CN108486258A - 一种可视快速检测食源性致病菌的试剂盒及其方法 - Google Patents

一种可视快速检测食源性致病菌的试剂盒及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种可视快速检测食源性致病菌的试剂盒及其方法，采用多重环介导等温扩增结合胶体金免疫层析法同时检测食品中副溶血性弧菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种食源性致病菌，其包括引物、LAMP扩增反应体系和胶体金免疫层析三重检测试纸；本发明将LAMP的高灵敏度和胶体金免疫层析方法快速简便的优点结合起来，同时检测分析出三种食源性致病菌，实现对所扩增的目标核酸片段的特异性检测，从而最终建立食源性致病菌的LAMP‑胶体金免疫层析快速检测鉴定的新方法。

Description

一种可视快速检测食源性致病菌的试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种可视快速检测食源性致病菌的试剂盒及其方法。
背景技术
食源性致病菌在各种食品中的分布广泛并且残留量很低，因此建立相应的检测方法并提高检测准确性和检测效率是保障食品安全，避免食源性疾病爆发的重要手段之一。食源性致病菌的检测方法主要有培养法、免疫学法(如ELISA以及免疫层析试纸条法)、分子生物学法(如常规PCR、荧光定量PCR、恒温扩增等方法)等。各种检测方法均有各自的优势和缺点：检测方法繁琐，检测时间长，灵敏度低，容易发生漏检和错检，传统的检测方法已无法满足目前食品快速检测的要求；相较于传统培养法检测食源性致病菌，基于免疫学和基于PCR的快速检测方法更为快速、敏感性更好，由于仪器和试剂昂贵、需专业技术人员操作，以及PCR易污染等限制了这些方法的广泛应用。
本发明为多重环介导等温扩增(LAMP)结合胶体金免疫层析法检测食源性病原菌。单管多重LAMP检测方法，达到一次性快速检测多种食源性致病菌的目的，而多重LAMP扩增产物不能像多重PCR那样通过电泳或测序来判别其检测体系中具体存在何种病原DNA，因此，本发明将环介导等温扩增的高灵敏度和胶体金免疫层析方法快速简便的优点结合起来，同时检测分析出多种食源性致病菌，实现对所扩增的目标核酸片段的特异性检测。LAMP-胶体金免疫层析法是一种灵敏度高、特异性强又简便、直观、经济的食源性致病菌检测方法，充分发挥分子生物学和免疫学两种检测方法的优长，大大提高了食源性致病菌的检测效率和准确率。
发明内容
本发明的目的是提供一种可视快速检测食源性致病菌的方法，该方法采样多重环介导等温扩增(LAMP)结合胶体金免疫层析法同时快速的检测分析出三种食源性致病菌，充分发挥分子生物学和免疫学两种检测方法的优长，大大提高了食源性致病菌的检测效率和准确率。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一种可视快速检测食源性致病菌的试剂盒，该试剂盒采用多重环介导等温扩增结合胶体金免疫层析法同时检测食品中副溶血性弧菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种食源性致病菌，其包括引物、LAMP扩增反应体系和胶体金免疫层析三重检测试纸；
(1)引物：包括含FIP、BIP、F3、B3、LoopF和LoopB，其中BIP引物标记上FITC抗体，LoopB引物标记上荧光探针；
引物序列如下：
tlh-FIP：CTGTCACCGAGTGCAACCACTT-AACCACACGATCTGGAGCA；
tlh-BIP-FITC：GCATCACAATGGCGCTTCCC-ACCGTTGGAGAAAGTGACCTA，5’端标记荧光素；
tlh-F3：CGCTGACAATCGCTTCTCAT；
tlh-B3：GTTCTTCGCTTTGGCAATGT；
tlh-LF：CTGCATTGCTGCGTCGT；
tlh-LB-Bio：TAACCCGAACAGCTGGTTCT，5’端标记生物素；
invA-FIP：GCATCCGCATCAATAATACCG-CTCTGGATGGTATGCCCGG；
invA-BIP-FITC：GAACGGCGAAGCGTACTGGAA-CATCGCACCGTCAAAGGAA，5’端标记荧光素；
invA-F3：GTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGT；
