CN110684825A - 一种对副溶血弧菌o9血清型o抗原分子分型的lamp检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对副溶血弧菌O9血清型O抗原分子分型的LAMP检测方法。本发明以副溶血弧菌O9的O抗原基因簇内的特异基因，即wvdH为靶基因，建立了对副溶血弧菌O9的O抗原分型的四条引物，为肠道及水环境中副溶血弧菌的O抗原分型提供一条可信的途径。利用本发明的LAMP引物检测肠道及水环境中的副溶血弧菌，并且对其进行O抗原分型，具有操作简单、快速高效、高灵敏度等诸多优点。

Description

一种对副溶血弧菌O9血清型O抗原分子分型的LAMP检测方法

技术领域

本发明涉及对样品中副溶血弧菌O9血清型菌株O抗原分型的LAMP技术及其制备方法。本发明还设计利用所述的LAMP引物进行检测的方法。

背景技术

副溶血弧菌，是一种革兰氏阴性菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无芽孢。是一种嗜盐性细菌。隶属于弧菌科弧菌属。副溶血弧菌在水、鱼类、含盐分较高的腌制食品及人类肠道中发现，能引起人的腹痛、呕吐、腹泻，是一种重要的肠道致病菌。目前对副溶血弧菌的分型鉴定主要根据有：细菌的形态学特征、细菌的生理生化特征、血清学反应等方法，副溶血弧菌的O抗原分型属于血清学反应的一种。由于环境和抗体的多样性，形成了O抗原的多样性，而根据O抗原的多样性可以对副溶血弧菌的不同菌株进行分型鉴定。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification）能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

其技术原理为：60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。

扩增分两个阶段：第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的F1为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板，下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的F1区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。

第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板，形成DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮的扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成。周而复始，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

发明人曾申请过：对副溶血弧菌K36，K37，K68特异的核苷酸及其应用；对副溶血弧菌K36，K37，K68特异的核苷酸及其应用。本申请和已经公开的专利申请的区别在于：检测手段不再利用基因芯片(因扩增和杂交分开进行，时间稍长)，而是利用LAMP技术检测（一步反应扩增检测，简单快速，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本低）。

发明内容

为实现上述目的，本发明公开了一种对样品中副溶血弧菌O9血清型O抗原分型的LAMP引物，该引物含有FIP 引物、F3引物、BIP引物以及B3引物。

5'端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 3'端的F3c、F2c和Flc区以及LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因

5'端的Flc区域序列相同。 FIP(Forward：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因 Inner Primer)

(Forward，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。 Outer F3引物：上游外部引物Primer)

5'端的Blc区域序列相同. 3'端的B2c区域互补，B1C域与靶基因 (Backward，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因 Inner BIP引物：下游内部引物Primer)

(Backward，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。 Outer B3引物：下游外部引物Primer)

其主要特征在于所述的副溶血弧菌O9血清型O抗原分型指的是：从副溶血弧菌O9血清型的O抗原基因簇特异基因序列，具有从SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示的DNA序列中的一种DNA序列。

本发明所述对样品中副溶血弧菌O9血清型O抗原分型的LAMP引物，其特征在于所述的引物序列：具有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示的引物。

本发明进一步公开了对样品中副溶血弧菌O9血清型O抗原分子分型的LAMP引物，在用于副溶血弧菌O9的O抗原分子分型检测方面的应用。所述的副溶血弧菌指的是分离于任何适合副溶血弧菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提。实验结果显示：本发明可以在较低的DNA浓度下对副溶血弧菌O抗原进行分型。

本发明提供检测环境中一种血清型的LAMP体系，该体系包括：WarmStartColorimetric LAMP 2X Master Mix (NEB)，10 μM FIP、F3、BIP以及B3引物， 1μL DNA和ddH₂O。所述的根据从副溶血弧菌O9血清型的O抗原基因簇特异基因序列设计的引物：从副溶血弧菌O9血清型的O抗原基因簇特异基因序列中用http://primerexplorer.jp/e/ 设计的B3、F3引物长度约为20 nt，Tm在55-60℃之间；BIP、FIP引物长度约为50 nt；其中引物序列中“-”代表“TTTT”。

本发明是LAMP环介导等温扩增技术的实际应用，用于副溶血弧菌O9血清型的副溶血弧菌分型鉴定。

由上述的技术方案可见，本发明首次将LAMP技术引入副溶血弧菌O抗原分型领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的样品中副溶血弧菌O9血清型LAMP检测方法，利用本发明的LAMP探针可以达到鉴定样品中常见的副溶血弧菌O血清型菌株的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，该发明对于各级医疗部门实时快速检测样品中副溶血弧菌O抗原分型具有重要的应用价值。

附图说明

图1 VP O9 LAMP反应阳性及特异性检测：在副溶血弧菌基因组样品O9的LAMP体系中分别加入副溶血弧菌O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12以及O13的基因组，与除O9外的基因组无交叉，说明副溶血弧菌O9的LAMP引物特异性良好；

图2 PS O9 LAMP反应外源菌株检测：在副溶血弧菌基因组样品O9的LAMP体系中分别加入类志贺邻单胞菌O45以及嗜肺军团菌O5的基因组，副溶血弧菌O9的LAMP引物特异性良好。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

