CN106755358B

CN106755358B - 多交叉扩增结合金纳米生物传感检测副溶血性弧菌的方法

Info

Publication number: CN106755358B
Application number: CN201611105333.6A
Authority: CN
Inventors: 叶长芸; 王毅; 王艳
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2016-12-05
Filing date: 2016-12-05
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2036-12-05
Also published as: CN106755358A

Abstract

本发明公开了一种多交叉扩增结合金纳米生物传感检测副溶血性弧菌的方法，所述方法在多交叉置换扩增中的交叉引物CP1或CP2的5’端标记生物素，在扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原，所述方法针对副溶血性弧菌toxR基因的扩增产物能被金纳米生物传感器可视化检测。所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。

Description

多交叉扩增结合金纳米生物传感检测副溶血性弧菌的方法

技术领域

本发明公开了一种副溶血性弧菌的检测方法，属于微生物学领域。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种呈丝状，弧状或杆状的革兰氏阴性菌，无芽孢形成。该病原体是重要的食源性疾病病原体，是广泛存在于河口、沿海及海洋环境中的嗜盐菌。副溶血性弧菌常分离自海产品及临床标本，引起海产品源性的肠热症，临床症状表现为发热、腹泻。据WHO数据统计，副溶血性弧菌被认为是引起海产品源性疾病最主要的因素。副溶血性弧菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，海水中可存活47天。全球每年有7万病人死于海产品源性腹泻，而绝大多数海产品源性的腹泻病例是副溶血性弧菌导致，从而受到世界各国的高度关注，成为各国的重大公共卫生问题。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗，开展海产品监测以及副溶血性弧菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的检测方法，能够同时检测和鉴定副溶血性弧菌成为必要。

目前对于副溶血性弧菌的检测主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定。该方法耗时大约5到7天，包括增菌、选择培养及后续的生化鉴定，其劣势是耗时耗力，生化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复性差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于副溶血性弧菌的快速检测，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。目前运用这些检测技术诊断副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的PCR方法和Real-time PCR方法，检测灵敏度差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。

为了克服PCR扩增技术的劣势，近年来发展了许多恒温扩增技术。恒温扩增技术较PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)等。然而，这些恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试剂，复杂的操作步骤。因此这些方法的实用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速诊断领域及欠发达地区。为了克服PCR技术及现有恒温扩增技术的劣势，实现便捷、快速、敏感及特异的扩增核酸序列，在生物、农业、医学等领域，发明人近期已经建立了一种新的核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(Multiple Cross DisplacementAmplification，MCDA)，相关内容公开于CN104946744A，该专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。

MCDA在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。为了使该技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济。近期，发明人以MCDA为基础，将MCDA技术与纳米生物检测技术相结合，开发了依赖MCDA技术，实现快速、敏感检测的纳米生物传感技术，该技术被命名为多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感的核酸诊断技术(Multiple Cross Displacement Amplification label-based goldNanoparticles Lateral Flow Biosensor,MCDA-LFB)，相关内容已申请于CN201610872509.4、CN201610942289.8、CN201610982015.1。

本发明将MCDA-LFB技术用于副溶血性弧菌的检测，针对副溶血性弧菌的特异基因toxR设计一套MCDA扩增引物，旨在验证、评价MCDA-LFB技术及建立针对副溶血性弧菌的快速、敏感和特异的MCDA-LFB检测体系。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种应用多交叉扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的基因组；

(2)提供置换引物F1和F2，提供交叉引物CP1和CP2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或CP2*；提供扩增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，同时提供在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*；

(4)在链移位型聚合酶(Bst)、解链温度调节剂、引物存在下，使用待检测样品的基因组片段作为模板恒温扩增DNA；

(5)使用金纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。

在一个优选的技术方案中，在所述扩增引物C1*或C2*的5’端所标记的半抗原为荧光素(FITC)。

更为优选地，在交叉引物CP1*的5’端标记生物素，在所述扩增引物C1*的5’端标记荧光素。

在一个更为优选的技术方案中，所述金纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在金标垫、检测线及控制线区域依次包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗荧光素抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。

