CN102864228A - 快速检测副溶血弧菌的lamp试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测副溶血弧菌的LAMP试剂盒，由LAMP反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；LAMP反应液含有Bst DNA聚合酶大片段、引物、LAMP10×buffer、dNTPs溶液、MgSO₄溶液和甜菜碱。引物分为正向引物和反向引物。本发明具有特异性好，灵敏度高，快速简便，可重复性高以及肉眼可判断结果等优点，可对工业食品中副溶血弧菌进行快速定性检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和血清学诊断方法。

Description

快速检测副溶血弧菌的LAMP试剂盒

技术领域

本发明涉及一种快速检测副溶血弧菌的LAMP试剂盒，属于食品检测领域。

背景技术

副溶血性弧菌(又称嗜盐菌Vibrio Parahaemolyticus)是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌。本菌嗜盐畏酸，在无盐培养基上，不能生长，3%～6%食盐水繁殖迅速，每8～9分钟为1周期，低于0.5%或高于8%盐水中停止生长。在食醋中1～3分钟即死亡，加热56℃5～10分钟灭活，在1%盐酸中5分钟死亡。副溶血性弧菌食物中毒也称嗜盐菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。主要病理变化为空肠及回肠有轻度糜烂，胃粘膜炎、内脏(肝、脾、肺)淤血等。

近年来发展起来的环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因定性检测方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定性检测的重要方法之一。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种新型等温核酸扩增方法,该法针对靶基因的6个区域设计4条特异引物,利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶),在恒温条件(65℃左右)保温约60min,即可完成核酸扩增反应,产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀。该技术具有不需要PCR仪、扩增产物不需要开盖，用肉眼即可判断结果及反应时间短，特异性强，灵敏度高等优点。

传统检测副溶血弧菌的培养方法,需要分离、筛选和生化鉴定,必要时还需要血清学鉴定,一般为4～6d,费时费力，具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点。各种常规PCR方法具有敏感性强、特异性高、简便、快速等优点,有较多应用于副溶血弧菌检测的报道，但由于存在PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题以及需要特殊的仪器设备而限制了其在基层单位的应用。因此焏待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术存在的不足，提供一种快速检测副溶血弧菌的LAMP试剂盒及其使用方法。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种快速检测副溶血弧菌的LAMP试剂盒，该试剂盒由LAMP反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；LAMP反应液含有引物，引物为以下4组特异性引物中的任意一组:

（1）上游外引物F3：5′-ACGCCTCTGCTAATGAGGT-3′；（SEQ ID No.1）

下游外引物B3：5′-GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3′；（SEQ ID No.2）

上游内引物FIP：5′-GCGCTTCTGGTTCAACGATTGCAGAAACGATCGTAGAGCCGT-3′；

（SEQ ID No.3）

下游内引物BIP：5′-TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3′；

（SEQ ID No.4）

（2）上游外引物F3：5′-CGCCTCTGCTAATGAGGTAG-3′；（SEQ ID No.5）

下游外引物B3：5′-GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3′；（SEQ ID No.6）

上游内引物FIP：5′-TGGCGCTTCTGGTTCAACGATTAAACGATCGTAGAGCCGTCT-3′；

（SEQ ID No.7）

下游内引物BIP：5′-TGTGGCTTCTGCTGTGAATCCTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3′；

（SEQ ID No.8）

（3）上游外引物F3：5′-AGAAACGATCGTAGAGCCGT-3′；（SEQ ID No.9）

下游外引物B3：5′-GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3′；（SEQ ID No.10）

上游内引物FIP：5′-AGCCACAGGTGCTTTTTCAGGTCGACGACTTCTGACGCAAT-3′；

（SEQ ID No.11）

下游内引物BIP：5′-TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3′；

（SEQ ID No.12）

（4）上游外引物F3：5′-CGTAGAGCCGTCTTTAGCG-3′；（SEQ ID No.13）

下游外引物B3：5′-CGGAACTGAGATTCCGCTG-3′；（SEQ ID No.14）

上游内引物FIP：5′-AGCCACAGGTGCTTTTTCAGGTACGACTTCTGACGCAATCG-3′；

（SEQ ID No.15）

下游内引物BIP：5′-TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3′。

（SEQ ID No.16）

具体地说，

a）LAMP反应液

LAMP反应液由Bst DNA聚合酶大片段、LAMP10×buffer、10μmol/L的外引物、10μmol/L的内引物、5mol/L甜菜碱、50mmol/L MgSO₄和10mmol/L dNTPs组成。在本发明的一个具体方案中，LAMP反应液由LAMP 10×buffer 2.5μl，10μmol/L内引物FIP、BIP各2.0μl，10μmol/L外引物F3、B3各1.0μl，10mmol/L dNTPs3.0μl,50mmol/L MgSO₄ 3.0μl,5.0mol/L甜菜碱4.5μl，Bst DNA聚合酶大片段1.0μl组成，反应液总体积20μl。

