CN1308462C - 个体化用药基因型诊断芯片及其制造方法和应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因技术领域，涉及一种个体化用药基因型诊断芯片及其制造方法和应用方法。该诊断芯片包括承载基片和在基片上呈阵列式分布的多种基因探针，基因探针含有多个与药物代谢及效应相关基因突变位点的互补寡核苷酸序列，芯片上基因探针阵列里设置有参照探针。每个突变位点设计野生型和突变型两种探针。本发明芯片制造方法是：根据所需检测的基因位点附近的碱基序列，每个突变位点设计野生型和突变型两种探针，设计长度为17-22bp的探针，使用DNA序列合成仪合成探针，用芯片点样仪将探针点在基片上，点样后将芯片固化处理，贮存于4℃备用。个体化用药基因型诊断芯片的应用方法包括采样、样本处理、PCR反应扩增、杂交、洗片、读片、结果分析等步骤。
Description
技术领域
本发明属于基因技术领域，涉及一种个体化用药基因型诊断芯片及其制造方法和应用方法。
背景技术
基因芯片(Gene chip)又称DNA芯片(DNA CHIP)、DNA阵列(DNA arrays)、寡核苷酸微芯片(oligonucleotide micro-chip)，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对杂交信号的强度进行分析和处理，从而迅速得出所要的信息。目前，基因芯片技术正逐渐应用到生命科学各个领域中。
基因芯片制备技术：基因芯片的实质是高度集成的寡核苷酸阵列，制造基因芯片首先要解决的技术是如何在芯片片基上定位合成高密度的核酸探针。目前，基因芯片的制备技术主要有原位合成与合成后点样两种。
基因芯片在临床疾病诊断中的应用：从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。例如，Affymetrix公司和Oncormed公司合作研制的p53基因芯片可监测50％以上肿瘤患者的p53基因突变，可在癌症早期诊断中发挥作用。基因芯片在感染性疾病、遗传性疾病、重症传染病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比，它可以在一张芯片同时对病人进行多种疾病的检测，勿需机体处于免疫应答反应期，能及早诊断，待测样品用量小；能特异性检测病原微生物的亚型及变异；可帮助医生及患者从“系统、血管、组织和细胞层次(第二阶段医学)”转变到“DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次(第三阶段医学)”上了解疾病的发生、发展过程。这些特点使得医务人员在短时间内，可以掌握大量的疾病诊断信息，有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。
遗传性疾病的诊断：随着人类基因组计划的完成，许多遗传性疾病的相关基因被相继定位，例如肥胖病、老年痴呆症、精神病、高血压病、地中海贫血等。以往研究突变和多态性时多采用PCR-SSCP、手工或自动测序、异源双链分析、蛋白截短检测等方法，所有这些都需经过电泳环节，不能满足大规模、低消耗和自动化的要求。应用基因芯片方法检测时可克服上述不足，且与DNA聚合酶或连接酶结合检测时可获得更高的分辨率。目前国内已有国家计划生育科研所开发的地中海贫血基因诊断芯片，用于诊断病人是否携带地中海贫血的致病基因。
感染性疾病的诊断：伴随病原微生物基因组计划的进展，使基因诊断病原微生物感染成为可能。基因芯片技术不仅避免了繁琐而费时的病原微生物培养，而且不需要等到抗体的出现，为病原微生物诊断提供了强有力的技术手段。
肿瘤的诊断及治疗：基因芯片技术已广泛地用于肿瘤组织与正常组织基因表达在mRNA水平上的差异，为研究肿瘤发生机制提供强有力的工具。目前利用该技术可以对包括白血病、淋巴瘤、皮肤黑色素瘤及乳腺癌等多种肿瘤疾病的肿瘤细胞亚群进行区分，还可以利用该技术对治疗方案进行评估和新药药效评价，此外还能对肿瘤的发生、发展和转归的预测提供分子依据。
其它应用：基因芯片还广泛地应用于药物筛选、药物作用机制研究、毒理学研究、基因扫描、环境化学毒物的筛选、耐药菌株和药敏检测等多个应用领域。人们相信，在新的世纪中，基因芯片将会在人类疾病的基因诊断中发挥巨大的作用，为整个世界带来巨大的社会效益和经济利益。
目前国内用于临床诊断的基因芯片：a.上海联合基因公司开发的迈科锐乙型肝炎病毒突变检测基因芯片，主要用于早期发现乙肝病毒对拉米扶定的耐药倾向。b.国家计划生育科研所开发的地中海贫血基因诊断芯片，用于诊断地中海贫血的致病基因。c.此外还有：浙江江南生物公司开发的结核杆菌抗药性芯片，陕西超群公司开发的SP GC-200型遗传缺陷检测芯片。
