CN111850146A - 一种对柠檬酸杆菌o4和o12血清型o抗原分子分型的检测方法 - Google Patents

一种对柠檬酸杆菌o4和o12血清型o抗原分子分型的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种对杨葛氏柠檬酸杆菌（Citrobacter youngae,CY）O4血清型和吉伦氏柠檬酸杆菌（Citrobacter gillenii,CG）O12血清型O抗原分型的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。本发明以柠檬酸杆菌O4和O12的O抗原基因簇内的特异基因，即GT和wzx为靶基因，设计并筛选了对柠檬酸杆菌O4和O12的O抗原分型的各自四条引物，为食物水、土壤及肠道中柠檬酸杆菌的O抗原分型提供一条可信的途径。利用本发明的LAMP引物检测食物水、土壤及肠道中的柠檬酸杆菌，并且对其进行O抗原分型，具有操作简单、快速高效、高灵敏度等诸多优点。

Description

一种对柠檬酸杆菌O4和O12血清型O抗原分子分型的检测方法
技术领域
本发明涉及对样品中柠檬酸杆菌O4和O12血清型菌株O抗原分型的LAMP技术及其制备方法。本发明还设计利用所述的LAMP引物进行检测的方法。
背景技术
柠檬酸杆菌，是一种兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，属肠杆菌科。在液体培养基中菌体大小为6.0*1-2μm。通常无荚膜，以周毛运动。代谢方式有呼吸也有发酵代谢。柠檬酸杆菌菌株通常是从动物和人的水，土壤，食物和肠道中分离得到。可能引起菌血症、脑膜炎、败血症、腹膜炎、尿路感染、呼吸道感染和术后感染，尤其是婴儿、6岁以下的未成年儿童和免疫功能低下的人中，对该菌的感染率更高。尤其是侵染性柠檬酸杆菌感染与高死亡率相关，其中33–48％的患者死于柠檬酸杆菌菌血症。由于高分离率，严重感染和高死亡率，柠檬酸杆菌被认为是重要的机会病原体。近来开发的几种分型方法，例如脉冲场凝胶电泳，多位点序列分型和限制性片段长度多态性，已被用于检测和分离柠檬酸杆菌临床分离株。但是，基于O抗原变化的血清分型方案仍是临床标本和环境样品中革兰氏阴性病原体检测和鉴定的主流方法。
环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。
其技术原理为：60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。
扩增分两个阶段：第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的F1为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板，下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的F1区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板，形成DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮的扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成。周而复始，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。
本申请和已经公开的专利申请的区别在于：检测手段不再利用基因芯片(因扩增和杂交分开进行，时间稍长)，而是利用LAMP技术检测（一步反应扩增检测，简单快速，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本低）。
发明内容
为实现上述目的，本发明公开了一种对样品中柠檬酸杆菌O4和O12血清型O抗原分型的LAMP引物，该引物含有FIP 引物、F3引物、BIP引物以及B3引物。
LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因 3'端的F3c、F2c和Flc区以及 5'端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。
Primer) Inner FIP(Forward：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因 5'端的Flc区域序列相同。
F3引物：上游外部引物Primer) Outer (Forward，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物Primer) Inner (Backward，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因 3'端的B2c区域互补，B1C域与靶基因 5'端的Blc区域序列相同.
B3引物：下游外部引物Primer) Outer (Backward，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。