b）标准阳性模板

标准阳性模板是含有副溶血弧菌高度保守基因toxR基因328个碱基对的核苷酸片段构成的pMD18-T-toxR载体，该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖。

toxR基因的核苷酸序列为：

5′-AACGCCTAAGCCCGCTTTCTTCAGACTCAAGCTCAATTGAAGTTGAAGAACCTGCTTCTGATAACAATGACGCCTCTGCTAATGAGGTAGAAACGATCGTAGAGCCGTCTTTAGCGACGACTTCTGACGCAATCGTTGAACCAGAAGCGCCAGTAGTACCTGAAAAAGCACCTGTGGCTTCTGCTGTGAATCCTTGGATTCCACGCGTTATTTTATTTTTGGCACTATTACTACCGATTTGCGTACTGCTGTTTACAAACCCAGCGGAATCTCAGTTCCGTCAGATTGGTGAGTATCAGAACGTACCAGTGATGACACCTGTAAATCA-3′。（SEQ IDNo.17）

实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒pMD18-T-toxR，该质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，-20℃保存。

c)阴性质控标准品

阴性质控标准品为无菌双蒸水。

本试剂盒的工作原理：

使用本发明提供的快速可视化检测副溶血弧菌LAMP试剂盒，在恒温条件下(65℃左右)保温约60min,即可完成核酸扩增反应，并伴随产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀。反应结束后，12000r/min离心30s，即可用肉眼观察管底白色沉淀。在本发明提供的快速检测副溶血弧菌LAMP试剂盒中，针对副溶血弧菌检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物、dNTPs、Mg²⁺浓度、甜菜碱等的优化，通过优化方案，反复实验，建立了检测副溶血弧菌的环介导等温扩增方法，并研制出检测副溶血弧菌的LAMP试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速检测副溶血弧菌的要求。

使用上述LAMP试剂盒检测副溶血弧菌的方法，包括以下步骤：

①用缓冲蛋白胨水（BPW）按照国标法培养待检样品1-4h；

②用水煮法从待测样品中提取DNA；

③将DNA加入到LAMP反应体系中，65℃保温1h；

④反应结束后，离心，肉眼观察沉淀，对样品进行定性分析。

本发明提供的快速检测副溶血弧菌LAMP试剂盒，可对副溶血弧菌进行定性检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和血清法检测方法。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、与传统培养法相比，检测速度快，仅1h，加上样品DNA的提取制备，总共不超过5h。

2、特异性好，灵敏度高；

3、步骤简单，可重复性高；

4、可同时进行多个样品检测。

附图说明

图1为实施例1中副溶血弧菌离心后观察白色沉淀结果，图中：

1—标准阳性模板，2—阴性对照，3—副溶血弧菌阳性样本，4—副溶血弧菌阳性样本，5—副溶血弧菌阳性样本，6-副溶血弧菌阴性样本，7—副溶血弧菌阴性样本，8—副溶血弧菌阴性样本；

图2为实施例1中副溶血弧菌1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果图，图中：

M—DNA Marker，1—标准阳性模板，2—阴性对照，3—副溶血弧菌阳性样本，4—副溶血弧菌阳性样本，5-副溶血弧菌阳性样本，6—副溶血弧菌阴性样本，7—副溶血弧菌阴性样本，8-副溶血弧菌阴性样本；

图3为实施例2中副溶血弧菌离心后观察白色沉淀结果，图中：

1—标准阳性模板，2—阴性对照，3-副溶血弧菌阴性样本，4—副溶血弧菌阴性样本，5—副溶血弧菌阴性样本，6-副溶血弧菌阳性样本，7-副溶血弧菌阳性样本，8—副溶血弧菌阳性样本；

图4为实施例3中副溶血弧菌离心后观察白色沉淀结果，图中：

1—标准阳性模板，2—阴性对照，3—副溶血弧菌阴性样本，4—副溶血弧菌阴性样本，5—副溶血弧菌阴性样本，6—副溶血弧菌阳性样本，7—副溶血弧菌阳性样本，8—副溶血弧菌阳性样本；

图5为实施例4中副溶血弧菌离心后观察白色沉淀结果，图中：

1—标准阳性模板，2—阴性对照，3—副溶血弧菌阴性样本，4—副溶血弧菌阴性样本，5—副溶血弧菌阴性样本，6—副溶血弧菌阳性样本，7—副溶血弧菌阳性样本，8—副溶血弧菌阳性样本；