本发明所用到的副溶血弧菌菌种来源如下表1所示：

表1 本实验所用到的菌种

a，BCRC: 台湾生物资源保存及研究中心

b，CDC：中国疾病预防控制中心

c，CNCTC：Czech National Collection of Type Cultures, the Czech Republic

实施例1

引物的设计

1、特异基因的筛选

据调查显示，27%的临床副溶血性弧菌对tdh和trh呈阴性。另一方面，毒素基因之间显著的核苷酸序列相似性经常出现在不同的细菌物种中，特别是在同一属内，这使得这些毒素基因无法用于细菌病原体的物种特异性鉴定。因此，在血清型鉴别检测中我们通常选择其O抗原簇中的特异基因（wzx或wzy）；

O-单元加工基因（wzx和wzy）和糖基转移酶基因通常对每一个O-抗原高度特异，并且通常用作基于PCR的O-血清群分型方法中的靶标。然而，由于副溶血弧菌中不存在O-侧链，副溶血弧菌不含O-单元加工基因。因此，在该研究中，主要基于位于副溶血性弧菌OGD的可变区中的特定糖基转移酶基因设计特异性引物。副溶血性弧菌O9血清型选用wvdH基因。本发明通过对基因簇中所有的基因进行all_vs_all_blast的方法，进行比对，特异基因的匹配数必然会远小于保守基因。综合上述方法找到特异基因并对其设计引物。

2、引物的设计

以挑选出来的1种副溶血弧菌的特异基因为模板设计 LAMP 的引物。

使用 http://primerexplorer.jp/e/根据加工 wzx (Backward，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。每种引物的数量和序列信息列于表2中。 Outer Primer 5'端的Blc区域序列相同；B3引物：下游外部引物) 3'端的B2c区域互补，B1C域与靶基因(Backward，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因 Inner Primer (Forward，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补；BIP引物：下游内部引物) Outer 5'端的Flc区域序列相同；F3引物：上游外部引物Primer) FIP(Forward：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因 Inner 基因的序列设计 LAMP引物。Primer)

B3、F3引物长度约为20 nt，Tm在55-60℃之间；BIP、FIP引物长度约为50 nt。引物由Invitrogen（中国上海）合成。

表2 LAMP 所用到的引物

实施例2

样本核酸的提取（分离于任何适合副溶血弧菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提液）

1、样品处理：取1 mL过夜培养的细菌菌液加入1.5 mL离心管中，室温8000 rpm，离心1min，弃上清，收集菌体。加入400 µL Buffer Digestion，震荡混匀，65 ℃水浴1 h至细胞完全裂解。

水浴过程中，每10 min颠倒混匀一次，可促进样品裂解，混合液变澄清透明为裂解完全；

2、加入200 µL Buffer PB，充分颠倒混匀，-20 ℃冰箱放置5 min；

3、室温10000 rpm离心5 min，将上清液（500-550 µL）转移到新的1.5 mL离心管中；

4、加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，室温放置2-3 min，室温10000 rpm离心5 min，弃上清；

5、加入1 mL 75%乙醇，颠倒漂洗1-3 min，10000 rpm离心2 min，弃上清；

6、重复步骤5一次；

7、开盖室温倒置5-10 min至残留的乙醇完全挥发；

8、得到的DNA用50-100 µL ddH₂O溶解，并于-20 ℃冰箱备用；

9、定浓度至300 ng/µL。

实施例3

阳性及特异性检测

以提取的核酸溶液作为LAMP反应的模板，LAMP反应体系及反应条件：

1、LAMP反应体系（25 µL）：

2、LAMP反应条件：

3、检测结果：

见图1所示，在副溶血弧菌基因组样品O9的LAMP体系中分别加入副溶血弧菌O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12以及O13的基因组，副溶血弧菌O9的LAMP引物特异性良好。

实例4

外源菌株检测

1、LAMP反应体系（25 µL）：

2、LAMP反应条件：

3、检测结果：

见图2所示，在副溶血弧菌基因组样品O9的LAMP体系中分别加入副溶血弧菌O9、类志贺邻单胞菌O45以及嗜肺军团菌O10的基因组，副溶血弧菌O9的LAMP引物特异性良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

<120> 一种对副溶血弧菌O9血清型O抗原分子分型的LAMP检测方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acaataagtc agctattgag aag 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgctcgtttt ctttatttac gt 22

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agatgtctca agcggtgcaa ttttaaaaag attatatctt tagccacgg 49

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aactaatgtt gggataggaa ctgcttttgg gtattccctg aactgg 46

Claims (4)

1.一种对副溶血弧菌O9血清型O抗原分子分型的LAMP检测方法，其主要特征在于具有从SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示的DNA序列中的一种DNA序列；所述的副溶血弧菌O抗原分型指的是：从副溶血弧菌O9的O抗原基因簇特异基因序列。

2.权利要求1所述对副溶血弧菌O9血清型O抗原分子分型的LAMP检测方法在用于副溶血弧菌O9血清型中O抗原分型检测方面的应用。

3.权利要求2所述的LAMP引物的应用，其特征在于该LAMP 引物用于副溶血弧菌O9血清型中O抗原分型检测。

4.权利要求3所述的应用，其中所述的副溶血弧菌指的是分离于任何适合副溶血弧菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提。

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