CN1710108A - 用于肺炎链球菌血清型检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒 - Google Patents

用于肺炎链球菌血清型检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于肺炎链球菌血清型检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒，其中基因芯片包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，该寡聚核苷酸探针包括从肺炎链球菌16s rDNA中选取的DNA片段和从肺炎链球菌不同血清型K－抗原基因簇上聚合酶基因中选取的DNA片段。利用设计的引物将待检测样品基因组DNA扩增并标记后，用上述基因芯片进行杂交，根据杂交信号，可检测出肺炎链球菌的不同血清型。上述基因芯片、引物可以制成用于肺炎链球菌血清型检测的试剂盒。利用本发明的基因芯片可达到检测肺炎链球菌血清型的目的，操作简便，准确性高，重复性强，对于实验室中常规血清型鉴定和临床流行病学研究和诊断都具有重要意义。

Description

用于肺炎链球菌血清型检测的基因芯片 及其检测方法和检测用试剂盒
技术领域
本发明涉及一种基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒，尤其是涉及一种用于肺炎链球菌血清型检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒。
背景技术
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是导致发展中国家和发达国家各年龄组人群高发病率、高死亡率的主要致病菌，除引起肺炎、支气管炎等呼吸道系统疾病外，还可导致中耳炎、副鼻窦炎、脑膜炎、菌血症等多种疾病，对人类的健康构成了严重威胁。在美国每年由肺炎链球菌引起的肺炎约有50万人，中耳炎约6万人，菌血症约5万人，脑膜炎约0.5～0.6万人。在我国肺炎也是常见病之一，每年有250万人患肺炎球菌性肺炎并造成其中12.5万人死亡(以50岁以上中老年人和1岁以下婴儿为主)。婴幼儿化脓性中耳炎患者中1/3为肺炎球菌感染，复发率高达40％。据估计，全球因肺炎链球菌感染的死亡人数可能与结核相仿，每年约300～500万人(Tomasz A.1997.“Antibiotic resistance in StreptococcusPneumoniae.”Clin Infect Dis.24(Suppl)：S85.)。而WHO统计的全球每年因肺炎链球菌感染死亡的5岁以下儿童和成人均逾10万人(CDC.[J].MMWR，1997，46；1-24)，因此研究肺炎链球菌对于人类的健康具有很重要的意义。
血清分型是一种经典和常用的流行病学调查手段，对于临床研究及疫苗研制具有重要意义。研究表明，肺炎链球菌的主要致病物质为荚膜和溶血素。有荚膜是其毒力的必需条件，毒力的大小与荚膜中聚集的多糖的结构和含量有关，荚膜多糖有型特异性，是分型的基础，根据荚膜多糖的型特异性分成90个血清型(Garcia，E.D.2000.“Current trends in capsularpolysaccharide biosynthesis of Streptococcus pneumoniae.”Res.Microbiol.151：429-435.)。但不是每一个型都能同样地侵袭人体，其中的23个血清型可引起85％以上的侵袭性感染，这23型分别是1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F(Robbins JB，Austrian R，Lee CJ，et al.1983.Considerations forformulating the second-generation Pneumococcal capsular polysaccharidevaccine with emphasis on the cross-reactive types within groups.J Infect Dis.148：1136-1159.)(以下将该23种血清型肺炎链球菌简称为23型肺炎链球菌)。引起疾病的肺炎球菌型别常因地区、年代和人群的不同而不同。肺炎球菌3型在丹麦和瑞典是常见的血清型，英国1型较多，法国多见1型和19型，美国以8型最多，而14岁以下人群以14型最多，在南非以45型和46型为主，巴西以14、6B、23、5、19F、6A、1和4型常见。我国调查结果显示致病型肺炎球菌以5型最多，其次为6、1、19、23、14、2及3型。一般来说，肺炎链球菌疫苗中所含荚膜多糖的型别应占本地血清型的80％以上才能对本地人群起到有效的保护。而这23个血清型对美国、法国和中国常见血清型的覆盖率均在85％以上，所以可视为全球普遍运用的组分，因此研究这23型常见肺炎链球菌对开展大规模的血清型调查及对进一步研究肺炎链球菌感染和其耐药性，研制优势菌型疫苗进行预防等方面均具重要价值。
传统的肺炎链球菌分型方法主要有两大类，一类是自上世纪30年代以来一直被用于细菌分型和鉴定的血清学免疫反应，多采用“荚膜肿胀”试验进行分型，但由于所需抗血清种类一般不全，数量不足，且大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难，所以检测试剂盒相当昂贵，国内不易购得，也正因此目前我国开展的部分肺炎链球菌流行病学调查多为国际间的合作(如1981～1985年，在卫生部领导下，由中国药品生物制品检定所丁绍卿负责组织了全国18个省、市29个单位的协作组，参加了WHO的对“引起严重感染的肺炎球菌荚膜型的监测”的国际协作项目)。此外这种传统方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性也差，所以现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。分子生物学方法主要包括PCR方法和近几年发展起来的基因芯片技术。PCR方法是比较成熟的方法，快速、简单、敏感，但存在自动化程度低、一次检测信息量有限、难以实现高通量筛检、对未知来源或新出现的菌株鉴定难度大、在结果的判定上也不容易进行质量控制等不足。而发展中的基因芯片技术正可以弥补这些不足。
1997年7月，Affymetric，Inc.(Santa Clara，CA)公司的Thomas R.等人发明的第6,228,575号美国专利公开了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法。从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的核酸分析检测技术建立了起来，并随着人类基因组计划的开展而逐步发展。该技术综合运用了分子生物学、集成电路制造、计算机、半导体、共聚焦激光扫描、荧光标记等技术，使检测过程具有敏感性高、特异性强、大规模集成化、自动化、操作简便快捷、效率高等特点，在基因表达相关研究和生物制药研究等方面得到普遍应用。因此，如果将基因芯片技术用于细菌血清型鉴定，不仅可以大大简化检测手段，提高检测速度，而且具有高准确性、高灵敏度、高通量、可重复性强等诸多优点。