图6为实施例5中副溶血弧菌LAMP试剂盒特异性实验观察白色沉淀结果，图中：

1—标准阳性模板，2—阴性对照，3—副溶血弧菌样本，4—单增李斯特菌样本，5—痢疾志贺氏菌样本，6—甲型副伤寒沙门氏菌样本，7—金黄色葡萄球菌样本，8—大肠杆菌样本；

图7为实施例6中副溶血弧菌LAMP试剂盒灵敏度实验观察白色沉淀结果，图中：

1—稀释10^-1倍，2—稀释10^-2倍，3—稀释10^-3倍，4—稀释10^-4倍，5—稀释10^-5倍，6—稀释10^-6倍，7—稀释10^-7倍，8—稀释10^-8倍，9—稀释10^-9倍，10—稀释10^-10倍。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南（第二版）；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

1、新型可视化快速检测副溶血弧菌LAMP试剂盒组成与配制

a）LAMP反应混合液

LAMP反应混合液由LAMP 10×buffer 2.5μl，10μmol/L内引物FIP、BIP各2.0μl，10μmol/L外引物F3、B3各1.0μl，10mmol/L dNTPs 3.0μl,50mmol/LMgSO₄3.0μl,5.0mol/L甜菜碱4.5μl，Bst DNA聚合酶大片段1.0μl组成，反应液总体积20μl。

其中引物序列如下：

上游外引物F3：5′-ACGCCTCTGCTAATGAGGT-3′；

下游外引物B3：5′-GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3′；

上游内引物FIP：5′-GCGCTTCTGGTTCAACGATTGCAGAAACGATCGTAGAGCCGT-3′；

下游内引物BIP：5′-TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3′；

b）标准阳性模板

标准阳性模板pMD18-T-toxR是含有副溶血弧菌高度保守基因toxR基因328个碱基对的核苷酸片段构成的pMD18-T-toxR载体，该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖；实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒pMD18-T-toxR，该质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，-20℃保存。

c)阴性质控标准品

阴性质控标准品为无菌双蒸水。

2.使用所述基于环介导等温扩增技术快速检测工业食品中副溶血弧菌的PCR试剂盒检测副溶血弧菌的方法，包括以下步骤：

a、食物样品预处理：取3份经传统培养法鉴定的副溶血弧菌阳性食品，3份副溶血弧菌阴性食品，分别称取25g样品放入盛有225mL BPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀即可。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养1-4h。如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min解冻。

b、细菌模板DNA的制备：分别取100μL细菌培养物，12000r/min离心2min，去上清，加入50μL无菌水，充分混匀，100℃水浴10min,12000r/min离心2min，上清即为模板DNA。

c、LAMP反应：分别取5μl b）步中样本上清加入到20μl LAMP反应液中，65℃恒温扩增60min。同时用标准阳性模板和阴性质控标准品分别做阳性对照和阴性对照。

d、结果判定：待反应结束后12000r/min离心30S，观察有无沉淀产生(见附图1)。取5μl LAMP产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样本都有条带，阴性样本则无条带（见附图2）。附图1为离心后观察白色沉淀结果，附图2为1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

e、结论：反复重复试验3次，所得检测结果相同，实验组均有沉淀或电泳条带，对照组均无沉淀或电泳条带，与预期结果一致。说明本试剂盒检测副溶血弧菌效果良好，沉淀观察法与电泳检测法效果一致，并且不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。

实施例2：

1.新型快速可视化检测副溶血弧菌LAMP试剂盒组成与配制，与实施例1所述试剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同，本试剂盒的引物序列如下：

上游外引物F3：5′-CGCCTCTGCTAATGAGGTAG-3′；

下游外引物B3：5′-GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3′；

上游内引物FIP：5′-TGGCGCTTCTGGTTCAACGATTAAACGATCGTAGAGCCGTCT-3′；

下游内引物BIP：5′-TGTGGCTTCTGCTGTGAATCCTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3′；

2.使用所述基于环介导等温扩增技术快速检测工业食品中副溶血弧菌的PCR试剂盒检测副溶血弧菌的方法与实施例1所述方法完全相同，反复重复试验3次，所得检测结果相同，实验组均有沉淀，对照组均无沉淀（见附图3），与预期结果一致。说明本试剂盒检测副溶血弧菌效果良好，并且不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。

实施例3：

1.新型快速可视化检测副溶血弧菌LAMP试剂盒组成与配制，与实施例1所述试剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同，本试剂盒的引物序列如下：