invA-B3：CCGCCAATAAAGTTCACAAAGAT；
invA-LF：TCTGGATGGTATGCCCGGT；
invA-LB-TEX：CATCGCACCGTCAAAGGAA，5’端标记德克萨斯红；
iap-FIP：AGGTTTTGCTTGAGATTCAGAGAT-TAATCTCCCTTCCACGTACT；
iap-BIP-FITC：TTGACTATGGTAGCGGAATTTCTC-TTAACGCCATTGTCTTGC，5’端标记荧光素；
iap-F3：CTGGTTACACTAAATATGTATTTGC；
iap-B3：GCCGTGGATGTTATCGTAT；
iap-LF：GTAGTGCTAGCGTATTGTGCG；
iap-LB-DIG：GGTATCTACGTTGGTAATGGTCAA，5’端标记地高辛精；
(2)LAMP扩增反应体系：每25μl反应液含2.5μl 10×的缓冲液，3.5μl dNTP混合液(每一种10mM)，3.9μl引物混合物，其中每组引物各加1.3μl，1μl Bst聚合酶，1μl DNA样品，无菌去离子补余；
(3)胶体金免疫层析三重检测试纸：试纸由缓冲液垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。
所述试纸的尺寸为5mm×77mm，硝酸纤维素膜的长度为25mm。
所述胶体金结合垫上标记链霉亲和素，硝酸纤维素膜上分别点上链霉亲和素、小鼠抗DIG单克隆抗体和德克萨斯红抗体作为检测线T1、T2和T3，点上羊抗鼠抗体作为质控线C。
本发明还提供了一种可视快速检测食源性致病菌的方法，包括以下步骤：
(1)LAMP扩增反应体系为：每25μl反应液含2.5μl 10×的缓冲液，3.5μl dNTP混合液(每一种10mM)，3.9μl引物混合物，其中每组引物各加1.3μl，1μl Bst聚合酶，1μl DNA样品，其余用无菌去离子水补齐；所述的缓冲液成分为200mM MOPs，100mM KCl，pH8.8的100mM(NH4)2SO4，1μl的200mM MgCl2；
(2)扩增反应条件：扩增温度63.5℃，于恒温水浴锅中反应45min；80℃加热2min终止反应；
(3)扩增反应结束：4μL的多重LAMP产物和16μL的含1×PBS和1％v/v吐温-20的缓冲液混合后滴于靠近结合垫的硝酸纤维素膜的检测区；垂直竖起试纸并将缓冲液垫浸入250μL含1×PBS和1％v/v吐温-20的缓冲液中，10-15min后肉眼可视检测结果；
(4)结果判定：C线和T1线、T2线、T3线都显色则检测的三种致病菌结果都为阳性；C线和T1线、T2线显色而T3线不显色的检测结果：标记FITC-Bio的致病菌和标记FITC-TEX的致病菌为阳性，标记FITC-DIG的致病菌则为阴性，如此类推；C线和T1线显色而T2线和T3线不显色的检测结果：标记FITC-Bio的致病菌为阳性，其它两个为阴性，如此类推；若C线不显色则结果不能判断。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
相较于传统培养法检测食源性致病菌，基于免疫学和基于PCR的快速检测方法更为快速、敏感性更好，由于仪器和试剂昂贵、需专业技术人员操作，以及PCR易污染等限制了这些方法的广泛应用。相较于多重PCR，多重LAMP做得较少，本发明含单管多重LAMP检测法可以在同时检测三种食源性致病菌，达到一次性快速检测多种食源性致病菌的目的。而多重LAMP扩增产物不能像多重PCR那样通过电泳或测序来判别其检测体系中具体存在何种病原DNA，本发明将LAMP的高灵敏度和胶体金免疫层析方法快速简便的优点结合起来，同时检测分析出三种食源性致病菌，实现对所扩增的目标核酸片段的特异性检测，从而最终建立食源性致病菌的LAMP-胶体金免疫层析快速检测鉴定的新方法。
附图说明
图1为试纸条检测结果示例；
图2为胶体金免疫层析试纸原理图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
一、实施例1
采用LAMP-胶体金免疫层析法快速检测三种食源性致病菌副溶血性弧菌、沙门氏菌和单增李斯特菌。
(1)根据三种食源性致病菌副溶血性弧菌、沙门氏菌和单增李斯特菌待测目的致病菌的靶基因片段设计一组环介导等温扩增引物，含FIP、BIP、F3、B3、LoopF和LoopB。其中BIP引物标记上FITC抗体，而LoopB引物分别标记上Bio、TEX和DIG抗体。引物设计见表1.