药物代谢和效应的个体差异：临床上，同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异(单核苷酸多态性，SNP)，导致对药物产生不同的反应。例如目前在临床上广泛应用的药物有50％以上在人体内是通过细胞色素P450酶代谢的，如果病人CYP2D6酶的基因发生突变就会导致经这种酶代谢的数十种药物在人体内的代谢减弱、缺失或者增强，这些药物包括右美沙芬、可待因、地昔帕明、氯米帕明、丙米嗪、氟西汀、帕罗西汀、氟哌啶醇、去甲替林、奋乃静、硫利达嗪、氟卡尼、恩卡尼、异喹胍、美托洛尔、丁呋洛尔、噻吗洛尔、卡维地洛、司巴丁、美西律、普罗帕酮等。中国人中大约有51％的CYP2D6酶基因为活性较弱的基因型。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断，再开处方，就可对病人实施个体优化治疗。
现有临床用药方法的缺陷：在很多疾病的治疗过程中，常发生用药不当而导致的副作用或因剂量不足无法达到治疗目的。因此针对这些病患的基因型进行个体化用药具有特别重要的意义。以前，医生如果需要调整病人的用药，需要长时间观察，病人也需要做大量的检测。若怀疑病人可能因遗传因素对某种药敏感，需要提取DNA、PCR扩增、限制性核酸酶内切等一系列操作，不利于同时检测多种基因的变异。这种调整用药的过程程序复杂，费时，延误治病时机，
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前对疾病的治疗过程中，用药的品种和剂量难以确定的状况，提供一种方便、快捷的辅助临床医生制定个体化用药方案的个体化用药基因型诊断芯片及其制造方法和应用方法。
解决本发明技术问题所采用的技术方案是该个体化用药基因型诊断芯片包括承载基片和在基片上呈阵列式分布的多种基因探针，基因探针含有药物代谢及效应相关基因突变位点的互补寡核苷酸序列，根据药物基因组学的研究结果，这些突变位点在人群中的发生率较高，且对某些疾病的临床常用药的药代动力学或药效有明显影响(基因突变位点的确定是根据临床上对某些疾病的常用药查找与其药效的个体差异关系密切，发生频率比较高、有应用价值的突变位点)。此外，为了控制芯片质量，芯片上基因探针阵列里亦可设置阳性参照探针。每个突变位点设计野生型基因探针阵列和突变型基因探针阵列两种探针，其探针长度为17-22bp。每个承载基片上可设置多个基因探针阵列即多个点样区域。承载基片可采用硅片、玻璃片、塑料片、尼龙膜等固相介质，其表面可经过化学修饰。
本发明个体化用药基因型诊断芯片制造方法是：根据所需检测的基因位点附近的碱基序列，每个突变位点设计野生型和突变型两种探针，设计长度为17-22bp的探针，使用DNA序列合成仪合成探针，用点样装置将探针按一定的间距点在基片上，点样面积可根据探针数量、探针间距、点的大小等因素进行调整，点样后将芯片按探针与基片结合方式的不同，采取适当的方法进行固化。然后立即使用或贮存于4℃备用。
承载基片可采用硅片、玻璃片、塑料片、尼龙膜等固相介质。为提高探针与基片结合的效率和检测灵敏度，探针和基片可作进一步修饰和包被。如其基片表面处理方式可为多聚赖氨酸包被、琼脂糖包被、氨基或醛基化修饰。
本发明个体化用药基因型诊断芯片的应用方法是：
(1)采样：从病人身上采血1-2ml；
(2)样本处理
使用基因组DNA抽提试剂盒提取DNA；
以下涉及到荧光标记引物及其产物的操作步骤均在避光条件下(有红灯的暗室内)进行。
(3)PCR反应扩增
使用基因突变位点特异性引物通过PCR反应对DNA标本扩增，使用荧光物质或同位素对引物或dNTP进行标记。
(4)杂交
取PCR产物混合液，加参照溶液及经预热的杂交液，混匀，变性3分钟后置冰上，全部转移到个体化用药基因型诊断芯片的点样区域(对照点样矩阵定位芯片)，加盖玻片(注意不要有气泡)；杂交舱里加几滴水，以保持湿度；将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进恒温箱或水浴保温一小时。
(5)洗片
打开杂交舱，取出芯片，用洗脱液冲掉盖玻片，然后把芯片放入洗脱液中，室温(25℃±10℃)放置5分钟，用灭菌双蒸水冲洗二遍。室温下干燥。
(6)读片
推荐使用ScanArray4000扫描仪在60-85扫描强度下扫描。
(7)结果分析
采用人工判读或使用配套软件分析。根据基因型分析结果和相关资料给出用药调整意见。
本发明利用这种芯片只需病人1-2毫升血液，便能够在3-4小时内迅速得到结果，并配合专用软件，向临床医生提供明确的建议。采用这一新的诊断方法，医生可以在病人用药前对处方进行调整，大大减少了病人不必要的痛苦与经济负担。并且，采用基因芯片技术，可以同时检测多个变异位点，一次判断出病人可能对哪些药物敏感或耐受。检测结果可以终生指导其用药。
