CN112063731A - 一种对肺炎链球菌19a血清型荚膜多糖抗原分子分型的lamp检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对肺炎链球菌19A血清型荚膜多糖抗原分型的LAMP检测方法。本发明以肺炎链球菌19A的荚膜多糖基因簇内的特异基因，即wzy为靶基因，建立了对肺炎链球菌19A的荚膜多糖分型的四条引物，为呼吸道及水环境中肺炎链球菌的荚膜多糖分型提供一条可信的途径。利用本发明的LAMP引物检测呼吸道及水环境中的肺炎链球菌，并且对其进行荚膜多糖分型，具有操作简单、快速高效、高灵敏度等诸多优点。

Description

一种对肺炎链球菌19A血清型荚膜多糖抗原分子分型的LAMP 检测方法

技术领域

本发明涉及对样品中肺炎链球菌19A血清型菌株荚膜多糖分型的LAMP技术及其制备方法。本发明还设计利用所述的LAMP引物进行检测的方法。

背景技术

ireptococcus），为兼性厌氧的革兰氏阳性菌。肺炎链球菌主要分布在人体的呼吸道，是主要的粘膜病原体，一般条件下无症状，当人体的抵抗力下降时可引发如中耳炎、鼻窦炎与肺炎等感染，严重时还会引发系统性疾病如败血症和脑膜炎等，尤其特别容易感染年龄较大的老人、免疫系统低下的婴幼儿以及重病患者。荚膜为其主要的致病物质，根据荚膜多糖抗原可将其分为90余种血清型，其中致病率较高的血清型有1-5、6A/B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F共23种血清型；其中，1、5、6A/B、14、19F和23F血清型这6种血清型为全球最常见的血清型。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification）能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

其技术原理为：60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。

扩增分两个阶段：第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的F1为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板，下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的F1区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。

第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板，形成DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮的扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成。周而复始，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

发明内容

为实现上述目的，本发明公开了一种对肺炎链球菌19A血清型荚膜多糖抗原分型的LAMP检测方法，其主要特征在于具有从SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示的DNA序列中的一种DNA序列；所述的肺炎链球菌荚膜多糖分型指的是：从肺炎链球菌19A的荚膜多糖基因簇特异基因序列。

本发明进一步公开了对肺炎链球菌19A血清型荚膜多糖抗原分型的LAMP检测方法在用于肺炎链球菌19A血清型中荚膜多糖分型检测方面的应用，其中所述的肺炎链球菌指的是分离于任何适合肺炎链球菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提。实验结果显示：本发明可以在较低的DNA浓度下对肺炎链球菌荚膜多糖进行分型。

本发明更加详细的描述如下：

本发明公开的对样品中肺炎链球菌19A血清型荚膜多糖分型的LAMP引物，该引物含有FIP 引物、F3引物、BIP引物以及B3引物。LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。

Prime 端的Flc区域序列相同。FIP(Forward Inner r)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5'

F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。

BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer)，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同.

B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer)，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。

本发明所述的肺炎链球菌19A血清型荚膜多糖分型指的是：从肺炎链球菌19A血清型的荚膜多糖基因簇特异基因序列，具有从SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示的DNA序列中的一种DNA序列。

本发明所述对样品中肺炎链球菌19A血清型荚膜多糖分型的LAMP引物，其特征在于所述的引物序列：具有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示的引物。

本发明提供检测环境中一种血清型的LAMP体系，该体系包括：WarmStartColorimetric LAMP 2X Master Mix (NEB)，10 uM FIP、F3、BIP以及B3引物， 1uL DNA和ddH₂O。所述的根据从肺炎链球菌19A血清型的荚膜多糖基因簇特异基因序列设计的引物：从肺炎链球菌19A血清型的荚膜多糖基因簇特异基因序列中用http://primerexplorer.jp/e/ 设计的B3、F3引物长度约为20 nt，Tm在55-60℃之间；BIP、FIP引物长度约为50 nt；其中引物序列中“-”代表“TTTT”。

本发明是LAMP环介导等温扩增技术的实际应用，用于肺炎链球菌19A血清型的肺炎链球菌分型鉴定。

由上述的技术方案可见，本发明首次将LAMP技术引入肺炎链球菌荚膜多糖分型领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的样品中肺炎链球菌19A血清型LAMP检测方法，利用本发明的LAMP探针可以达到鉴定样品中常见的肺炎链球菌19A血清型菌株的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，该发明对于各级医疗部门实时快速检测样品中肺炎链球菌荚膜多糖分型具有重要的应用价值。