表1 LAMP引物序列
(2)反应体系和反应条件：反应体系：每25μl含2.5μl 10×的缓冲液(200mM MOPs，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，pH 8.8)，1μl MgCl2(200mM)，3.5μl dNTP混合液(每一种10mM)，3.9μl引物混合物(每组引物各加1.3μl)，1μl Bst聚合酶，加入1μl DNA样品，其余用无菌去离子水补齐；反应条件：扩增温度63.5℃，于恒温水浴锅中反应45min；80℃加热2min终止反应。
(3)胶体金免疫层析三重检测
A.胶体金-抗体结合物制备
取10m L胶体金溶液(OD522＝1)调节PH值为8，加入40μg FITC抗体，室温搅拌1h；加入1％(W/V)BSA，再室温搅拌1h；混合液在4℃，10,000×g离心30min，去上清，加入保存液(含1％(W/V)BSA和0.05％(W/V)的NaN3的10mM PB缓冲液)悬浮沉淀。
B.制备胶体金免疫层析三重检测试纸制备
试纸条(5mm×77mm)由缓冲液垫、胶体金结合垫、25mm长的NC膜和吸水垫组成。
a.NC膜的处理与包被；b.胶体金结合垫的制备；c.检测试纸卡组装。
C.胶体金免疫层析三重检测
4μL的多重LAMP产物和16μL的缓冲液(1×PBS和1％v/v吐温-20)混合后滴于检测区(靠近结合垫的NC膜)；垂直竖起试纸条并将缓冲液垫浸入250μL缓冲液中，10-15min后肉眼可视检测结果，见下图1。因此，1号样本含有副溶血性弧菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种食源性致病菌，2号样本含有沙门氏菌和单增李斯特菌两种食源性致病菌，3号样本仅含有单增李斯特菌一种食源性致病菌。
二、多重LAMP反应体系的优化试验
每25μl反应体系含2.5μl 10×的缓冲液(200mM MOPs，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，pH 8.8)，1μl MgCl2(200mM)，3.5μl dNTP混合液(每一种10mM)，2.6μl引物混合物，1μl钙黄绿素(仅用于优化反应，检测时以去离子水替代)，1μl Bst聚合酶，加入1μl DNA样品，其余用无菌去离子水补齐；其中引物混合物的比例优化为分别以菌1、菌2和菌3引物原浓度(2.6μmol/L)、引物原浓度的1/2(1.3μmol/L)、引物原浓度的1/3(0.87μmol/L)加至同一LAMP体系，比较扩增效率从而确定多重LAMP体系中最佳引物浓度配比。在三个引物浓度(2.6μmol/L、1.3μmol/L和0.87μmol/L)下，三株菌反应管浊度达到0.1的时间分别为菌1(17、22和30min)、菌2(17、25和35min)和菌3(20、22和26min)。随着引物浓度的降低，引物与模板DNA分子碰撞几率减小，导致反应时间相应延迟，扩增效率降低。若使各引物保持其原浓度不变(即2.6μmol/L)，则较易发生非特异反应。综合考虑扩增效率和非特异反应，我们选择多重LAMP体系中各LAMP引物浓度为其原浓度的1/2(即1.3μmol/L)。
三、多重LAMP反应条件的优化试验
反应条件：选择扩增温度分别为57.5℃，59.8℃，60.8℃，63.5℃，65℃，于恒温水浴锅中反应60min；80℃加热2min终止反应。目测是否产生沉淀或在365nm紫外灯下观察，产生绿色荧光的为阳性反应。结果显示57.5℃，59.8℃，60.8℃这三个温度会出现非特异反应，而65℃会影响扩增效率，需要样本DNA浓度增加。确定最佳反应温度之后，选择LAMP恒温反应时间在15min-60min之间，确定最佳反应时间。实验发现时间对结果的辨别比较重要，浓度低的样本DNA需要较多时间扩增出来，而时间增长会有出现非特异反应的可能且浪费时间。因此，综合考虑扩增效率和非特异反应，我们选择反应的最佳温度为63.5℃最佳反应时间为45min。
四、胶体金免疫层析三重检测试纸原理
胶体金上标记链霉亲和素，硝酸纤维素膜上点上链霉亲和素(或小鼠抗DIG单克隆抗体、德克萨斯红抗体)作为T检测线，点上羊抗鼠抗体作为C质控线，见图2。
T线显色：用FITC-Bio(或者FITC-TEX、FITC-DIG)标记的引物对样品基因组DNA进行LAMP扩增，使扩增的LAMP产物两端标记上FITC和Bio(或TEX、DIG)；胶体金上则标记FITC抗体；试纸条T线上喷有链霉亲和素(或Texas red抗体、Dig抗体)。检测时，将LAMP产物加入胶体金中，LAMP扩增子链上标记的荧光素能够和胶体金-荧光素抗体复合物上的抗荧光素抗体结合，形成复合物胶体金-FITC抗体-LAMP产物；而LAMP产物链上标记的生物素(或TEX、DIG)可以和T线上链霉亲和素(或TEX抗体、DIG抗体)结合，则层析时该复合物可以被T线所捕获，形成胶体金-FITC抗体-LAMP产物-链霉亲和素结构而使T线显色。
C线(质控线)能显色的原因：试纸条的C线上喷上羊抗鼠抗体，则能形成胶体金-FITC抗体-羊抗鼠抗体或胶体金-FITC抗体-(LAMP产物)-羊抗鼠抗体的复合物。检测含食源性致病菌样品时，形成的胶体金-FITC抗体-LAMP产物先被T线上链霉亲和素(或者TEX抗体、DIG抗体)所捕获，多余的复合物或没有完全被T线捕获的，则被随后的C线所捕获形成胶体金-FITC抗体-(LAMP产物)-羊抗鼠抗体的复合物使C线显色。而检测阴性样品或缓冲液时，C线所捕获的只是胶体金-FITC抗体，形成胶体金-FITC抗体-羊抗鼠抗体而显色。
C线和T1线、T2线、T3线都显色则检测的三种致病菌结果都为阳性；C线和T1线、T2线显色而T3线不显色的检测结果：标记FITC-Bio的致病菌和标记FITC-TEX的致病菌为阳性，标记FITC-DIG的致病菌则为阴性，如此类推；C线和T1线显色而T2线和T3线不显色的检测结果：标记FITC-Bio的致病菌为阳性，其它两个为阴性，如此类推；若C线不显色则结果不能判断。