如前所述，肺炎球菌根据荚膜多糖的型特异性分成90个血清型，K-抗原是革兰氏阳性细菌荚膜多糖中的特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。K-抗原具有高度多样性，肺炎球菌有90种不同的K-抗原，K-抗原的变化可能是肺炎球菌的起源和维持其多样性的主要原因(Henrichsen，J.1999.Typing of Streptococcus pneumoniae：past，present，and future.Am.J.Med.107：50S-54S.)。研究表明编码负责K-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体DNA上相邻排列，形成一个基因簇，称为K-抗原基因簇(Jiang，S.M.，L.Wang，and P.R.Reeves.2001.Molecular characterizationof Streptococcus pneumoniae type 4，6B，8，and 18C capsular polysaccharidegene clusters.Infect.Immun.69：1244-1255.)，K-抗原基因簇中都含有寡糖单位处理酶基因，其中包括转运酶基因(wzx)和聚合酶基因(wzy)，它们编码的酶将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。因寡糖单位处理酶有特异的供体、受体和连接键，因此编码该寡糖单位处理酶的基因序列间的相似性很低。用Clustalx软件比对GenBank公共数据库内的wzy序列，证实此23型的wzy基因(3型为CapA基因，因为3型没有wzy基因，而CapA基因对其是特异的(Arrecubieta et al.，1996))之间的确具有很强的特异性，但有11个血清型与非常见致病型的肺炎链球菌血清型有较高的同源性，序列上区分不开，此11型如下：6A与6B，7A与7F，9L与9N，9A与9V，10A与10B、10C、10F，11A与11D、11F，12A与12B、12F、44、46，15B与15C，18A与18B、18C、18F，22A与22F，33A与33F、37。但并不影响此23型的血清型检测，此23型间的寡糖单位处理酶基因是对K-抗原较特异的基因，这启示我们选择其作为常见肺炎链球菌分型鉴定的特异基因与先进的生物芯片技术相结合，研究一种快速、准确、灵敏地检测肺炎球菌并将其分型的产品和方法。
发明内容
本发明的一种目的是提供一种用于肺炎链球菌血清型检测的基因芯片，以弥补传统肺炎链球菌分型检测技术存在的不足。
本发明的另一目的是提供一种利用上述基因芯片来快速、准确、灵敏地检测肺炎链球菌血清型的方法。
本发明的再一目的是提供一种利用上述基因芯片和检测方法来检测肺炎链球菌血清型的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提出一种用于肺炎链球菌血清型检测的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，该寡聚核苷酸探针包括从肺炎链球菌16s rDNA中选取的DNA片段和从肺炎链球菌不同血清型K-抗原基因簇上聚合酶基因中选取的DNA片段。
其中，上述肺炎链球菌不同血清型例如包括1、2、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型。从肺炎链球菌不同血清型K-抗原基因簇上聚合酶基因中选取的DNA片段例如分别具有如SEQ ID NO：2-NO：86所示的碱基序列。从肺炎链球菌16s rDNA中选取的DNA片段例如具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。
本发明还提出一种检测肺炎链球菌血清型的方法，包括以下步骤：
(1)根据肺炎链球菌16s rDNA和肺炎链球菌不同血清型K抗原基因簇中聚合酶基因序列设计并制备出用于PCR扩增的引物；
(2)按常规方法制备待测样品的基因组DNA，使用步骤(1)中的引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增并纯化靶序列；
(3)标记步骤(2)中得到的靶序列；
(4)将标记后的靶序列与本发明提出的上述基因芯片杂交；
(5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。
其中，上述步骤(1)中根据肺炎链球菌16s rDNA设计的上游引物序列例如为5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’和5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物序列为5’-CCGTCAATTCATTTAAGTTT-3’、5’-CGTCAATTCATTTGAGTTT-3’、5’-CCGTCAATTCCTTTAAGTTT-3’和5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’。根据肺炎链球菌不同血清型K抗原基因簇中聚合酶基因序列设计的引物例如分别具有如SEQ ID NO：87-NO：129所示的碱基序列。
上述步骤(5)中例如使用判读软件Bactarray Analyzer按下列步骤分析鉴定杂交结果：
(1)杂交信号的有效性验证
对上述基因芯片上每条特异探针的多个重复点的信号强度进行置信度检验，剔除异常的信号强度，取正常的信号强度的平均值作为每条特异探针的信号强度；
(2)归一化
使用上述基因芯片上全部特异探针的总信号强度值作为归一化标准，然后用每个探针点的信号强度除以该归一化标准，将每个探针点的绝对信号强度变为相对信号强度，从而使不同时间、不同条件下进行的试验具有可比性；
(3)对每条特异探针打分
针对每条特异探针给出一个分值，代表待测的DNA片段序列和该特异探针序列的相似程度；
(4)应用模式对待测样品中可能含有的血清型进行打分
这里的“模式”指的是待测样品与其相关的特异探针之间的对应关系的模式文件，该文件按照扩展标记语言1.0标准编写，不同类型的芯片有各自不同的模式。模式文件中保存了该类型芯片的基本信息以及该芯片所能检测的所有血清型与其相关特异探针之间的对应关系。在对待测样品中可能含有的血清型进行打分时，软件程序会统计该血清型对应的所有相关探针的分值，而该血清型的分值为所有相关探针分值的加权平均值。
(5)判断样品中可能含有的血清型
经过上述步骤的处理，软件程序给样品中所有可能的肺炎链球菌血清型均给出一个分值，分值最高的即为最有可能存在的血清型，分值低于阈值的血清型不可能存在。
本发明还提出一种用于肺炎链球菌血清型检测的试剂盒，包括：
基因芯片，其包含固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中，寡聚核苷酸探针包括从肺炎链球菌16s rDNA中选取的DNA片段和从肺炎链球菌不同血清型K-抗原基因簇上聚合酶基因中选取的DNA片段；
PCR扩增引物，根据肺炎链球菌16s rDNA和肺炎链球菌不同血清型K抗原基因簇中聚合酶基因序列设计。
此外，该试剂盒还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件Bactarray Analyzer。
由上述的技术方案可见，本发明首次将基因芯片技术引入肺炎链球菌分型检测领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的全新的肺炎链球菌血清型的基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到检测常见致病型肺炎链球菌血清型的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，无论对于实验室中常规血清型鉴定还是对于临床流行病学研究和诊断都具有重要意义。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
附图说明
图1为本发明基因芯片的一个实施例的外形示意图。
图2为本发明基因芯片的一个实施例上单一点阵探针排布规律示意图。
图3A为利用本发明基因芯片的一个实施例检测样品为肺炎链球菌5型时的杂交结果。
图3B为利用本发明基因芯片的一个实施例检测样品为肺炎链球菌7A或7F型时的杂交结果。
图3C为利用本发明基因芯片的一个实施例检测样品为肺炎链球菌19F型时的杂交结果。
具体实施方式