上游外引物F3：5′-AGAAACGATCGTAGAGCCGT-3′；

下游外引物B3：5′-GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3′；

上游内引物FIP：5′-AGCCACAGGTGCTTTTTCAGGTCGACGACTTCTGACGCAAT-3′；

下游内引物BIP：5′-TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3′；

2.使用所述基于环介导等温扩增技术快速检测工业食品中副溶血弧菌的PCR试剂盒检测副溶血弧菌的方法与实施例1所述方法完全相同，反复重复试验3次，所得检测结果相同，实验组均有沉淀，对照组均无沉淀（见附图4），与预期结果一致。说明本试剂盒检测副溶血弧菌效果良好，并且不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。

实施例4：

1.新型快速可视化检测副溶血弧菌LAMP试剂盒组成与配制，与实施例1所述试剂盒的不同之处在于特异性引物序列不同，本试剂盒的引物序列如下：

上游外引物F3：5′-CGTAGAGCCGTCTTTAGCG-3′；

下游外引物B3：5′-CGGAACTGAGATTCCGCTG-3′；

上游内引物FIP：5′-AGCCACAGGTGCTTTTTCAGGTACGACTTCTGACGCAATCG-3′；

下游内引物BIP：5′-TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3′；

2.使用所述基于环介导等温扩增技术快速检测工业食品中副溶血弧菌的PCR试剂盒检测副溶血弧菌的方法与实施例1所述方法完全相同，反复重复试验3次，所得检测结果相同，实验组均有沉淀，对照组均无沉淀（见附图5），与预期结果一致。说明本试剂盒检测副溶血弧菌效果良好，并且不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。

实施例5：基于环介导等温扩增技术快速检测工业食品中副溶血弧菌的PCR试剂盒的特异性实验

a、DNA模板的制备：分别取经过DNA有效性验证的副溶血弧菌、单增李斯特菌、痢疾志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的菌液10μl，12000r/min离心2min，去上清，加入50μL无菌水，充分混匀，100℃水浴10min,12000r/min离心2min，上清即为模板DNA。

b、LAMP反应：分别取5μl a）步中样本上清加入到20μl LAMP反应液中，65℃恒温扩增60min。同时用标准阳性模板和阴性质控标准品分别做阳性对照和阴性对照。

c、结果判定：待反应结束后12000r/min离心30S，观察有无沉淀产生（见附图6）。附图6为副溶血弧菌LAMP试剂盒特异性实验观察白色沉淀结果。

d、结论：结果显示只有阳性对照组和副溶血弧菌有白色沉淀，而单增李斯特菌、痢疾志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和阴性对照没有白色沉淀。

上述实验说明本试剂盒具有良好的特异性。

实施例6：快速检测副溶血弧菌LAMP试剂盒灵敏度实验

a、取1ml过夜培养的副溶血弧菌培养液做10倍倍比稀释，稀释至10^-9。取每个稀释度的菌液10μl，12000r/min离心2min，去上清，加入50μL无菌水，充分混匀，100℃水浴10min,12000r/min离心2min，上清即为模板DNA。

b、LAMP反应：取5μl a）步中样本上清加入到20μl LAMP反应液中，65℃恒温扩增60min。

c、结果判定：反应结束后，12000r/min离心30s观察管底是否产生白色沉淀，结果显示10^-1-10^-8样本管底均有白色沉淀，10^-9-10^-10样本管底则没有白色沉淀（见附图7）。附图7为副溶血弧菌LAMP试剂盒灵敏度实验观察白色沉淀结果。

d、结论：结果显示当菌液稀释至10^-8时仍能检测出，最低检测极限为50CFU/ml。

上述实验说明本试剂盒具有良好的灵敏度。

从上述实例可以说明，LAMP检测方法特异性好，灵敏度高，重复性好，操作简便，而且LAMP检测试剂盒对样品的检测仅需不到5个小时就能完成，而传统的培养法约需1周左右才能完成，因此，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。

该试剂盒的操作只需1人即可完成整个操作过程，一次可检测多个（由实际检测需要决定）样品，这样也减少了人力资源的浪费。

  SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉真福医药科技发展有限公司

 

<120> 快速检测副溶血弧菌的LAMP试剂盒

 

<130> 

 

<160>  17   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

acgcctctgc taatgaggt                                                  19

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gagattccgc tgggtttgt                                                  19

 

 

<210>  3

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gcgcttctgg ttcaacgatt gcagaaacga tcgtagagcc gt                        42

 

 

<210>  4

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

tgaatccttg gattccacgc gtgcagtacg caaatcggta gt                        42

 

 