尽管已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域技术人员来说，对上述实施例做出修改或者采用等同的替代方案，这对本领域的技术人员而言是显而易见，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 南昌大学
<120> 一种可视快速检测食源性致病菌的试剂盒及其方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgtcaccga gtgcaaccac ttaaccacac gatctggagc a 41
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcatcacaat ggcgcttccc accgttggag aaagtgacct a 41
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgctgacaat cgcttctcat 20
<210> 4
<211> 20
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<210> 5
<211> 17
<212> DNA
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<400> 5
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<211> 20
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<400> 6
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<211> 40
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<400> 7
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<400> 9
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<211> 23
<212> DNA
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<400> 10
ccgccaataa agttcacaaa gat 23
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
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tctggatggt atgcccggt 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
catcgcaccg tcaaaggaa 19
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
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<400> 13
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<212> DNA
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ttgactatgg tagcggaatt tctcttaacg ccattgtctt gc 42
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctggttacac taaatatgta tttgc 25
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gccgtggatg ttatcgtat 19
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gtagtgctag cgtattgtgc g 21
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggtatctacg ttggtaatgg tcaa 24

Claims (5)

1.一种可视快速检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于，采用多重环介导等温扩增结合胶体金免疫层析法同时检测食品中副溶血性弧菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种食源性致病菌，其包括引物、LAMP扩增反应体系和胶体金免疫层析三重检测试纸；
(1)引物：包括含FIP、BIP、F3、B3、LoopF和LoopB，其中BIP引物标记上FITC抗体，LoopB引物标记上荧光探针；
引物序列如下：
tlh-FIP：CTGTCACCGAGTGCAACCACTT-AACCACACGATCTGGAGCA；
tlh-BIP-FITC：GCATCACAATGGCGCTTCCC-ACCGTTGGAGAAAGTGACCTA，5’
端标记荧光素；
tlh-F3：CGCTGACAATCGCTTCTCAT；
tlh-B3：GTTCTTCGCTTTGGCAATGT；
tlh-LF：CTGCATTGCTGCGTCGT；
tlh-LB-Bio：TAACCCGAACAGCTGGTTCT，5’端标记生物素；
invA-FIP：GCATCCGCATCAATAATACCG-CTCTGGATGGTATGCCCGG；