为进一步说明本发明的用于肺炎链球菌血清型检测的基因芯片及其检测方法，特举以下较佳实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
实施例一：探针的设计和制备
1.序列获得：用Artemis软件整理从Sanger Institute和GenBank公共数据库下载得到的肺炎链球菌16s rDNA序列和不同血清型的wzy(3型为Cap3A)序列。
2.探针设计：将上述序列导入OligoArray2.0软件中，参数设定如下：-n 20；-130；-L 40；-D 3000；-t 79；-T 90；-s 65℃；-x 65℃；-N 2；-p 33，-P 65；-m GGGGG CCCCC TTTTT AAAAA；-g 15。运行程序在线设计探针。
3.探针筛选：从输出结果中选择长度在35bp±2bp、Tm75℃±2℃的探针，并通过下述实施例四提供的方法利用杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的探针。
在本发明的优选实施例中，选择了260条长度在35bp±2bp、Tm75℃±2℃的探针，并通过517次杂交实验进行探针筛选，最终得到如表1所示的探针。其中，编号为NO.1的探针序列(SEQ ID NO：1)选自肺炎链球菌的16s rDNA，作为阳性对照用来检测肺炎链球菌种，编号为NO.2的探针作为荧光探针，编号为NO.3的探针为多聚T片段，用作阴性对照，编号NO.4-NO.92(不包括NO.12-NO.15)的85条探针序列(SEQ ID NO：2-NO：86)选自常见致病型的肺炎链球菌血清型(1、2、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型)的K-抗原基因簇上的wzy基因，编号NO.12-NO.15的4条探针序列选自肺炎链球菌血清型3的Cap3A基因。
     表1：本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的血清型
  探针编号   SEQID 探针序列(5’-3’)   可检测出的血清型
  NO.1   NO：1   GCTAGGTGTTAGACCCTTTCCGGGGTTTA   链球菌
NO.2   Cy3_TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 荧光探针
  NO.3   TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT   阴性对照
  NO.4   NO：2   TTGTATCAGCTAGTCGTAATTTACAGATTCTGATAT   1
  NO.5   NO：3   TATA CGGGATGCTGATATATCTGTATATGATACCTA   1
  NO.6   NO：4   ATATGGTTTTACTCTTGTGGGAGAGGGATAT   1
  NO.7   NO：5   ATTACATAATATGGGCAATTATTTCGAAGGTCG   1
  NO.8   NO：6   GTCAACGTATTGGAACTCTTAGAAATTGGGAAAAT   2
  NO.9   NO：7   TTCCTTATTGATACTGGGGTTATTGGCTTATTTAT   2
  NO.10   NO：8   TATACTACAGCTGATTCAACAGTGACAAGTTTCC   2
  NO.11   NO：9   ACTATAAAGGCTATTATTGGGTCAGGATTTGG   2
  NO.12   TGATCCTAGAATTGGATCATACTATAATAACCCTAG   3
  NO.13   AAATTGTTATTTACGAACCTACTATTGAGTGTGATA   3
  NO.14   ATGAAATCTGATTCTGATAATTTTCGTTCTAGTGCTG   3
  NO.15   CAGCTGTGGTGCAATCTAATAAAACAAGAAAAGATTA   3
  NO.16   NO：10   TACCTAATTTTGATAATGATCCTAACAGGAAGTCGT   4
  NO.17   NO：11   GAATATGGGATGACATTTCTACGCACTATCCTA   4
  NO.18   NO：12   CGTTGGTTTTAGTATACACACAATCTTTAGGGA   4
  NO.19   NO：13   AATGATCCTAACAGGAAGTCGTAAAATCCAGG   4
  NO.20   NO：14   TTATTCTCAACTTGTCTCTATATAATCGCAAGTG   5
  NO.21   NO：15   TTTGCTAAAGAAATTTCAGGACATGAATTAACAG   5
  NO.22   NO：16   GTTTTCTCAATTATGGTTATATAGTAGGGACTGCT   5
  NO.23   NO：17   TGAATATCGACCATCTAGTCTGACTTTGGAC   5
  NO.24   NO：18   TTTATTTGTTATAGATCCGATACGACGTAACAA   6A或6B
  NO.25   NO：19   ATGAGATGCTTGCAAAATTAGGATTTGACAATA   6A或6B
  NO.26   NO：20   TCTTTCTTTTAAAATTTGTATTAGGGCGCTCC   6A或6B
  NO.27   NO：21   ATTTTATCAGTTACATCACTCGTTATATGGGAGGTTC   6A或6B
  NO.28   NO：22   TTATTTGGCTATTCAACAGGAAACTATTCAACTAGT   7A或7F
  NO.29   NO：23   GGTCGGTTAAGTTCAATTGTTCAAATAATCTCAACT   7A或7F
  NO.30   NO：24   TAATATCTATCACTTGCATAGTGGTGGTCG   7A或7F
  NO.31   NO：25   ACGTAGCTGCTTTGTCAGAGTTAAAGATTA   7A或7F
  NO.32   NO：26   TTGTTGAAAATCTTGAACTTAGATGGATAGGATA   8
  NO.33   NO：27   TTTGATTCGTTTTATTCCTTCTTGATGAGTAATG   8
  NO.34   NO：28   GGGTCAATATGTTGATAAAGAAATTGTTTGGGATC   8
  NO.35   NO：29   ACGCAGACTAGAACAGCTCTACTAGTATCTATAGTA   8
  NO.36   NO：30   CGACTTTATTTGCTTTGCTTTCTACTTTAGTTAAGC   9L或9N
  NO.37   NO：31   AGCATAAAGTAACACTGATTGATATTCTAGTTGTTC   9L或9N
  NO.38   NO：32   AAACGTTGTACCTTAACTATGTTGGAGGTC   9L或9N
  NO.39   NO：33   TTCCCAAAGTTCTTTTACAGCATAAAGTAACACTG   9L或9N
  NO.40   NO：34   GTCAGACAGTGAATCTTAACTATATTGGAGGACA   9A或9V
  NO.41   NO：35   GTTAACTCCGCACACAATACCTTACTAGATATA   9A或9V
  NO.42   NO：36   TGCGTATGTTAGGTTTAAAGGAAAATATAGGAAAACC   9A或9V
  NO.43   NO：37   CGGGTATTTTATTTGTAGTGGTTCTTCTAAGTCTATTT   9A或9V
