CN110468238A - 一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组、试剂盒及应用 - Google Patents
一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组、试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组、试剂盒及应用，所述引物探针组包括：具有SEQ ID NO.1‑6所示核苷酸序列的引物，以及，具有SEQ ID NO.7‑9所示核苷酸序列的探针。本发明的引物探针主要应用于恒温检测流程，既适用于普通的荧光探针恒温扩增，简单快速的特点，可以利用现有仪器设备直接检测；又适合于应用不对称技术通过恒温扩增芯片进行现场检测，操作简单，价格便宜，自动化程度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组、试剂盒及应用。
背景技术
流感病毒(influenza virus)是最常见的呼吸道病毒，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。由于甲型流感病毒与乙型流感病毒的治疗方案略有不同。甲型和乙型流感作为最常见的流感病毒类型，从2017年至今，几乎每年在国内发生一次流行。由于其初期症状与普通感冒类似，患者往往会选择基层社区诊疗机构进行诊断。然而，目前社区可以利用的基于抗原抗体的检测手段临床上存在一定的窗口期，利用核酸扩增手段检测甲型和乙型流感可以有效缩短窗口期，提高检测灵敏度。
目前的检测技术包括：利用多重PCR(聚合酶链式反应)技术，实现了对甲型流感和乙型流感的检测，但该方法应用的是变温扩增技术，适用于大型医院检验实验室，不适合基层医疗单位。另外一种是利用RPA技术(recombinase polymerase amplification，重组酶聚合酶扩增技术)实现了对甲型和乙型流感的检测，检测速度较快，但其检测后采取的分析方式仍然为荧光分析，且采用了nfo内切酶探针技术，检测体系复杂程度和检测技术难度仍然较大。因此，目前仍然缺乏适合基层检验的简单便宜自动化程度高的甲型和乙型流感检测试剂。
因此，现有技术存在不足，需要改进。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组、试剂盒及应用。
本发明的技术方案如下：提供一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组，包括：具有SEQ ID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，具有SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列的探针。
本发明还提供一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组，包括：具有SEQ ID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，具有SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列的探针，其中SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.5所示核苷酸序列中自5’端标记生物素；在SEQID NO.7/SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9所示核苷酸序列中，自5’端标记氨基。
本发明还提供一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的试剂盒，包括：扩增反应液、酶混合液、及芯片，所述扩增反应液中包含如上所述的引物，所述芯片包括壳体和固定在所述壳体内部用于检测甲型和乙型流感病毒的试纸条。
所述试纸条包括设置在背光板上的依次搭接的样品垫、标记垫、固相载体和吸水纸。
所述固相载体上交联有如上所述的探针。
进一步地，所述扩增反应液包括：10mM～100mM的TrisAc缓冲液、20mM～80mM的醋酸钾、重量百分比为4％～8％的PEG20000、3mM～50mM的dNTPs、3μM～100μM的磷酸肌酸、3μM～100μM的肌酸激酶，所述引物的总量为5pM～20pM，其中SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3/SEQID NO.5所示核苷酸序列与SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.4/SEQ ID NO.6所示核苷酸序列按照1.5:1的比例混合；所述酶混合液包括：RecA蛋白、UvY蛋白、BSU DNA聚合酶、MMLV逆转录酶；上述组份按反应终浓度计算，将所述扩增反应液与所述酶混合液分为两管，使用前将两者混合均匀。
所述标记垫包括胶体金、彩色乳胶微球及量子点中的任一种，在所述标记垫上标记SA。
所述探针与点样液相互配合后通过丙二醛交联在固相载体中。
所述固相载体为玻璃片、NC膜、PVDF膜中的任一种。
所述试剂盒还含有稀释液、阴性对照、乙型流感阳性对照以及甲型流感阳性对照。
进一步地，所述稀释液的主要成分为PBST和硫酸葡聚糖的混合物。
所述阴性对照为Hela细胞，所述乙型流感阳性对照及甲型流感阳性对照均为含有目标区段的盔甲RNA。
进一步地，所述试剂盒按照以下方法制备：
将引物探针进行标记；