附图说明

图1Sp19ALAMP反应阳性及特异性检测：添加的marker为DNA marker I，为500bp的marker，其条带大小从上到下依次为600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp及100 bp。除去DNA marker I的孔位外，按反应体系添加肺炎链球菌血清型对应的LAMP的B3、F3、BIP、FIP四条引物，每个孔位添加的模板依次为分别添加肺炎链球菌1-5、6A/B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F血清型共23种血清型的基因组。与除19A外的基因组无交叉，说明肺炎链球菌19A的LAMP引物特异性良好。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

本发明所用到的肺炎链球菌菌种来源如下表1所示：

实施例1

引物的设计

1、特异基因的筛选

绝大多数的肺炎链球菌负责荚膜多糖合成的基因存在于dexB和aliA两个保守基因之间。19A血清型Wzx/Wzy依赖型途径合成荚膜多糖,O-单元加工基因（wzx和wzy）和糖基转移酶基因通常对每一个O-抗原高度特异，并且通常用作基于PCR的O-血清群分型方法中的靶标。然而，由于肺炎链球菌中不存在O-侧链，肺炎链球菌不含O-单元加工基因。因此，在该研究中，主要基于位于肺炎链球菌OGD的可变区中的特定糖基转移酶基因设计特异性引物。肺炎链球菌19A血清型选用wzy基因。本发明通过对基因簇中所有的基因进行all_vs_all_blast的方法，进行比对，特异基因的匹配数必然会远小于保守基因。综合上述方法找到特异基因并对其设计引物。

2、引物的设计

以挑选出来的1种肺炎链球菌的特异基因为模板设计 LAMP 的引物。

使用http://primerexplorer.jp/e/根据加工wzy基因的序列设计 LAMP引物。FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同；F3引物：上游外部引物(ForwardOuter Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补；BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同；B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。每种引物的数量和序列信息列于表2中。

B3、F3引物长度约为20 nt，Tm在55-60℃之间；BIP、FIP引物长度约为50 nt。引物由Invitrogen（中国上海）合成。

实施例2

样本核酸的提取（分离于任何适合肺炎链球菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提液）

1、样品处理：取1 mL过夜培养的细菌菌液加入1.5 mL离心管中，室温8000 rpm，离心1min，弃上清，收集菌体。加入400 µL Buffer Digestion，震荡混匀，65 ℃水浴1 h至细胞完全裂解。水浴过程中，每10 min颠倒混匀一次，可促进样品裂解，混合液变澄清透明为裂解完全；

2、加入200 µL Buffer PB，充分颠倒混匀，-20 ℃冰箱放置5 min；

3、室温10000 rpm离心5 min，将上清液（500 µL）转移到新的1.5 mL离心管中；

4、加入等体积的异丙醇，颠倒5次使之充分混匀，室温放置3 min，室温10000 rpm离心5min，弃上清；

5、加入1 mL 75%乙醇，颠倒漂洗3 min，10000 rpm离心2 min，弃上清；

6、重复步骤5一次；

7、开盖室温倒置10 min至残留的乙醇完全挥发；

8、得到的DNA用50 µL ddH₂O溶解，并于-20 ℃冰箱备用；

9、定浓度至300 ng/µL。

实施例3

阳性及特异性检测

以提取的核酸溶液作为LAMP反应的模板，LAMP反应体系及反应条件：

1、LAMP反应体系（25 µL）：

2、LAMP反应条件：

3、检测结果：

见下图1所示，在肺炎链球菌基因组样品19A的LAMP体系中分别加入肺炎链球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的基因组，肺炎链球菌19A的LAMP引物特异性良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

<120> 一种对肺炎链球菌19A血清型荚膜多糖抗原分子分型的LAMP检测方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

attgcctatg taatcatgat gt 22

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctgaattga gcctccta 18

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgctatta aaccaacaaa tccaatttta tatccaacaa aaacggaaag t 51

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctactctttg tttttagccg gtcgttttga taggtcgaaa cactctca 48

Claims (4)

1.一种对肺炎链球菌19A血清型荚膜多糖抗原分型的LAMP检测方法，其主要特征在于具有从SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示的DNA序列中的一种DNA序列；所述的肺炎链球菌荚膜多糖分型指的是：从肺炎链球菌19A的荚膜多糖基因簇特异基因序列。

2.权利要求1所述对肺炎链球菌19A血清型荚膜多糖抗原分型的LAMP检测方法在用于肺炎链球菌19A血清型中荚膜多糖分型检测方面的应用。

3.权利要求2所述的LAMP引物的应用，其特征在于该LAMP 引物用于肺炎链球菌19A血清型中荚膜多糖分型检测。

4.权利要求3所述的应用，其中所述的肺炎链球菌指的是分离于任何适合肺炎链球菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提。

Images