NO.44 NO：38 TTATTGGTTTAAGGTTCTTATTTCCATTAATCAAGA   10A或10B或10C或10F
NO.45 NO：39 TTGGCGTTTTAGTTTTGTTACAATGACTTATTATGT   10A或10B或10C或10F
NO.46 NO：40 ACCATATGGTATTTGTTGCCTGTAGGTATC   10A或10B或10C或10F
NO.47 NO：41 TTAAGAAAACTATTCTGGAAAAGAGGAAGGAAGATA   11A或11D或11F
NO.48 NO：42 GGTTTGTTTGGCTTTCAATTTAAACTTCCG   11A或11D或11F
NO.49 NO：43 TGTTGTAACTTTTATTGCATCTGTTGTGATGTTAG   11A或11D或11F
NO.50 NO：44 AATAAGAACTGCTATGAAATTTAAGTTCCTTTTCTCATTT   12A或12B或12F或44或46
NO.51 NO：45 TCTTTATCTTATTATGCCATGACAGCTTATATGATTAATG   12A或12B或12F或44或46
NO.52 NO：46 GACGTATTTCAGATTCTCAGCGTGGAATTTTATT   12A或12B或12F或44或46
NO.53 NO：47 AGTTCCTTTTCTCATTTATTGGAGGCCTGT   12A或12B或12F或44或46
  NO.54   NO：48   TAGCATTTGCAGTAGTCAATGAGATTAATTCAAAC   14
  NO.55   NO：49   TTCTTCTAGAGGTTTTGGTACTAAGCAAATCTAG   14
  NO.56   NO：50   CGGTTTATTCTATATACAAAGAGGCTCCAATGTA   14
  NO.57   NO：51   ATGATTGTAGCGTTTTATCCAACTATACCTCTTATA   15B或15C
  NO.58   NO：52   ATCTCTTAAAGCTATTAATGGGCTGGGAAT   15B或15C
  NO.59   NO：53   TCAAGAACAGGTAGTAATGTGACACGTTTTATAG   15B或15C
  NO.60   NO：54   GTAGTATTGTTTGGAAGAAGCTTATTAGGTTGG   15B或15C
  NO.61   NO：55   TAGTACCTCTTGTCAAATACATACTTACCCCT   17F
  NO.62   NO：56   ACCCATGCTCATAATAACTTTCTTCAAGTTTT   17F
  NO.63   NO：57   CCATATATTAGGGAATTTTCCTGGTTGGATTTG   17F
  NO.64   NO：58   TCTACGTTGAGTTTTCTAATTGTAGTTACTGGT   17F
NO.65 NO：59 TCGTTCTTTTGAGTGTATTAATTATCATACCAGTA   18A或18B或18C或18F
NO.66 NO：60 TAATATTAATTCGATGGCTAGAACAGATTTATGG   18A或18B或18C或18F
NO.67 NO：61 TTTGAAGTACTACATTGAGATAGGATTTGTAGGAT   18A或18B或18C或18F
NO.68 NO：62 TGAATATCAATGGTCTTACAGGGACAATGG   18A或18B或18C或18F
  NO.69   NO：63   CTACCTTTTACTATTCTTTATTCTTATCTGGACGT   19A
  NO.70   NO：64   GGTTCGATTCAGCATTTTAATCAGTATATTCAAAA   19A
  NO.71   NO：65   TTGTAGCTATTATGAATATTTTGGGTAATCTTGGCT   19A
  NO.72   NO：66   GCTCTAAAGATTTACTGCTCTTAGTTCCATTCTT   19A
  NO.73   NO：67   AATTCATTTAGAATTTCGGACACTAGGAGTTACTG   19F
  NO.74   NO：68   ATTGGTGCCTATATTAAATATATTAGGGGAAATGGGC   19F
  NO.75   NO：69   TTTCGGACACTAGGAGTTACTGTAGGAAATGTTTATA   19F
  NO.76   NO：70   TATCTAGGAGGCTCAATTCAGCATTTTAATCAGTAT   19F
  NO.77   NO：71   CGTTATTATACAGGAGCATATGATAAACAACACCAA   20
  NO.78   NO：72   ACTTCCTACTCCATCAAGAACTATTTATATGTTT   20
  NO.79   NO：73   ACTATTCACAATCGTTATGTGTTTATCGGTATTTCT   20
  NO.80   NO：74   CTGGGTCTGAATTTGTATCTCGAATAATACTACATT   20
  NO.81   NO：75   TCCCCAATACTATTAGAAAAGTGGAGTAGTAT   22A或22F
  NO.82   NO：76   GAAGCATACACAATGATTGCGAATACTGAT   22A或22F
  NO.83   NO：77   TTTATCTAGGACAACAACCTCCGTTTATAGGATTC   22A或22F
  NO.84   NO：78   TGCTAGGTTCAATTATCTTATGGCTATCAACTTTAT   22A或22F
  NO.85   NO：79   TTTAAGAAGGATATCATATTACTTATTGCACAGCAT   23F
  NO.86   NO：80   GCTAAACATCAGATTGATAGTTTTGTATTATGGTTA   23F
  NO.87   NO：81   TCAGCAGAAAATATGACGCTAAACATCAAAT   23F
  NO.88   NO：82   CCACCTTACCGATAAAGCTAATAAATAATCTCAGTG   23F
NO.89 NO：83 GGGGTTTATATAATAGGTTTGATTTTCCTATATGTTT   33A或33F或37
NO.90 NO：84 CCATTGAACAACATATGGATAGAACTGTTAGATATAA   33A或33F或37
NO.91 NO：85 CAGAAAAGTCCTATTTGGGGATTAGGTATTTCA   33A或33F或37
NO.92 NO：86 CAATATTATGGGATAATAAATCTGGAACTGGTTCAG   33A或33F或37
4.探针合成：将表1中的探针序列的5’端延长10个T(表1所示的荧光探针序列中已包含了延长的10个T)并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。
实施例二：引物的设计和制备
1.序列获得：用Artemis软件整理从Sanger Institute和GenBank公共数据库下载得到的肺炎链球菌16s rDNA序列和肺炎链球菌不同血清型的wzy(3型为Cap3A)序列。
2.设计引物：将上述序列导入引物设计软件Primer Premier 5.0软件中，相应参数设定如下：Search For：PCR Primers，Search types：Both.SearchRanges：Sense Primer 1 to 672，Anti-sense Primer 1 to 672，PCR ProductSize：100bp to 1000bp.Primer Length：20bp±2bp.Search Mode：Automatic.