配制反应体系，包括扩增反应液和酶混合液；
将探针固定在固相载体中；
在储液槽中加入稀释液后用铝箔密封；
在固相载体的一端固定标记垫，另一端固定试纸条；
将点样后的试纸条、储液槽组装进芯片卡夹。
本发明还提供一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的试剂盒，包括：扩增反应液、酶混合液、及芯片，所述扩增反应液中包含如上所述的引物，所述芯片包括壳体和固定在所述壳体内部用于检测甲型和乙型流感病毒的试纸条。
所述试纸条包括设置在背光板上的依次搭接的样品垫、标记垫、固相载体和吸水纸。
所述扩增反应液中含有荧光染料。
进一步地，所述扩增反应液包括：10mM～100mM的TrisAc缓冲液、20mM～80mM的醋酸钾、重量百分比为4％～8％的PEG20000、3mM～50mM的dNTPs、3μM～100μM的磷酸肌酸、3μM～100μM的肌酸激酶，所述引物的总量为5pM～20pM，其中SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3/SEQID NO.5所示核苷酸序列与SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.4/SEQ ID NO.6所示核苷酸序列按照1.5:1的比例混合，所述荧光染料的用量为范围为100nM～200nM；所述酶混合液包括：RecA蛋白、UvY蛋白、BSU DNA聚合酶、MMLV逆转录酶；上述组份按反应终浓度计算，将所述扩增反应液与所述酶混合液分为两管，使用前将两者混合均匀。
所述标记垫包括胶体金、彩色乳胶微球及量子点中的任一种，在所述标记垫上标记SA。
所述固相载体为玻璃片、NC膜、PVDF膜中的任一种。
所述试剂盒还含有稀释液、阴性对照、乙型流感阳性对照以及甲型流感阳性对照。
进一步地，所述稀释液的主要成分为PBST和硫酸葡聚糖的混合物。
所述阴性对照为Hela细胞，所述乙型流感阳性对照及甲型流感阳性对照均为含有目标区段的盔甲RNA。
进一步地，所述试剂盒按照以下方法制备：
配制反应体系，包括扩增反应液和酶混合液；
在储液槽中加入稀释液后用铝箔密封；
在固相载体的一端固定标记垫，另一端固定试纸条；
将点样后的试纸条、储液槽组装进芯片卡夹。
本发明还提供一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒试剂盒的应用，使用如上所述的试剂盒进行甲型和乙型流感病毒的检测，包括以下具体步骤：
步骤S1，提取核酸；
步骤S2，配制反应体系，将所述组合缓冲液与所述酶混合液按照比例混合，组成反应体系；
步骤S3，将提取后的核酸和反应体系混合；
步骤S4，将所述步骤S3得到的混合反应体系置于30-41℃恒温下进行25min～45min扩增反应；
步骤S5，将所述步骤S4得到的混合反应体系进行稀释并杂交显色，杂交的方式包括微流控、侧向层析、渗滤中的任一种；
步骤S6，反应结果的判读：通过核酸检测装置进行判读。采用上述方案，本发明的引物探针主要应用于恒温检测流程，既适用于普通的荧光探针恒温扩增，简单快速的特点，可以利用现有仪器设备直接检测；又适合于应用不对称技术通过恒温扩增芯片进行现场检测，操作简单，价格便宜，自动化程度高。
附图说明
图1为本发明一实施例中试剂盒的制备流程图；
图2为本发明另一实施例中试剂盒的制备流程图；
图3使用本发明试剂盒进行甲型和乙型流感病毒的检测的流程图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明提供一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组，包括：具有SEQID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列的探针，如表1所示，其中SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.5所示核苷酸序列中自5’端标记生物素。本发明通过BLAST比对选择甲型流感病毒M2基因和乙型流感病毒NS2基因，然后选择人RNase P基因12亚基作为反应的内标。
表1、引物探针序列表
本发明还提供一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的试剂盒，包括：扩增反应液、酶混合液、及芯片，所述扩增反应液中包含如上所述的引物，所述芯片包括壳体和固定在所述壳体内部用于检测甲型和乙型流感病毒的试纸条。所述试纸条包括设置在背光板上的依次搭接的样品垫、标记垫、固相载体和吸水纸。所述固相载体上交联有如上所述的探针。
所述扩增反应液包括：10mM～100mM的TrisAc缓冲液、20mM～80mM的醋酸钾、重量百分比为4％～8％的PEG20000、3mM～50mM的dNTPs、3μM～100μM的磷酸肌酸、3μM～100μM的肌酸激酶以及如上所述的引物，所述引物的总量为5pM～20pM，其中SEQ ID NO.1/SEQ IDNO.3/SEQ ID NO.5所示核苷酸序列中自5’端标记生物素后按照1.5:1的比例与SEQ IDNO.2/SEQ ID NO.4/SEQ ID NO.6混合。所述酶混合液包括：RecA蛋白、UvY蛋白、BSU DNA聚合酶、MMLV逆转录酶。上述组份的浓度均按反应终浓度计算。将所述扩增反应液与所述酶混合液分为两管，使用前将两者混合均匀。