在一个优选的技术方案中，所述恒温扩增是在61-64℃的环境中进行的。

在一个更为优选的技术方案中，所述恒温扩增是在62℃的环境中进行的。

在一个优选的技术方案中，所述目的基因为副溶血性弧菌的toxR。

优选地，所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO:2所示；所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:3所示，在所述交叉引物CP1的5’端标记有生物素的所述交叉引物CP1*的序列如SEQ ID NO:4所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:5所示，引物C1的序列如SEQ ID NO:6所示，在所述引物C1的5’端标记有荧光素的引物C1*的序列如SEQ ID NO:7所示，引物C2的序列如SEQ ID NO:8所示，引物D1的序列如SEQ ID NO:9所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:10所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:11所示，引物R2的序列如SEQ ID NO:12所示。

本发明在另一方面还提供了一组用于多交叉扩增副溶血性弧菌toxR基因的引物序列，所述序列包括：如SEQ ID NO:1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO:2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO:5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO:6所示的扩增引物C1，如SEQ ID NO:8所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO:9所示的扩增引物D1，如SEQ ID NO:10所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO:11所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO:12所示的扩增引物R2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或CP2*，以及在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*。

在一个优选的技术方案中，在交叉引物CP1*的5’端标记生物素，在扩增引物C1*的5’端标记有荧光素。

本发明提供的多交叉扩增结合金纳米生物传感检测的目的基因为副溶血性弧菌的toxR，该方法具有优异的检测灵敏度，其检测范围为10ng～10fg，而且也具有较快的检测速度，仅需30分钟，即可获得能供可视化LFB检测的扩增产物。

以常见的致病菌及条件致病菌DNA(副溶血性弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特菌、沙门菌、志贺菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、蜡样芽胞杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌等)为模板评价V.parahaemolyticus-MCDA-LFB技术的特异性。结果表明，V.parahaemolyticus-MCDA-LFB技术能准确的鉴别副溶血性弧菌，说明MCDA-LFB方法的特异性良好，也证明本发明提供的用于MCDA的引物序列具有优异的特异性和扩增效果。

附图说明

图1A.MCDA-LFB扩增原理示意图；

图1B.金纳米生物传感器结构示意图；

图1C.LFB结果判读示意图；

图2.MCDA-LFB引物设计的位置和方向示意图；

图3A.MCDA扩增可视颜色变化法检测结果图谱；

图3B.MCDA扩增电泳法检测结果图谱；

图3C.MCDA扩增LFB检测结果图谱；

图4.标准MCDA-LFB最佳反应温度测试结果图谱；

图5A.MCDA扩增LFB检测灵敏度评价图谱；

图5B.MCDA扩增电泳法检测灵敏度评价图谱；

图5C.MCDA扩增可视颜色变化法检测灵敏度评价图谱；

图5D.MCDA扩增实时浊度法检测灵敏度评价图谱；

图6A.MCDA扩增10分钟LFB检测结果图谱；

图6B.MCDA扩增20分钟LFB检测结果图谱；

图6C.MCDA扩增30分钟LFB检测结果图谱；

图6D.MCDA扩增40分钟LFB检测结果图谱；

图7.MCDA-LFB技术的特异性检测评价图谱

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

1.MCDA-LFB扩增原理

(1)通过MCDA扩增构建可检测产物

MCDA反应体系包括10条引物，识别靶序列的10个区域，包括2条交叉内引物，即CP1和CP2(Cross Primer，CP)，2条置换引物，即F1和F2，6条扩增引物，即D1，C1，R1，D2，C2和R2。为了构建可检测产物，交叉引物CP1或CP2在5’端标记生物素(Biotin),扩增引物C1或C2在5’端标记荧光素(FITC)，新标记的引物被命名为CP1*，CP2*，C1*和C2*。CP1*包含Cl(C1s区域的互补序列)和P1，即5′-Cl-P1；CP2包含C2(C2s区域的互补序列)和P2，即5′-C2-P2。两条交叉引物CP1和CP2是介导MCDA扩增的主要引物；置换引物F1和F2在MCDA反应中发挥置换作用，置换交叉引物CP1和CP2；六条扩增引物D1，C1，R1，D2，C2和R2能够加速MCDA反应及增加MCDA产物量，扩增原理参见图1A。