3.引物选择：从输出结果中选取Tm值50℃±5℃、长度20bp±2bp、Hairpin：NONE、Dimer：NONE、False Priming：NONE、Cross Dimer：NONE且包含探针序列在内的引物。个别探针手动调节，引物适当加长或缩短几个碱基，使其包含探针、符合Tm值50℃±5℃及其它参数。
在本发明的优选实施例中，选取了既包含探针又适合Multiplex PCR的用于扩增23型肺炎链球菌血清型(1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型)DNA的引物98条，为适应Multiplex PCR，经生物信息学初筛并通过大量Multiplex PCR实验筛选，筛选出如表2所示的适用引物。
     表2用于肺炎链球菌待测样品DNA的PCR扩增的引物序列
  引物编号   SEQ ID   引物序列(5’-3’)   扩增作用
P-1   AGAGTTTGATCATGGCTCAG和AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 肺炎链球菌16s rDNA上游引物
P-2   CCGTCAATTCATTTAAGTTT、CGTCAATTCATTTGAGTTT、CCGTCAATTCCTTTAAGTTT和CCGTCAATTCCTTTGAGTTT 肺炎链球菌16s rDNA下游引物
  P-3   NO：87   ATTAAGTGGGCAAGTTTCA   1wzy上游引物
  P-4   NO：88   CGTTATGGACTGGCTGATG   2wzy上游引物
  P-5   GAGGTTCCGATACTGGTTG   3capA上游引物
  P-6   NO：89   CAGTTAGAGCGGCGAATA   4wzy上游引物
  P-7   NO：90   ATTATTCCAGCGACTACAC   6A/6B wzy上游引物
  P-8   NO：91   GCTTATTGTATGGTCCCTCC   7A/7F wzy上游引物
  P-9   NO：92   TATGTTTACTTTACGAGTTGGT   8wzy上游引物
  P-10   NO：93   ATGGCGACTTTATTTGCT   9L/9N wzy上游引物
  P-11   NO：94   TAAGGTAACGCTGATTGAC   9A/9V wzy上游引物
  P-12   NO：95   TTGTATGGCTAGTTCTTCTA   17F wzy上游引物
  P-13   NO：96   AGCACCTATGTGGAGTTTG   33A/33F/37wzy上游引物
  P-14   NO：97   CAATAACCAATGTTCCCAAT   1wzy下游引物
  P-15   NO：98   GATAAATAAGCCAATAACCC   2wzy下游引物
  P-16   GTTCATACGATTCGCTACA   3capA下游引物
  P-17   NO：99   CACCACCATAGTAACCAAAG   4wzy下游引物
  P-18   NO：100   ACTCTCCATTCTAAGCCTT   6A/6B wzy下游引物
  P-19   NO：101   TCTGCCAAACATCTCCATA   7A/7F wzy下游引物
  P-20   NO：102   AGACTGATAAGATAAGTAGCCA   8wzy下游引物
  P-21   NO：103   ATCCCAATAGACGTATGAAA   9L/9N wzy下游引物
  P-22   NO：104   ATGTAGCCTCCATCGTAAT   9A/9V wzy下游引物
  P-23   NO：105   CAAATCCTAAATATCCTCC   17F wzy下游引物
  P-24   NO：106   GTAATACGAAGCCAACATT   33A/33F/37wzy下游引物
  P-25   NO：107   TCCTGTTGGGAGTAGTGTCT   5wzy上游引物
  P-26   NO：108   GTGCGACTACGACCCTTAT   10A/10B/10C/10F wzy上游引物
  P-27   NO：109   TAAGTGGGTCAATCGGTGTT   11A/11D/11F wzy上游引物
  P-28   NO：110   TCCTAGAAACAGCATTATTAC   12A/12B/12F/44/46wzy上游引物
  P-29   NO：111   TTTGTATGGTGCTATGGAC   14wzy上游引物
  P-30   NO：112   TATGTTCAAAGAGGCGCTAA   15B/15C wzy上游引物
  P-31   NO：113   CTTTAGGCAGGGAGGACTT   18A/18B/18C/18F wzy上游引物
  P-32   NO：114   CGCCAGTTGTCATGTCTG   19A wzy上游引物
  P-33   NO：115   TTCAACGACTAGGACGCTAT   19F wzy上游引物
  P-34   NO：116   TATCAGGAATACGCCAATC   20wzy上游引物
  P-35   NO：117   AGATGCTGGTAGAACGCCT   22A/22F wzy上游引物
  P-36   NO：118   ATTTCTAGCTTATCCACCTT   23F wzy上游引物
  P-37   NO：119   TGCGGAAACGATGAGAAG   5wzy下游引物
  P-38   NO：120   TTGAACCCATAGATAACAG   10A/10B/10C/10F wzy下游引物
  P-39   NO：121   ATTTATTCCAACTTCTCCC   11A/11D/11F wzy下游引物
  P-40   NO：122   CAAATCCAAACCTTTTGTAA   12A/12B/12F/44/46wzy下游引物
  P-41   NO：123   TAGGGATTCCTCATACACTCT   14wzy下游引物
  P-42   NO：124   TCTGATTCCTGCTCCAAGT   15B/15C wzy下游引物
  P-43   NO：125   AATCCTACAAATCCTATCTCAA   18A/18B/18C/18F wzy下游引物
  P-44   NO：126   GTTGTAAACGAGTATTGCTC   19A/19F wzy下游引物
  P-45   NO：127   TGTGGTACGGTAGTGTTTC   20wzy下游引物
  P-46   NO：128   AAAGGCACCATATAGAAGGG   22A/22F wzy下游引物
  P-47   NO：129   CCCTTCGTCGTATTTCCA   23F wzy下游引物
3.引物合成：将表2中的引物序列委托引物合成公司(北京奥科)合成，备用。
实施例三：基因芯片制备——芯片点样
1.溶解探针：将实施例一中合成的探针分别溶解于50％二甲基亚砜(DMSO)溶液中，使探针的终浓度达到1μg/μl。
2.加板：将溶解好的探针加入384孔板的相应位置，每孔10μl。
3.点样：将如图1所示的57.5mm×25.5mm×1mm(长×宽×高)的洁净的醛基化玻片(CEL Associates，Inc.)放到芯片点样仪(Spotarray 72)的载物台上，使用SpotArray的控制软件(Tele chem smp3 stealty pin)，运行程序，按图2所示的排布方式点在醛基化的玻片上4.5mm×4.5mm的点样区内，构成中低密度DNA微矩阵，玻片上的四个点样区内阵列排布规律相同。
4.干燥：将点好的芯片室温下过夜干燥，然后在45℃烘箱干燥2小时。
5.交联：用交联仪(uvpcl-2000M ultraciolet Crosslinker)600J交联2次。将交联好的芯片放回洁净芯片盒中，备用。
由图2可见，每个点样区内为16(行)×14(列)个探针点。分散排布的灰色框示意的位置为检测肺炎链球菌的探针，灰色网格框示意的位置为荧光探针，黑色框示意的位置为负对照探针，其它为各型特异探针(见相应的探针编号)。
实施例四：利用基因芯片快速检测肺炎链球菌血清型
1.提取基因组：将分离到的待测肺炎链球菌单菌落用血平板，37℃，5％CO2培养箱过夜培养，按照常规提取普通革兰氏阳性菌基因组的方法提取肺炎链球菌培养物的基因组DNA。
2.扩增靶序列：各取上述提取到的100ng/μl基因组DNA 0.5μl加入Multiplex PCR反应混合液1、2中，PCR反应混合液1、2配方如下表3、4所示。(注：以下表3-表6中的PCR buffer、MgCl2、dNTP Mixture，Taq酶均购自Sangon公司)
     表3Multiplex PCR反应混合液1配方
  成分   浓度   加样量(μl)
  ddH2O10×PCR bufferMgCl2dNTP MixtureP-3至P-24P-1和P-2Taq酶   -10×25mM10mM10μM5μM5U/μl   14.7550.5各1各10.3
注：表中P-3至P-24以及P-1和P-2为表2中所列的引物。
    表4Multiplex PCR反应混合液2配方
  成分   浓度  加样量(μl)
  ddH2O10×PCR bufferMgCl2dNTP MixtureP-25至P-47P-1和P-2Taq酶   -10×25mM10mM10μM5μM5U/μl  13.7550.5各1各10.3
注：表中P-25至P-47以及P-1和P-2为表2中所列的引物。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃5min
94℃30sec
50℃30sec
72℃1min回到第二步，共35个循环
72℃5min
4℃20min
3.纯化：将上述获得的PCR扩增产物分别用纯化柱(MILIPORE公司)纯化，具体步骤如下：
(1)将PCR产物转移至纯化柱中，加水补足至400μl。
(2)25℃、6000rpm离心15min，丢弃收集管。
(3)将纯化柱转移到新的1.5ml的离心管中，加入25μl的超纯水(Milli_Q)，37℃放置5min。
(4)将纯化柱倒置放在1.5ml的离心管上，6000rpm离心2min，收集产物。
4.标记样品：取20μl纯化产物，分别加入相应的标记混合液1、2中，标记反应混合液1、2配方如下表5、6所示。
         表5标记混合液1配方
  成分   浓度  加样量(μl)
  ddH2O10×PCR bufferMgCl2dNTP MixtureP-14至P-24(表2)P-2(表2)Cy3-dUTPTaq酶   -10×25mM10mM10μM5μM25nM5U/μl  6.9550.5各110.30.3
注：表中P-25至P-47以及P-1和P-2为表2中所列的引物。
         表6标记混合液2配方
  成分   浓度  加样量(μl)
  ddH2O10×PCR bufferMgCl2dNTP MixtureP-37至P-47(表2)P-2(表2)Cy3-dUTPTaqE   -10×25mM10mM10μM5μM25nM5U/μl  16.9550.5各110.30.3
注：表中P-25至P-47以及P-1和P-2为表2中所列的引物。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃5min
94℃30sec
50℃30sec
72℃1min回到第二步，共35个循环
72℃5min
4℃20min
5.烘干：将标记产物置65℃烘箱烘干。
6.杂交：向杂交盒(博奥公司)内预加入50μl ddH2O以保持湿度。11μl杂交液(配方如下所示)回溶烘干产物并加在实施例三中制备的肺炎球菌血清型检测基因芯片的探针阵列区域，盖上定制的盖片(博奥公司)(注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，40℃水浴锅中杂交16h。
7.洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3min，洗液B中洗涤3min，洗液C中洗涤90sec，空气中风干。
杂交液配方：10％硫酸葡聚糖(dextran Sulfate)；25％甲酰胺(formamide)；0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)；6×SSPE
洗液A：1×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1％SDS
洗液B：0.05×SSC
洗液C：95％乙醇
8.扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXONinstrument)扫描，所用参数如下：
软件及版本：GenePix Pro 6.0
official name：575DF35
PMT Gain：650
扫描分辨率：10μm
扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式
用本发明的基因芯片分别检测样品为肺炎链球菌5型(此型在我国为最常见致病型)、7A型或7F型、19F型(此型在我国、法国及巴西均为常见致病型)时的杂交扫描结果分别如图3A、3B和3C所示。
9.分析判读：对于探针点较少的基因芯片，检测结果可由肉眼判断。然而，对于探针点较多的芯片使用肉眼判断既不客观也不现实。因此，为了客观、准确的对检测芯片的结果进行分析，本发明开发了一个计算机判读程序——BactarrayAnalyzer。
BactarrayAnalyzer基于Microsoft.NET Framwork开发，是一个界面友好、易于使用的程序。用户只需将芯片扫描仪扫描并套圈得到的荧光数据文件导入分析程序，进行简单设定后点击处理即可获得分析结果。下面对该软件的处理过程详述如下：
在芯片杂交完毕之后，荧光标记的目标DNA片段已被固定在芯片的特异探针上。使用芯片扫描仪可以看到探针的荧光图像，荧光的强弱代表着该点杂交情况的优劣，也就是目标DNA序列片段和该点特异探针DNA序列的相似性。在经过套圈分析之后，每个点的荧光强度值被读取并存储为本程序可处理的荧光强度文件。(不同型号的扫描仪命名规则不同，genpix扫描仪存储为.GPR文件，博奥扫描仪存储为.LSR文件)本软件的处理均针对荧光强度文件。
运行本发明的BactarrayAnalyzer软件，将需要分析的上述荧光强度文件添加到该软件的指定项目文件夹中，确认该项目文件夹中的各项目信息无误之后点击“处理”按钮，程序会自动处理该项目中的所有文件，并生成报告。最后，在该软件的“处理记录”页面记录着处理每个文件的过程中所出现的问题，在“处理结果”页面以摘要形式记录着所有文件的处理结果，在“检测报告”页面可以浏览项目的所有检测报告，使用“打印”按钮即可将最终的分析鉴定结果打印出来。
实施例五：对基因芯片进行特异性鉴定和灵敏度检测
对实施例三中制备的肺炎链球菌血清型检测基因芯片的特异性进行鉴定如下：
用不同肺炎链球菌血清型以及其他细菌来鉴定实施例三中制备的肺炎链球菌血清型检测基因芯片的特异性。在该特异性鉴定试验中，使用了常见致病的上述23型菌株135株，与该23型分不开的20个血清型的肺炎链球菌菌株44株，其余47型中11个型的11株菌株，和13种临床采样时可能混有的菌(唾液链球菌、卡他莫拉氏菌、表皮葡萄球菌、微黄奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、铜绿甲单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、嗜麦芽假单胞菌、粘质沙雷、变形杆菌、嗜肺军团菌、白色念珠菌)，利用本发明的基因芯片和上述检测方法进行杂交检测，均显示了正确的杂交结果，符合率达到100％，这说明本发明的基因芯片具有良好的特异性。
对实施例三中制备的肺炎链球菌血清型检测基因芯片的灵敏度进行检测如下：