所述固相载体上负载有如上所述的探针组，其中在SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9所示核苷酸序列中自5’端标记氨基后与点样液相互配合，通过丙二醛交联于固相载体中。所述固相载体一端负载有标记垫，另一端连接吸水纸，所述固相载体包括但不限于NC膜、玻璃片、PVDF膜中的任一种。所述标记垫包括但不限于胶体金、彩色乳胶微球及量子点中的任一种，在所述标记垫上标记SA。反应完成后反应产物通过所述引物上标记的生物素与含有SA标记的标记垫偶联后通过DNA杂交使标记的对应区域显色或发光。
所述试剂盒还含有稀释液、阴性对照、乙型流感阳性对照以及甲型流感阳性对照，具体地，本实施例中，所述稀释液的主要成分为PBST(磷酸缓冲盐溶液)和硫酸葡聚糖的混合物。所述阴性对照为Hela细胞，所述乙型流感阳性对照及甲型流感阳性对照均为含有目标区段的盔甲RNA。
请参阅图1，所述试剂盒的制备方法，包括以下具体步骤：
引物探针的标记，在SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.5所示核苷酸序列中，自5’端标记生物素，在SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9所示核苷酸序列中，自5’端标记氨基。
配制反应体系，具体地，本实施例中，所述扩增反应液包括：10mM PH值为8.0的TrisOAc缓冲液，30mM的醋酸钾，重量百分比为7％的PEG1000，7.5pM的SEQ1，5.0pM的SEQ2，4.5pM的SEQ3，3.0pM的SEQ4，1.5pM的SEQ5，1.0pM的SEQ6，50ng/μL的磷酸肌酸，300U/ml的肌酸激酶，10-100μg的模板，0.5μM的dNTPs。所述酶混合液包括：80ng/μL的RecA蛋白，20ng/μLUvY蛋白，0.2U/μL BSU DNA聚合酶，0.05U/μL的MMLV逆转录酶。上述组份的浓度均按反应终浓度计算。将所述扩增反应液与所述酶混合液分为两管，使用前将两者混合均匀。
探针的固定，探针通过固定液固定到固相载体中，具体地，所述固相载体包括但不限于玻璃片、硝酸纤维素膜(NC膜)、PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)中的任一种，具体地，本实施例中采用的是NC膜。所述固定液主要成分为PH值为9.6的3×SSC(柠檬酸钠缓冲液)、体积百分比为0.5％的戊二醛及重量百分比为0.1％的溴酚蓝三者的混合物。
在储液槽中加入稀释液后用铝箔密封，所述稀释液的用量为105μL，主要成分为0.2M的PBST(磷酸缓冲盐溶液)和0.1M的硫酸葡聚糖的混合物，储液槽的槽口加入10μL14mM的醋酸镁，并进行风干。
在NC膜一端固定标记垫，另一端固定吸水纸。所述标记垫的主要成分为SA标记的彩色乳胶微球。
将点样后的试纸条、储液槽组装进芯片卡夹。
本发明还提供一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的试剂盒，包括：扩增反应液、酶混合液、及芯片，所述扩增反应液中包含如上所述的引物，所述芯片包括壳体和固定在所述壳体内部用于检测甲型和乙型流感病毒的试纸条。所述试纸条包括设置在背光板上的依次搭接的样品垫、标记垫、固相载体和吸水纸。所述扩增反应液中含有荧光染料，本实施例中不采用探针组，而是用荧光染料替代。
所述扩增反应液包括10mM～100mM的TrisAc缓冲液、20mM～80mM的醋酸钾、重量百分比为4％～8％的PEG20000、3mM～50mM的dNTPs、3μM～100μM的磷酸肌酸、3μM～100μM的肌酸激酶以及如上所述的引物，所述引物的总浓度为5pM～20pM，其中SEQ ID NO.1/SEQ IDNO.3/SEQ ID NO.5所示核苷酸序列按照1.5:1的比例与SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.4/SEQ IDNO.6混合，所述荧光染料的用量为范围为100nM～200nM。所述酶混合液包括：RecA蛋白、UvY蛋白、BSU DNA聚合酶、MMLV逆转录酶。上述组份的浓度均按反应终浓度计算。将所述扩增反应液与所述酶混合液分为两管，使用前将两者混合均匀。
所述固相载体一端负载有标记垫，另一端连接吸水纸，所述固相载体包括但不限于NC膜、玻璃片、PVDF膜中的任一种。所述标记垫包括但不限于胶体金、彩色乳胶微球及量子点中的任一种，在所述标记垫上标记SA。反应完成后反应产物通过所述引物上标记的生物素与含有SA标记的标记垫偶联后通过DNA杂交使标记的对应区域显色或发光。
所述试剂盒还含有稀释液、阴性对照、乙型流感阳性对照以及甲型流感阳性对照，具体地，本实施例中，所述稀释液的主要成分为PBST(磷酸缓冲盐溶液)和硫酸葡聚糖的混合物。所述阴性对照为Hela细胞，所述乙型流感阳性对照及甲型流感阳性对照均为含有目标区段的盔甲RNA。
请参阅图2，所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
配制反应体系；具体地，本实施例中，所述扩增反应液包括：60mM PH值8.0的TrisAc缓冲液，20mM的醋酸钾，重量百分比为5％的PEG20000，7.5pM的SEQ1，5.0pM的SEQ2，4.5pM的SEQ3，3.0pM的SEQ4，1.5pM的SEQ5，1.0pM的SEQ6，50ng/μL的磷酸肌酸，300U/ml的酸激酶，10-100μg的模板，0.5μM的dNTPs，0.2μL的荧光染料。所述酶混合液包括：90ng/μL的RecA蛋白，20ng/μL的UvY蛋白，0.2U/μL的BSU DNA聚合酶，0.05U/μL的MMLV逆转录酶。上述浓度按反应时终浓度计算，将所述扩增反应液与所述酶混合液分为两管，使用前将两者混合均匀。