invA-BIP-FITC：GAACGGCGAAGCGTACTGGAA-CATCGCACCGTCAAAGGAA，5’
端标记荧光素；
invA-F3：GTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGT；
invA-B3：CCGCCAATAAAGTTCACAAAGAT；
invA-LF：TCTGGATGGTATGCCCGGT；
invA-LB-TEX：CATCGCACCGTCAAAGGAA，5’端标记德克萨斯红；
iap-FIP：AGGTTTTGCTTGAGATTCAGAGAT-TAATCTCCCTTCCACGTACT；
iap-BIP-FITC：TTGACTATGGTAGCGGAATTTCTC-TTAACGCCATTGTCTTGC，5’
端标记荧光素；
iap-F3：CTGGTTACACTAAATATGTATTTGC；
iap-B3：GCCGTGGATGTTATCGTAT；
iap-LF：GTAGTGCTAGCGTATTGTGCG；
iap-LB-DIG：GGTATCTACGTTGGTAATGGTCAA，5’端标记地高辛精；
(2)LAMP扩增反应体系：每25μl反应液含2.5μl 10×的缓冲液，3.5μl dNTP混合液(每一种10mM)，3.9μl引物混合物，其中每组引物各加1.3μl，1μl Bst聚合酶，1μl DNA样品，无菌去离子补余；
(3)胶体金免疫层析三重检测试纸：试纸由缓冲液垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。
2.根据权利要求1所述的一种可视快速检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于，所述试纸的尺寸为5mm×77mm，硝酸纤维素膜的长度为25mm。
3.根据权利要求1所述的一种可视快速检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于，所述胶体金结合垫上标记链霉亲和素，硝酸纤维素膜上分别点上链霉亲和素、小鼠抗DIG单克隆抗体和德克萨斯红抗体作为检测线T1、T2和T3，点上羊抗鼠抗体作为质控线C。
4.一种可视快速检测食源性致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)LAMP扩增反应体系为：每25μl反应液含2.5μl 10×的缓冲液，3.5μl dNTP混合液(每一种10mM)，3.9μl引物混合物，其中每组引物各加1.3μl，1μl Bst聚合酶，1μl DNA样品，其余用无菌去离子水补齐；所述的缓冲液为成分为200mM MOPs，100mM KCl，pH 8.8的100mM(NH4)2SO4，1μl的200mM MgCl2；
(2)扩增反应条件：扩增温度63.5℃，于恒温水浴锅中反应45min；80℃加热2min终止反应；
(3)扩增反应结束：4μL的多重LAMP产物和16μL的含1×PBS和1％v/v吐温-20的缓冲液混合后滴于靠近结合垫的硝酸纤维素膜的检测区；垂直竖起试纸并将缓冲液垫浸入250μL含1×PBS和1％v/v吐温-20的缓冲液中，10-15min后肉眼可视检测结果；
(4)结果判定：C线和T1线、T2线、T3线都显色则检测的三种致病菌结果都为阳性；C线和T1线、T2线显色而T3线不显色的检测结果：标记FITC-Bio的致病菌和标记FITC-TEX的致病菌为阳性，标记FITC-DIG的致病菌则为阴性，如此类推；C线和T1线显色而T2线和T3线不显色的检测结果：标记FITC-Bio的致病菌为阳性，其它两个为阴性，如此类推；若C线不显色则结果不能判断。
5.一种可视快速检测食源性致病菌副溶血性弧菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的LAMP特异引物组，其特征在于，其由以下引物组成：
tlh-FIP：CTGTCACCGAGTGCAACCACTT-AACCACACGATCTGGAGCA；
tlh-BIP-FITC：GCATCACAATGGCGCTTCCC-ACCGTTGGAGAAAGTGACCTA，5’
端标记荧光素；
tlh-F3：CGCTGACAATCGCTTCTCAT；
tlh-B3：GTTCTTCGCTTTGGCAATGT；
tlh-LF：CTGCATTGCTGCGTCGT；
tlh-LB-Bio：TAACCCGAACAGCTGGTTCT，5’端标记生物素；
invA-FIP：GCATCCGCATCAATAATACCG-CTCTGGATGGTATGCCCGG；
invA-BIP-FITC：GAACGGCGAAGCGTACTGGAA-CATCGCACCGTCAAAGGAA，5’
端标记荧光素；
invA-F3：GTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGT；
invA-B3：CCGCCAATAAAGTTCACAAAGAT；
invA-LF：TCTGGATGGTATGCCCGGT；
invA-LB-TEX：CATCGCACCGTCAAAGGAA，5’端标记德克萨斯红；
iap-FIP：AGGTTTTGCTTGAGATTCAGAGAT-TAATCTCCCTTCCACGTACT；
iap-BIP-FITC：TTGACTATGGTAGCGGAATTTCTC-TTAACGCCATTGTCTTGC，5’
端标记荧光素；
iap-F3：CTGGTTACACTAAATATGTATTTGC；
iap-B3：GCCGTGGATGTTATCGTAT；
iap-LF：GTAGTGCTAGCGTATTGTGCG；
iap-LB-DIG：GGTATCTACGTTGGTAATGGTCAA，5’端标记地高辛精。
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