其主要特征在于所述的柠檬酸杆菌O4和O12血清型O抗原分型指的是：从柠檬酸杆菌O4和O12血清型的O抗原基因簇特异基因序列，具有从SEQ ID NO:1-8所示的DNA序列中的一种核苷酸序列。
本发明所述对样品中柠檬酸杆菌O4和O12血清型O抗原分型的LAMP引物，其特征在于所述的引物序列：具有从SEQ ID NO:1-8所示的引物。
本发明进一步公开了对样品中柠檬酸杆菌O4和O12血清型O抗原分子分型的LAMP引物，在用于柠檬酸杆菌O4和O12的O抗原分子分型检测方面的应用。所述的柠檬酸杆菌指的是分离于任何适合柠檬酸杆菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提。实验结果显示：本发明可以在较低的DNA浓度下对柠檬酸杆菌O抗原进行分型。
本发明提供检测环境中一种血清型的LAMP体系，该体系包括：WarmStartColorimetric LAMP 2X Master Mix (NEB)，10 μM FIP、F3、BIP以及B3引物， 1μL DNA和ddH2O。所述的根据从柠檬酸杆菌O4和O12血清型的O抗原基因簇特异基因序列设计的引物：从柠檬酸杆菌O4和O12血清型的O抗原基因簇特异基因序列中用http://primerexplorer.jp/e/ 设计的B3、F3引物长度约为20 nt，Tm在55-60℃之间；BIP、FIP引物长度约为50 nt；其中引物序列中“-”代表“TTTT”。
本发明是LAMP环介导等温扩增技术的实际应用，用于柠檬酸杆菌O4和O12血清型的柠檬酸杆菌分型鉴定。
由上述的技术方案可见，本发明首次将LAMP技术引入柠檬酸杆菌O抗原分型领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的样品中柠檬酸杆菌O4和O12血清型LAMP检测方法，利用本发明的LAMP探针可以达到鉴定样品中常见的柠檬酸杆菌O4和O12血清型菌株的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，该发明对于各级医疗部门实时快速检测样品中柠檬酸杆菌O抗原分型具有重要的应用价值。
附图说明
图1 CY O4 LAMP反应阳性及特异性检测：在柠檬酸杆菌基因组样品O4的LAMP体系中分别加入柠檬酸杆菌O12、O15、O20、O22、O24、O29、O32、O39以及O41的基因组，与除O4外的基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明柠檬酸杆菌O4的LAMP引物特异性良好；
图2 CG O12 LAMP反应阳性及特异性检测：在柠檬酸杆菌基因组样品O12的LAMP体系中分别加入柠檬酸杆菌O4、O15、O20、O22、O24、O29、O32、O39以及O41的基因组，与除O4外的基因组无交叉，说明柠檬酸杆菌O4的LAMP引物特异性良好。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
本发明所用到的柠檬酸杆菌菌种来源如下表1所示：
表1 本实验所用到的菌种
Figure 663952DEST_PATH_IMAGE001
实施例1
引物的设计
1、特异基因的筛选
O抗原加工基因wzy，wzx，wzm和wzt具有高度血清型决定性，因此已被广泛用作许多革兰氏阴性细菌分子血清分型的靶标基因。柠檬酸杆菌O12中，选择wzx作为特异基因。但在柠檬酸杆菌O4中，因为没有像 wzx/wzy 这么特异的基因，所以只能选择相对特异的基因，通常会是一些稀有的单糖基因或者是糖基转移酶基因，O4血清型就是选择糖基转移酶基因GT作为特异基因。
本发明通过对基因簇中所有的基因进行all_vs_all_blast的方法，进行比对，特异基因的匹配数必然会远小于保守基因。综合上述方法找到特异基因并对其设计引物。
2、引物的设计
以挑选出来的1种柠檬酸杆菌的特异基因为模板设计 LAMP 的引物。
使用 http://primerexplorer.jp/e/ 根据加工 GT和wzx 基因的序列设计 LAMP引物。Primer) Inner FIP(Forward：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因 5'端的Flc区域序列相同；F3引物：上游外部引物Primer) Outer (Forward，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补；BIP引物：下游内部引物) Primer Inner (Backward，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因 3'端的B2c区域互补，B1C域与靶基因 5'端的Blc区域序列相同；B3引物：下游外部引物) Primer Outer(Backward，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。每种引物的数量和序列信息列于表2中。
B3、F3引物长度约为20 nt，Tm在55-60℃之间；BIP、FIP引物长度约为50 nt。引物由GENEWIZ（中国天津）合成。
表2 LAMP 所用到的引物
Figure 908989DEST_PATH_IMAGE003
实施例2