在储液槽中加入稀释液后用铝箔密封，所述稀释液的用量为105μL，主要成分为0.2M的PBST和0.1M的硫酸葡聚糖的混合物，储液槽的槽口加入10μL 14mM的醋酸镁，并进行风干。
在固相载体一端固定标记垫，另一端固定吸水纸；具体地，本实施例中，所述固相载体为NC膜，所述标记垫的主要成分为SA标记的彩色乳胶微球。
将点样后的试纸条、储液槽组装进芯片卡夹。
请参阅图3，本发明还提供一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒试剂盒的应用，使用如上两种所述的试剂盒进行甲型和乙型流感病毒的检测，包括以下具体步骤：
步骤S1，提取核酸。
步骤S2，配制反应体系，将所述扩增反应液与所述酶混合液按照比例混合，组成反应体系。
步骤S3，将提取后的核酸和反应体系混合。
步骤S4，将所述步骤S3得到的混合反应体系置于30-41℃的恒温下反应25min-45min下进行扩增检测。
步骤S5，将所述步骤S4得到的混合反应体系与稀释液混合，进行杂交显色反应。其中杂交方式包括但不限于微流控，侧向层析，渗滤等方式。
步骤S5，反应结果的判读：通过核酸检测装置进行判读。
综上所述，本发明的引物探针主要应用于恒温检测流程，既适用于普通的荧光探针恒温扩增，简单快速的特点，可以利用现有仪器设备直接检测；又适合于应用不对称技术通过恒温扩增芯片进行现场检测，操作简单，价格便宜，自动化程度高。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市芯思微生物科技有限公司
<120> 一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组、试剂盒及应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5 10 15
Thr Cys Thr Cys Thr Cys Thr Ala Thr Cys
20 25
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Cys Thr Ala Ala Gly Gly Gly Ala Ala Thr Thr Thr Thr Arg Gly
1 5 10 15
Gly Arg Thr Thr Thr Gly Thr Gly Thr Thr Cys
20 25
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Thr Thr Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Ala Gly
20 25
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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1 5 10 15
Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Cys
20 25
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<211> 32
<212> DNA
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<400> 5
ttcaaactta tattgaagaa gtgactttag tt 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taactaaaag taaggaatcc tatttcaaag ac 32
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<212> PRT
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<400> 7
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1 5 10 15
Cys Thr Ala Ala
20
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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1 5 10 15
Ala Cys Thr Thr Thr
20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcactgctt catgcctacg 20
Claims (10)
1.一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组，其特征在于，包括：具有SEQID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，具有SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列的探针，其中SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.5所示核苷酸序列中自5’端标记生物素；在SEQ IDNO.7/SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9所示核苷酸序列中，自5’端标记氨基。