为了便于理解，CP2*和C2*引物在扩增示意图中被略去。在既定的恒温条件下，双链DNA在处于半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。首先在Bst DNA聚合酶的作用下，以CP1*引物P1区段的3′末端为起点，与对应的DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F1引物与P1s前端F1s序列互补，以3′末端为起点，通过链置换活性DNA聚合酶的作用，首先置换出CP1引物合成的DNA链，同时合成自身DNA。最终F1引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。然而由交叉引物CP1*先合成的DNA链被F1引物进行链置换产生一单链，该单链的D1s，C1s，R1s，P2s，F2s区域能够依次与扩增引物D1，C1*，R1，交叉引物CP2及置换引物F2结合，并发挥链置换扩增作用(步骤1，2)。C1*引物扩增并置换D1的扩增链，生成短片段C1s-D1产物，该产物能够与C1*和CP1*引物结合，启动链置换扩增，进入循环扩增1(步骤3和循环1)。R1引物扩增并置换C1*的扩增链，生成短片段C1s-C1*产物，该产物能够与C1*和CP1*引物结合，启动链置换扩增，进入循环扩增2(步骤4和循环2)。在循环扩增2中，随着MCDA扩增的进行，大量的双标产物被形成，CP1*端标记生物素，C1*端标记荧光素(图1A)。该双标的产物能被金纳米生物传感器检测，从而进行可视检测。后续的MCDA扩增，包括步骤5和6，详见发明人的前期专利CN104946744A。此外，由于CP2*和C2*的扩增过程与CP1*和C1*的扩增过程相似，在MCDA扩增体系中，同样能够形成大量的双标的可检测产物。CP2*端标记生物素，C2*端标记荧光素。该双标的产物也能被金纳米生物传感器(LFB)检测，从而进行可视检测。因此，在利用MCDA-LFB技术进行靶序列检测时，可利用CP1*和C1*引物构建可检测产物，也可利用CP2*和C2*引物构建可检测产物。

(2)生物传检测器(LFB)的设计及对扩增产物的检测

生物检测器(LFB)的设计见图1B。LFB包含五个部分，样品垫1、金标垫2、纤维膜3、吸水垫4及背板5，首先将样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫依次组装在背板上，然后将SA-G(30nm，金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)，anti-FITC(抗荧光素抗体)及Biotin-BSA(生物素偶联的牛血清蛋白)分别包被在金标垫、检测线(TL)6、及控制线(CL)7，待干燥后备用。

LFB的检测原理：将V.parahaemolyticus-MCDA产物直接滴加到LFB的样品垫区域，然后将120μl的检测缓冲液加到样品垫区域，MCDA产物在虹吸作用下，从下往上运动(从样品垫向吸水垫方向运动)。当MCDA产物达到金标垫后，双标产物的一端(即生物素标记端)与SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)反应。当产物继续运动，双标产物的另一端(即荧光素标记端)与检测线区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线区域。随着产物在检测线区域的积累，通过另一端的SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)进行显色反应，从而对MCDA产物进行可视化检测。此外，过剩的SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)可与CL(质控线)区域的B-BSA(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)结合，进行直接显色反应，判断LFB的功能是否正常。

LFB结果的判读(图1C)：仅仅CL区域出现红色条带，表示阴性对照，没有阳性产物(图1C II)；CL及检测线区域出现红色条带，表示针对靶标的检测为阳性结果(图1C I)；当LFB不出现红线条带时，表示LFB失效；仅当测试线出现红色条带时，CL无红色条带,代表结果不可行，需要重新检测。