样本核酸的提取（分离于任何适合柠檬酸杆菌生活的环境中所得到样品的纯培养物的粗提液）
1、将待测样品用无菌水稀释，通常稀释倍数为1：10（例如10g固体样品或10ml液体样品溶于90ml无菌水中），制成菌液母液（只取液体）。
将母液用无菌水再稀释5个梯度：1×10‐1、1×10‐2、1×10‐3、1×10‐4、1×10‐5，将每个梯度菌液分别均匀涂于LB固体培养基上37℃培养。待平板上生长出单个菌落时，将菌落挑起接种于LB液体培养基中，37℃，180rpm过夜培养（此步接种操作均在超净台中进行）。
2、样品处理：取1 mL过夜培养的细菌菌液加入1.5 mL离心管中，室温8000 rpm，离心1 min，弃上清，收集菌体。加入400 µL Buffer Digestion，震荡混匀，65 ℃水浴1 h至细胞完全裂解。
水浴过程中，每10 min颠倒混匀一次，可促进样品裂解，混合液变澄清透明为裂解完全；
3、加入200 µL Buffer PB，充分颠倒混匀，-20 ℃冰箱放置5 min；
4、室温10000 rpm离心5 min，将上清液（500-550 µL）转移到新的1.5 mL离心管中；
5、加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，室温放置2-3 min，室温10000 rpm离心5 min，弃上清；
6、加入1 mL 75%乙醇，颠倒漂洗1-3 min，10000 rpm离心2 min，弃上清；
7、重复步骤5一次；
8、开盖室温倒置5-10 min至残留的乙醇完全挥发；
9、得到的DNA用50-100 µL ddH2O溶解，并于-20 ℃冰箱备用；
10、定浓度至300 ng/µL。
实施例3
阳性及特异性检测
以提取的核酸溶液作为LAMP反应的模板，LAMP反应体系及反应条件：
1、LAMP反应体系示例（25 µL）：
Figure 485463DEST_PATH_IMAGE004
2、LAMP反应条件：
Figure 677410DEST_PATH_IMAGE005
3、检测结果：
见图1所示，在柠檬酸杆菌基因组样品O4的LAMP体系中分别加入柠檬酸杆菌O12、O15、O20、O22、O24、O29、O32、O39以及O41的基因组，柠檬酸杆菌O4的LAMP引物特异性良好。
见图2所示，在柠檬酸杆菌基因组样品O12的LAMP体系中分别加入柠檬酸杆菌O4、O15、O20、O22、O24、O29、O32、O39以及O41的基因组，柠檬酸杆菌O4的LAMP引物特异性良好。
SEQUENCE LISTING
<110> 南开大学
<120> 一种对柠檬酸杆菌O4和O12血清型O抗原分子分型的检测方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgttgccaga tttttacaag aa 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgagccaatc ctgaacat 18
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cagcatacaa aattgtgttt gtggatttta ggtgtctacg aatttataga agc 53
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatctgcata atcctggtag cctttttaca tgaccaggta actcaa 46
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaaagaaata cccgccgc 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tttcgacttt ggattatcac c 21
<210> 7
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acttcttggc agattaattt ccgatttttc aataaaaaat accgcaagta agg 53
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcgaatgata tagagtcgcc gttttaagtt atgtaattgc aggtgc 46

Claims (4)

1.一种对柠檬酸杆菌O4和O12血清型O抗原分子分型的LAMP检测方法，其主要特征在于具有从SEQ ID NO:1-8所示的核苷酸D序列；所述的柠檬酸杆菌O抗原分型指的是：根据柠檬酸杆菌O4和O12的O抗原基因簇特异基因序列对其进行O抗原分型。
2.权利要求1所述对柠檬酸杆菌O4和O12血清型O抗原分子分型的LAMP检测方法在用于柠檬酸杆菌O4和O12血清型中O抗原分型快速检测方面的应用。
3.权利要求2所述的LAMP引物的应用，其特征在于该LAMP 引物用于柠檬酸杆菌O4和O12血清型中O抗原分型检测。
4.权利要求3所述的应用，其中所述的柠檬酸杆菌指的是分离于适合柠檬酸杆菌生活的环境中，所得待测样品的纯培养物粗提液。
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