2.一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，包括：扩增反应液、酶混合液、及芯片，所述扩增反应液中包含权利要求1所述的引物，所述芯片包括壳体和固定在所述壳体内部用于检测甲型和乙型流感病毒的试纸条；
所述试纸条包括设置在背光板上的依次搭接的样品垫、标记垫、固相载体和吸水纸；
所述固相载体上交联有权利要求1所述的探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液包括：10mM～100mM的TrisAc缓冲液、20mM～80mM的醋酸钾、重量百分比为4％～8％的PEG20000、3mM～50mM的dNTPs、3μM～100μM的磷酸肌酸、3μM～100μM的肌酸激酶，所述引物的总量为5pM～20pM，其中SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.5所示核苷酸序列与SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.4/SEQ ID NO.6所示核苷酸序列按照1.5:1的比例混合；所述酶混合液包括：RecA蛋白、UvY蛋白、BSU DNA聚合酶、MMLV逆转录酶；上述组份按反应终浓度计算，将所述扩增反应液与所述酶混合液分为两管，使用前将两者混合均匀；
所述标记垫包括胶体金、彩色乳胶微球及量子点中的任一种，在所述标记垫上标记SA；
所述探针与点样液相互配合后通过丙二醛交联在固相载体中；
所述固相载体为玻璃片、NC膜、PVDF膜中的任一种；
还含有稀释液、阴性对照、乙型流感阳性对照以及甲型流感阳性对照。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液的主要成分为PBST和硫酸葡聚糖的混合物；
所述阴性对照为Hela细胞，所述乙型流感阳性对照及甲型流感阳性对照均为含有目标区段的盔甲RNA。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒按照以下方法制备：
将引物探针进行标记；
配制反应体系，包括扩增反应液和酶混合液；
将探针固定在固相载体中；
在储液槽中加入稀释液后用铝箔密封；
在固相载体的一端固定标记垫，另一端固定试纸条；
将点样后的试纸条、储液槽组装进芯片卡夹。
6.一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，包括：扩增反应液、酶混合液、及芯片，所述扩增反应液中包含权利要求1所述的引物，所述芯片包括壳体和固定在所述壳体内部用于检测甲型和乙型流感病毒的试纸条；
所述试纸条包括设置在背光板上的依次搭接的样品垫、标记垫、固相载体和吸水纸；
所述扩增反应液中含有荧光染料。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液包括：10mM～100mM的TrisAc缓冲液、20mM～80mM的醋酸钾、重量百分比为4％～8％的PEG20000、3mM～50mM的dNTPs、3μM～100μM的磷酸肌酸、3μM～100μM的肌酸激酶，所述引物的总量为5pM～20pM，其中SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.5所示核苷酸序列与SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.4/SEQ ID NO.6所示核苷酸序列按照1.5:1的比例混合，所述荧光染料的用量为范围为100nM～200nM；所述酶混合液包括：RecA蛋白、UvY蛋白、BSU DNA聚合酶、MMLV逆转录酶；上述组份按反应终浓度计算，将所述扩增反应液与所述酶混合液分为两管，使用前将两者混合均匀；
所述标记垫包括胶体金、彩色乳胶微球及量子点中的任一种，在所述标记垫上标记SA；
所述固相载体为玻璃片、NC膜、PVDF膜中的任一种；
还含有稀释液、阴性对照、乙型流感阳性对照以及甲型流感阳性对照。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液的主要成分为PBST和硫酸葡聚糖的混合物；
所述阴性对照为Hela细胞，所述乙型流感阳性对照及甲型流感阳性对照均为含有目标区段的盔甲RNA。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒按照以下方法制备：
配制反应体系，包括扩增反应液和酶混合液；
在储液槽中加入稀释液后用铝箔密封；
在固相载体的一端固定标记垫，另一端固定试纸条；
将点样后的试纸条、储液槽组装进芯片卡夹。
10.一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒试剂盒的应用，其特征在于，使用如权利要求2～9任一项所述的试剂盒进行甲型和乙型流感病毒的检测，包括以下具体步骤：
步骤S1，提取核酸；
步骤S2，配制反应体系，将所述组合缓冲液与所述酶混合液按照比例混合，组成反应体系；
步骤S3，将提取后的核酸和反应体系混合；
步骤S4，将所述步骤S3得到的混合反应体系置于30-41℃的恒温下进行25min～45min的扩增反应；
步骤S5，将所述步骤S4得到的混合反应体系进行稀释并杂交显色，所述杂交方式包括微流控、侧向层析、渗滤中的任一种；
步骤S6，反应结果的判读：通过核酸检测装置进行判读。
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