2.本发明中实施例所涉及的试剂和仪器：

本发明中实施例所涉及的试剂：抗荧光素抗体(anti-FITC)，金纳米粒子偶联的链霉素亲和素(SA-G)及生物素偶联的牛血清蛋白(B-BSA)购于Resenbio公司。背板、样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫购于Jie-Yi公司。Loopamp Kit(Eiken Chemical Co.Ltd.,Tokyo,Japan)购于日本荣研公司。DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)购于德国Qiagen公司。DL100DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分析纯产品。

本发明实验中使用的主要仪器：恒温实时浊度仪LA-320C(Eiken Chemical Co.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；凝胶成像系统为Bio-Rad Gel Dox XR,美国Bio-Rad产品。

3.本发明中实施例所涉及的方法

基因组提取：副溶血性弧菌及其他细菌的基因组DNA的提取使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，副溶血性弧菌的DNA用GE缓冲液连续稀释(从10ng、10pg、10fg、1fg到0.1fg/微升)。各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。

连续稀释的副溶血性弧菌DNA用于MCDA扩增的最佳温度的探索及扩增体系的建立。以常见的致病菌及条件致病菌DNA为模板评价V.parahaemolyticus-MCDA-LFB技术的特异性。菌株信息见表2。

4.本发明实施例所涉及的引物设计

本发明建立针对副溶血性弧菌的快速、敏感和特异的MCDA-LFB检测体系，以验证、评价MCDA-LFB技术。在本发明中，针对副溶血性弧菌的特异基因toxR设计一套MCDA扩增引物，旨在验证MCDA-LFB技术的可行性、敏感性、特异性及可靠性。引物设计示意图见图2。引物序列及修饰见表1。

表1针对toxR基因设计的引物序列及修饰

^aCP1*，该引物用于MCDA-LFB检测体系，在5’端标记生物素；C1*，该引物用于MCDA-LFB检测体系，在5’端标记荧光素；^bmer，monomeric unit(单体单元)；nt，nucleotide(核苷酸)。

实施例1.MCDA-LFB扩增的可行性

标准的MCDA反应体系：交叉引物CP1*和CP1的浓度为30pmol,交叉引物CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度为10pmol,扩增引物R1、R2、D1和D2的浓度为30pmol，扩增引物C1*和C2的浓度为20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5μL的10×BstDNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μL。整个反应恒温在65℃1小时，85℃5min终止反应。

MCDA扩增之后，三种检测方法用于MCDA扩增判别，首先，在反应混合物中加入可视染料(如HNB试剂、萘羟基酚蓝可视试剂)，阳性反应管的颜色从紫色变为蓝色，阴性反应管则保持原来的紫色。其次，MCDA产物可以通过琼脂糖电泳后检测扩增子，由于产物中包含了不同大小的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状，阴性反应不出现任何条带。更为直接简单的方法为通过LFB对产物进行检测。

可视颜色变化法：MCDA在合成DNA的同时产生大量的阳离子，阳离子能够改变反应管中的PH，从而使HNB颜色发生改变。因此，可以通过反应管颜色变化判读结果，阳性反应管从紫色变为蓝色，阴性反应保持紫色不变，见图3A。A1表示阳性扩增(反应管中加入10pg的副溶血性弧菌模板，作为阳性对照)，A2表示阴性扩增(反应管中加入10pg的Gram⁺粪肠球菌模板，作为阴性对照)，A3表示阴性扩增(反应管中加入10pg的Gram^-志贺菌模板，作为阴性对照)，A4表示空白对照反应(1微升的双蒸水代替10pg的模板，作为空白对照)。只有阳性对照出现阳性扩增，说明针对toxR设计的检测副溶血性弧菌的MCDA引物可用。

电泳检测法：将图3A的产物进行电泳检测，由于MCDA的扩增产物包含了许多大小不一的短片段及一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱，见图3B。通过电泳检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照未出现任何扩增条带，进一步验证了本研究所设计的MCDA引物可行，能够用于靶序列扩增检测。

LFB检测：将图3A的产物进行LFB检测。由于针对副溶血性弧菌检测的MCDA引物标记的半抗原为FITC(荧光素)，因此，当TL和CL出现红色条带时表示为副溶血性弧菌检测阳性。通过LFB检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照仅出现CL红色条带，验证了本研究所设计的LFB，MCDA-LFB技术及MCDA引物可行，能够用于目的靶序列的检测(见图3C)。

