul,充分混匀后-20°C静置2h;取出于4°C 下,12000g,离心20min;弃上清,加入75%乙醇lml,4°C,12000g,离心20min;弃上清,室温 干燥,加入40ulDEPC水溶解RNA,-70°C冰箱放置备用; (2) RT-RPA反应:采用TwistAmp RT exos试剂盒,取29. 5 μ L反应缓冲液,分别加入下 列组分:引物1-1«^卩1〇1111和1^-1«^1?1〇1111各2.141^,2.6 41^1«^61〇探针1〇1111,141^1?熟 酶抑制剂5U,7. 2 μ L超纯水,5 μ L标本RNA模板;涡旋震荡,短暂离心;再加入2. 5 μ L醋酸 镁280mM,混合离心后,放入Twista实时荧光检测仪中,反应温度为40°C,时间为20min。
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