该基因芯片的检测灵敏度经过144次杂交实验的验证，50ng的微量基因组DNA就可保证上述23型常见肺炎链球菌具有稳定、良好的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有很高的检测灵敏度。
根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以做出各种可能的等同改变或替换，而所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。
                           序列表
                      SEQUENCE LISTING
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>用于肺炎链球菌血清型检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒
<130>5P99001-CN
<160>129
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>29
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae
<400>1
gctaggtgtt agaccctttc cggggttta                                    29
<210>2
<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 1
<400>2
ttgtatcagc tagtcgtaat ttacagattc tgatat                            36
<210>3
<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 1
<400>3
tatacgggat gctgatatat ctgtatatga taccta                            36
<210>4
<211>31
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 1
<400>4
atatggtttt actcttgtgg gagagggata t                                 31
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 1
<400>5
attacataat atgggcaatt atttcgaagg tcg                               33
<210>6
<211>35
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 2
<400>6
gtcaacgtat tggaactctt agaaattggg aaaat                             35
<210>7
<211>35
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 2
<400>7
ttccttattg atactggggt tattggctta tttat                             35
<210>8
<211>34
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 2
<400>8
tatactacag ctgattcaac agtgacaagt ttcc                              34
<210>9
<211>32
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 2
<400>9
actataaagg ctattattgg gtcaggattt gg                                32
<210>10
<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 4
<400>10
tacctaattt tgataatgat cctaacagga agtcgt                            36
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 4
<400>11
gaatatggga tgacatttct acgcactatc cta                               33
<210>12
<211>33
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 4
<400>12
cgttggtttt agtatacaca caatctttag gga                               33
<210>13
<211>32
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 4
<400>13
aatgatccta acaggaagtc gtaaaatcca gg                                32
<210>14
<211>34
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 5
<400>14
ttattctcaa cttgtctcta tataatcgca agtg                              34
<210>15
<211>34
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 5
<400>15
tttgctaaag aaatttcagg acatgaatta acag                              34
<210>16
<211>35
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 5
<400>16
gttttctcaa ttatggttat atagtaggga ctgct                             35
<210>17
<211>31
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 5
<400>17
tgaatatcga ccatctagtc tgactttgga c                                 31
<210>18
<211>33
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 6B
<400>18
tttatttgtt atagatccga tacgacgtaa caa                               33
<210>19
<211>33
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 6B
<400>19
atgagatgct tgcaaaatta ggatttgaca ata                               33
<210>20
<211>32
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 6B
<400>20
tctttctttt aaaatttgta ttagggcgct cc                                32
<210>21
<211>37
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 6B
<400>21
attttatcag ttacatcact cgttatatgg gaggttc                           37
<210>22
<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 7F
<400>22
ttatttggct attcaacagg aaactattca actagt                            36
<210>23
<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 7F
<400>23
ggtcggttaa gttcaattgt tcaaataatc tcaact                            36
<210>24
<211>30
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 7F
<400>24
taatatctat cacttgcata gtggtggtcg                                   30
<210>25
<211>30
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 7F
<400>25
acgtagctgc tttgtcagag ttaaagatta                                   30
<210>26
<211>34
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 8
<400>26
ttgttgaaaa tcttgaactt agatggatag gata                              34
<210>27
<211>34
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 8
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tttgattcgt tttattcctt cttgatgagt aatg                              34
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<211>35
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 8
<400>28
gggtcaatat gttgataaag aaattgtttg ggatc                             35
<210>29
<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 8
<400>29
acgcagacta gaacagctct actagtatct atagta                            36
<210>30
<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9N
<400>30
cgactttatt tgctttgctt tctactttag ttaagc                            36
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<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9N
<400>31
agcataaagt aacactgatt gatattctag ttgttc                            36
<210>32
<211>30
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9N
<400>32
aaacgttgta ccttaactat gttggaggtc                                   30
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<211>35
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9N
<400>33
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<210>34
<211>34
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9V
<400>34
gtcagacagt gaatcttaac tatattggag gaca                              34
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<211>33
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9V
<400>35
gttaactccg cacacaatac cttactagat ata                               33
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9V
<400>36
tgcgtatgtt aggtttaaag gaaaatatag gaaaacc                           37
<210>37
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Type 9V
<400>37
cgggtatttt atttgtagtg gttcttctaa gtctattt                          38
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 10A
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<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 10A
<400>39
ttggcgtttt agttttgtta caatgactta ttatgt                            36
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 10A
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 11A
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<211>30
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 11A
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ggtttgtttg gctttcaatt taaacttccg                                   30
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 11A
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<211>40
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 12F
<400>44
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<211>40
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 12F
<400>45