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

cgcctctgct aatgaggtag                                                 20

 

 

<210>  6

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

gagattccgc tgggtttgt                                                  19

 

 

<210>  7

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

tggcgcttct ggttcaacga ttaaacgatc gtagagccgt ct                        42

 

 

<210>  8

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

tgtggcttct gctgtgaatc ctgcagtacg caaatcggta gt                        42

 

 

<210>  9

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

agaaacgatc gtagagccgt                                                 20

 

 

<210>  10

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

gagattccgc tgggtttgt                                                  19

 

 

<210>  11

<211>  41

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

agccacaggt gctttttcag gtcgacgact tctgacgcaa t                         41

 

 

<210>  12

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

tgaatccttg gattccacgc gtgcagtacg caaatcggta gt                        42

 

 

<210>  13

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

cgtagagccg tctttagcg                                                  19

 

 

<210>  14

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  14

cggaactgag attccgctg                                                  19

 

 

<210>  15

<211>  41

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  15

agccacaggt gctttttcag gtacgacttc tgacgcaatc g                         41

 

 

<210>  16

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  16

tgaatccttg gattccacgc gtgcagtacg caaatcggta gt                        42

 

 

<210>  17

<211>  328

<212>  DNA

<213>  副溶血弧菌

 

<400>  17

aacgcctaag cccgctttct tcagactcaa gctcaattga agttgaagaa cctgcttctg     60

 

ataacaatga cgcctctgct aatgaggtag aaacgatcgt agagccgtct ttagcgacga    120

 

cttctgacgc aatcgttgaa ccagaagcgc cagtagtacc tgaaaaagca cctgtggctt    180

 

ctgctgtgaa tccttggatt ccacgcgtta ttttattttt ggcactatta ctaccgattt    240

 

gcgtactgct gtttacaaac ccagcggaat ctcagttccg tcagattggt gagtatcaga    300

 

acgtaccagt gatgacacct gtaaatca                                       328

Claims (4)

1.一种快速检测副溶血弧菌的LAMP试剂盒，其特征在于，由LAMP反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；LAMP反应液含有引物，引物为以下4组特异性引物中的任意一组:

（1）上游外引物F3：5′-ACGCCTCTGCTAATGAGGT-3′；

下游外引物B3：5′-GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3′；

上游内引物FIP：5′-GCGCTTCTGGTTCAACGATTGCAGAAACGATCGTAGAGCCGT-3′；

下游内引物BIP：5′-TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3′；

（2）上游外引物F3：5′-CGCCTCTGCTAATGAGGTAG-3′；

下游外引物B3：5′-GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3′；

上游内引物FIP：5′-TGGCGCTTCTGGTTCAACGATTAAACGATCGTAGAGCCGTCT-3′；

下游内引物BIP：5′-TGTGGCTTCTGCTGTGAATCCTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3′；

（3）上游外引物F3：5′-AGAAACGATCGTAGAGCCGT-3′；

下游外引物B3：5′-GAGATTCCGCTGGGTTTGT-3′；

上游内引物FIP：5′-AGCCACAGGTGCTTTTTCAGGTCGACGACTTCTGACGCAAT-3′；

下游内引物BIP：5′-TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3′；

（4）上游外引物F3：5′-CGTAGAGCCGTCTTTAGCG-3′；

下游外引物B3：5′-CGGAACTGAGATTCCGCTG-3′；

上游内引物FIP：5′-AGCCACAGGTGCTTTTTCAGGTACGACTTCTGACGCAATCG-3′；

下游内引物BIP：5′-TGAATCCTTGGATTCCACGCGTGCAGTACGCAAATCGGTAGT-3′。

2.根据权利要求1所述的LAMP试剂盒，其特征是，所述LAMP反应液是由Bst DNA聚合酶大片段、LAMP10×buffer、10μmol/L的外引物、10μmol/L的内引物、5mol/L甜菜碱、50mmol/L MgSO₄和10mmol/L dNTPs组成。

3.根据权利要求1或2所述的LAMP试剂盒。其特征是,标准阳性模板是含有副溶血弧菌高度保守基因toxR基因328个碱基对的核苷酸片段构成的pMD18-T-toxR载体，toxR基因的核苷酸序列为SEQ ID No.17所示。

4.使用权利要求1～3所述的LAMP试剂盒检测副溶血弧菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①用缓冲蛋白胨水按照国标法培养待检样品1-4h；

②用水煮法从待测样品中提取DNA；

③将DNA加入到LAMP试剂盒的反应体系中，65℃保温1h；

④反应结束后，离心，肉眼观察沉淀，对样品进行定性分析。

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