实施例2.测定MCDA技术的最佳反应温度

在标准反应体系条件下，加入针对副溶血性弧菌DNA模板及所设计的对应的MCDA引物，其模板浓度为10pg/μl。反应在恒温条件下进行(60-67℃)，结果运用实时浊度仪进行检测，在不同的温度下得到不同的动态曲线图，见图4。61-64℃(图4B-E)被推荐作为MCDA引物的最佳反应温度。本发明中的后续验证选择62℃作为恒温条件进行MCDA扩增。图4表示针对toxR基因序列设计的检测副溶血性弧菌的MCDA引物温度动态曲线图。

实施例3.MCDA-LFB检测单一靶标的灵敏度

运用连续稀释好的副溶血性弧菌基因组DNA进行标准的MCDA扩增反应后，运用LFB检测显示：MCDA-LFB的检测范围为10ng～10fg，LFB在TL和CL区域出现红色线(图5A)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(图5A4-A5)。图5A运用LFB可视化读取MCDA扩增结果；图5A1到A5表示副溶血性弧菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，A6、A7、A8分别表示粪肠球菌(10pg)、志贺菌模板(10pg)、空白对照(1微升双蒸水)。

为了进一步验证MCDA-LFB检测副溶血性弧菌的敏感性，另外3种检测方法用于MCDA扩增结果判别，进一步确认MCDA-LFB的检测灵敏度。首先，MCDA产物可以通过琼脂糖电泳后检测扩增子，由于产物中包含了不同大小的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状，阴性反应不出现任何条带。检测显示：V.parahaemolyticus-MCDA的检测范围为10ng～10fg，阳性反应出现阶梯条带(图5B1-B3)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，不出现特异的阶梯条带，表示阴性结果(图5B4-B5)。图5B运用电泳法读取MCDA扩增结果；图5C1到C5表示副溶血性弧菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，C6、C7、C8分别表示粪肠球菌(10pg)、志贺菌模板(10pg)，空白对照(1微升双蒸水)。其次，在反应混合物中预先加入可视染料(如HNB试剂，萘羟基酚蓝)，阳性反应管的颜色从紫色变为蓝色，阴性反应管则保持原来的紫色。检测显示：V.parahaemolyticus-MCDA的检测范围为10ng～10fg，阳性扩增管变为蓝色(图5C1-5C3)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，反应不出现蓝色，仍然为紫色，表示阴性结果(图5C4-C5)。图5C运用可视法读取MCDA扩增结果；图5C1到C5表示副溶血性弧菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，4C6、4C7、4C8分别表示粪肠球菌(10pg)、志贺菌模板(10pg)、空白对照(1微升双蒸水)。其三，实时浊度仪用于分析MCDA扩增(图5D)。运用连续稀释好的副溶血性弧菌基因组DNA进行标准的MCDA扩增反应后，运用实时浊度仪进行结果判定，检测显示：V.parahaemolyticus-MCDA的检测范围为10ng～10fg，阳性扩增浊度曲线被观察到(图5D)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，不出现阳性扩增浊度曲线，表示阴性结果(图5D4-D5)。图5D运用实时浊度仪可视化读取MCDA扩增结果；图5D1到D5表示副溶血性弧菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，D6、D7、D8分别表示粪肠球菌(10pg)、志贺菌模板(10pg)、空白对照(1微升双蒸水)。