tctttatctt attatgccat gacagcttat atgattaatg                        40
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<211>34
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 12F
<400>46
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 12F
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agttcctttt ctcatttatt ggaggcctgt                                   30
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<211>35
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 14
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<211>34
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 14
<400>49
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 14
<400>50
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 15B
<400>51
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 15B
<400>52
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<211>34
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 15B
<400>53
tcaagaacag gtagtaatgt gacacgtttt atag                              34
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 15B
<400>54
gtagtattgt ttggaagaag cttattaggt tgg                               33
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<211>32
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 17F
<400>55
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<211>32
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 17F
<400>56
acccatgctc ataataactt tcttcaagtt tt                                32
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 17F
<400>57
ccatatatta gggaattttc ctggttggat ttg                               33
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<211>33
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 17F
<400>58
tctacgttga gttttctaat tgtagttact ggt                               33
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 18C
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 18C
<400>60
taatattaat tcgatggcta gaacagattt atgg                              34
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<211>35
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 18C
<400>61
tttgaagtac tacattgaga taggatttgt aggat                             35
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 18C
<400>62
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<211>35
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19A
<400>63
ctacctttta ctattcttta ttcttatctg gacgt                             35
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<211>35
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19A
<400>64
ggttcgattc agcattttaa tcagtatatt caaaa                             35
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<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19A
<400>65
ttgtagctat tatgaatatt ttgggtaatc ttggct                            36
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<211>34
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19A
<400>66
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<211>35
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19F
<400>67
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<211>37
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19F
<400>68
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<211>37
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19F
<400>69
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<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19F
<400>70
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<210>71
<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 20
<400>71
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<211>34
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 20
<400>72
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<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 20
<400>73
actattcaca atcgttatgt gtttatcggt atttct                            36
<210>74
<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 20
<400>74
ctgggtctga atttgtatct cgaataatac tacatt                            36
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<211>32
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 22F
<400>75
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<211>30
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 22F
<400>76
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<210>77
<211>35
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 22F
<400>77
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<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 22F
<400>78
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<210>79
<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 23F
<400>79
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<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Type 23F
<400>80
gctaaacatc agattgatag ttttgtatta tggtta                            36
<210>81
<211>31
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 23F
<400>81
tcagcagaaa atatgacgct aaacatcaaa t                                 31
<210>82
<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 23F
<400>82
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<210>83
<211>37
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 33F
<400>83
ggggtttata taataggttt gattttccta tatgttt                           37
<210>84
<211>37
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 33F
<400>84
ccattgaaca acatatggat agaactgtta gatataa                           37
<210>85
<211>33
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 33F
<400>85
cagaaaagtc ctatttgggg attaggtatt tca                               33
<210>86
<211>36
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Type
<400>86
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<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 1
<400>87
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<210>88
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 2
<400>88
cgttatggac tggctgatg                                               19
<210>89
<211>18
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 4
<400>89
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<210>90
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 6B
<400>90
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<210>91
<211>20
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 7F
<400>91
gcttattgta tggtccctcc                                              20
<210>92
<211>22
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 8
<400>92
tatgtttact ttacgagttg gt                                           22
<210>93
<211>18
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9N
<400>93
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<210>94
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9V
<400>94
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<210>95
<211>20
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 17F
<400>95
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<210>96
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 33F
<400>96
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<210>97
<211>20
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 1
<400>97
caataaccaa tgttcccaat                                              20
<210>98
<211>20
<212>DNA
<213>streptococcus pneumoniae Serotype 2
<400>98
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<210>99
<211>20
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Type 4
<400>99
caccaccata gtaaccaaag                                              20
<210>100
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 6B
<400>100
actctccatt ctaagcctt                                               19
<210>101
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 7F
<400>101
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<210>102
<211>22
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 8
<400>102
agactgataa gataagtagc ca                                           22
<210>103
<211>20
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9N
<400>103
atcccaatag acgtatgaaa                                              20
<210>104
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 9V
<400>104
atgtagcctc catcgtaat                                               19
<210>105
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 17F
<400>105
caaatcctaa atatcctcc                                               19
<210>106
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 33F
<400>106
gtaatacgaa gccaacatt                                               19
<210>107
<211>20
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 5
<400>107
tcctgttggg agtagtgtct                                              20
<210>108
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 10A
<400>108
gtgcgactac gacccttat                                               19
<210>109
<211>20
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 11A
<400>109
taagtgggtc aatcggtgtt                                              20
<210>110
<211>21
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 12F
<400>110
tcctagaaac agcattatta c                                            21
<210>111
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 14
<400>111
tttgtatggt gctatggac                                               19
<210>112
<211>20
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 15B
<400>112
tatgttcaaa gaggcgctaa                                              20
<210>113
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 18C
<400>113
ctttaggcag ggaggactt                                               19
<210>114
<211>18
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19A
<400>114
cgccagttgt catgtctg                                                18
<210>115
<211>20
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19F
<400>115
ttcaacgact aggacgctat                                              20
<210>116
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 20
<400>116
tatcaggaat acgccaatc                                               19
<210>117
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Type 22F
<400>117
agatgctggt agaacgcct                                               19
<210>118
<211>20
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 23F
<400>118
atttctagct tatccacctt                                              20
<210>119
<211>18
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 5
<400>119
tgcggaaacg atgagaag                                                18
<210>120
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 10A
<400>120
ttgaacccat agataacag                                               19
<210>121
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 11A
<400>121
atttattcca acttctccc                                               19
<210>122
<211>20
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 12F
<400>122
caaatccaaa ccttttgtaa                                              20
<210>123
<211>21
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 14
<400>123
tagggattcc tcatacactc t                                            21
<210>124
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 15B
<400>124
tctgattcct gctccaagt                                               19
<210>125
<211>22
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 18C
<400>125
aatcctacaa atcctatctc aa                                           22
<210>126
<211>20
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 19A
<400>126
gttgtaaacg agtattgctc                                              20
<210>127
<211>19
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 20
<400>127
tgtggtacgg tagtgtttc                                               19
<210>128
<211>20
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 22F
<400>128
aaaggcacca tatagaaggg                                              20
<210>129
<211>18
<212>DNA
<213>Streptococcus pneumoniae Serotype 23F
<400>129
cccttcgtcg tatttcca                                                18

Claims (11)

1.一种用于肺炎链球菌血清型检测的基因芯片，其特征是包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中，寡聚核苷酸探针包括从肺炎链球菌16s rDNA中选取的DNA片段和从肺炎链球菌不同血清型K-抗原基因簇上聚合酶基因中选取的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的用于肺炎链球菌血清型检测的基因芯片，其特征是上述肺炎链球菌不同血清型包括1、2、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型。
3.根据权利要求1或2所述的用于肺炎链球菌血清型检测的基因芯片，其特征是上述从肺炎链球菌不同血清型K-抗原基因簇上聚合酶基因中选取的DNA片段分别具有如SEQ ID NO：2-NO：86所示的碱基序列。
4.根据权利要求1所述的用于肺炎链球菌血清型检测的基因芯片，其特征是上述从肺炎链球菌16s rDNA中选取的DNA片段具有如SEQ IDNO：1所示的碱基序列。
5.一种检测肺炎链球菌血清型的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)根据肺炎链球菌16s rDNA和肺炎链球菌不同血清型K抗原基因簇中聚合酶基因序列设计并制备出用于PCR扩增的引物；
(2)按常规方法制备待测样品的基因组DNA，使用步骤(1)中的引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增并纯化靶序列；
(3)标记步骤(2)中得到的靶序列；
(4)将标记后的靶序列与权利要求1所述的基因芯片杂交；
(5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。
6.根据权利要求5所述的检测肺炎链球菌血清型的方法，其特征是上述步骤(1)中根据肺炎链球菌16s rDNA设计的上游引物序列为5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’和5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物序列为5’-CCGTCAATTCATTTAAGTTT-3’、5’-CGTCAATTCATTTGAGTTT-3’、5’-CCGTCAATTCCTTTAAGTTT-3’和5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’。
7.根据权利要求5所述的检测肺炎链球菌血清型的方法，其特征是上述步骤(1)中根据肺炎链球菌不同血清型K抗原基因簇中聚合酶基因序列设计的引物分别具有如SEQ ID NO：87-NO：129所示的碱基序列。
8.根据权利要求5所述的检测肺炎链球菌血清型的方法，其特征是上述步骤(5)中使用判读软件BactarrayAnalyzer分析鉴定杂交结果。
9.根据权利要求8所述的检测肺炎链球菌血清型的方法，其特征是使用上述判读软件BactarrayAnalyzer按下列步骤分析鉴定杂交结果：
(1)杂交信号的有效性验证
对上述基因芯片上每条特异探针的多个重复点的信号强度进行置信度检验，剔除异常的信号强度，取正常的信号强度的平均值作为每条特异探针的信号强度；
(2)归一化
使用上述基因芯片上全部特异探针的总信号强度值作为归一化标准，然后用每个探针点的信号强度除以该归一化标准，将每个探针点的绝对信号强度变为相对信号强度；
(3)对每条特异探针打分
针对每条特异探针给出一个分值，代表待测的DNA片段序列和该特异探针序列的相似程度；
(4)应用模式对待测样品中可能含有的血清型进行打分
(5)判断样品中可能含有的血清型
经过上述步骤的处理，程序给样品中所有可能的肺炎链球菌血清型均给出一个分值，分值最高的即为最有可能存在的血清型，分值低于阈值的血清型不可能存在。
10.一种用于肺炎链球菌血清型检测的试剂盒，其特征是包括：
基因芯片，其包含固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中，寡聚核苷酸探针包括从肺炎链球菌16s rDNA中选取的DNA片段和从肺炎链球菌不同血清型K-抗原基因簇上聚合酶基因中选取的DNA片段；
PCR扩增引物，根据肺炎链球菌16s rDNA和肺炎链球菌不同血清型K抗原基因簇中聚合酶基因序列设计。
11.根据权利要求10所述的用于肺炎链球菌血清型检测的试剂盒，其特征是还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件Bactarray Analyzer。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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