实施例4.测定MCDA-LFB技术的最佳反应时间

在标准反应体系条件下，加入副溶血性弧菌DNA模板(连续稀释)及针对toxR基因所设计的对应的MCDA引物。运用连续稀释好的副溶血性弧菌基因组DNA作为模板。反应在恒温条件下进行(62℃)，恒温时间分别10分钟、20分钟、30分钟和40分钟。运用LFB检测显示：MCDA-LFB技术在检测副溶血性弧菌时，最佳反应时间为30分钟(图6)。当MCDA体系在扩增步骤恒温30分钟时，检测限水平的模板能够被检出(图6C)。图6C中，LFB的检测范围为10ng～10fg，LFB在TL和CL区域出现红色线(LFB1-LFB3)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(LFB4-LFB5)。图6运用LFB可视化读取MCDA体系从10分钟到40分钟的扩增结果；LFB1到LFB5表示副溶血性弧菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，LFB6、LFB7、LFB8分别表示粪肠球菌模板(10pg)、志贺菌模板(10pg)、空白对照(1微升双蒸水)。

实施例5.测定MCDA-LFB技术的特异性

以常见的致病菌及条件致病菌DNA(副溶血性弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特菌、沙门菌、志贺菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、蜡样芽胞杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌等)为模板评价V.parahaemolyticus-MCDA-LFB技术的特异性(菌株信息详见表2)。V.parahaemolyticus-MCDA-LFB技术能准确的鉴别副溶血性弧菌，说明MCDA-LFB方法的特异性良好，见图7。图7中，LFB1-20：副溶血性弧菌模板；LFB21-59，非副溶血性弧菌模板；LFB60,空白对照。结果表明，MCDA-LFB能够正确检测靶序列。

表2.菌株信息

^aU，unidentified serotype(未鉴别的血清型)；ATCC，American Type CultureCollection(美国模式培养物保藏所)；ICDC，National Institute for CommunicableDisease Control Disease Control and Prevention，Chinese Center for DiseaseControl and Prevention(中国疾病预防控制中心传染病预防控制所)。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 多交叉扩增结合金纳米生物传感检测副溶血性弧菌的方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 1

gaatctcagt tccgtcagat 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 2

tcatacgagt ggttgctg 18

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 3

ccagttgttg atttgcgggt gtggtgagta tcagaacgta c 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 4

ccagttgttg atttgcgggt gtggtgagta tcagaacgta c 41

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 5

accatgcaga agactcgtta cccatgaatg tagttcaaaa tcagct 46

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 6

ccagttgttg atttgcgggt g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 7

ccagttgttg atttgcgggt g 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 8

accatgcaga agactcgtta cc 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 9

atttacaggt gtcatcactg 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 10

gtggaagtga ttgccact 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 11

actgctcaat agaaggcaa 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 12

gcattgaacg ctacgttaag 20

Claims

1.一种非诊断目的的多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的基因组；

(2)提供置换引物F1和F2，提供交叉引物CP1和CP2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或CP2*；提供扩增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，同时提供在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*；所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO:2所示；所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:3所示，在所述交叉引物CP1的5’端标记有生物素的所述交叉引物CP1*的序列如SEQ ID NO:4所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:5所示，引物C1的序列如SEQ IDNO:6所示，在所述引物C1的5’端标记有荧光素的引物C1*的序列如SEQ ID NO:7所示，引物C2的序列如SEQ ID NO:8所示，引物D1的序列如SEQ ID NO:9所示，引物D2的序列如SEQ IDNO:10所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:11所示，引物R2的序列如SEQ ID NO:12所示，在所述扩增引物C1*或C2*的5’端所标记的半抗原为荧光素，在交叉引物CP1*的5’端标记生物素，在所述扩增引物C1*的5’端标记荧光素；

(4)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用待检测样品的基因组的核酸作为模板恒温扩增DNA；

(5)使用金纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在金标垫、检测线及控制线区域依次包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗荧光素抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在61-64℃的环境中进行的。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在62℃的环境中进行的。

5.一组用于恒温扩增副溶血性弧菌的toxR基因的引物序列，其特征在于，所述序列包括：如SEQ ID NO:1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO:2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO:5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO:6所示的扩增引物C1，如SEQ ID NO:8所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO:9所示的扩增引物D1，如SEQ ID NO:10所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO:11所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO:12所示的扩增引物R2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或CP2*，以及在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*。

6.根据权利要求5所述的引物序列，其特征在于，在交叉引物CP1*的5’端标记生物素，在扩增引物C1*的5’端标记有荧光素。