附图说明
图1是本发明个体化用药基因型诊断芯片结构图
图2用于高血压病个体化用药基因型诊断芯片平面图
图中：1-承载基片 2-点样区域 3-阵列式分布的基因探针 4-贴标签处 5-参照探针 6-野生型基因探针阵列 7-突变型基因探针阵列
具体实施方式
以下根据本发明制造的用于高血压个体化用药基因型诊断芯片为例对本发明作进一步的详细描述。
根据临床上对高血压病人的常用药查找与其代谢及药效的个体差异关系密切的基因突变位点，并选择在中国人中发生频率比较高、有应用价值的7个基因突变位点，制做检测这几个突变位点的基因型检测芯片。用于高血压病人的个体化用药基因型诊断芯片含有检测7个基因突变位点的探针，这7个基因突变位点为：CYP2C9*3，CYP2C19*2，CYP2C19*3，CYP2D6*10，ADRB1(A145G)(β1肾上腺素受体基因)，ADRB1(G1165C)(β1肾上腺素受体基因)，AGTR1(A1166G)(血管紧张素2的1型受体基因)。
基片处理：基片采用玻璃介质，其表面处理方式采用氨基化修饰。具体步骤为：
(1)在2mol/L NaOH-70％乙醇溶液中清洗玻片2h后，用蒸馏水冲洗5遍，110℃烤干并冷却至室温；
(2)将玻片置于1％的3-氨丙基三甲氧基硅烷-95％丙酮溶液中浸泡2min；
(3)取出后用丙酮冲洗10次，每次5min；
(4)110℃干燥45min；
(5)在1g/L的1，4-苯二异硫氰酸盐溶液中处理2h；
(6)用甲醇清洗5min，丙酮冲洗5min，室温干燥。
探针制备：
(1)在DNA合成仪上合成所需序列的寡核苷酸(包括5’端的10～15个碱基的polyT)；
(2)在DNA序列合成仪上，将寡核苷酸poly(T)分子臂引入活泼的脂族氨基臂。
(3)以HPLC纯化5’端氨基修饰的寡核苷酸，离心干燥后，溶于100mmol/LNa2CO3/NaHCO3溶液(PH9.0)，浓度为2mmol/L。
基因芯片的制做：按图2所示的用于高血压病个体化用药基因型诊断芯片平面结构图，在一块玻璃介质的基片1上划分为两个基因探针点样区域2，每个点样区域的面积为10mm*8mm，在每个点样区域内的阵列式分布的基因探针3第1行的探针和第1列的探针都为阳性参照探针5，第2行为突变位点CYP2C9*3基因探针，第3行为突变位点CYP2C19*2基因探针，第4行为突变位点CYP2C19*3基因探针，第5行为突变位点CYP2D6*10基因探针，第6行为突变位点ADRB1(A145G)(β1肾上腺素受体基因)基因探针，第7行为突变位点ADRB1(G1165C)(β1肾上腺素受体基因)基因探针，第8行为突变位点AGTR1(A1166G)(血管紧张素2的1型受体基因)基因探针。这7个突变位点基因探针形成的阵列双分成两部分：野生型基因探针阵列6和突变型基因探针阵列7。
打印与打印后处理：
(1)探针溶液各取2μl，用点样仪按上述格式打印到处理过的基片上；
(2)37℃封闭处理1h；
(3)用1％的氨水溶液洗涤5min，再用双蒸水洗涤3次；
(4)室温干燥后立即使用或贮存于4℃备用。
应用方法：
(1)试剂盒：见表1
表1中所列试剂成分：
引物混合物1：含有用于扩增CYP2C9*3，CYP2C19*2，CYP2C19*3，CYP2D6*10，AGTR1(A1166G)5个基因突变位点的多重PCR的荧光标记引物；
引物混合物2：含有用于扩增ADRB1(A145G)，ADRB1(G1165C)2个基因突变位点的多重PCR的荧光标记引物；
阳性参照溶液：合成的阳性参照探针互补序列，经荧光标记。
杂交液：0.2％SDS
50×洗脱液：10％SDS
(2)实验操作步骤
①采样：从病人身上采血1ml；
②样本处理
使用Takara基因组DNA抽提试剂盒提取DNA；
以下涉及到引物及其产物的操作步骤必须在避光条件下(有红灯的暗室内)进行。
③PCR反应
含有表1所列试剂的试剂盒所提供的所有引物均为引物混合物，使用前请先充分溶解混匀。
(A)在25μl的反应体系中含引物混合物1(试剂2)2.5μl，模板50-100ng，1×PCR缓冲液，MgCl22.0mM，dNTPs 0.2mM及2U Taq酶。
PCR程序：94℃预变性3分钟；然后94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸40秒，如此35个循环；再72℃延伸5分钟。
(B)在25μl的反应体系中含引物混合物2(试剂3)2.5μl，模板50-100ng，1×PCR GC Buffer II，MgCl2 1.5mM，dNTPs 0.2mM及2U LA Taq酶。
PCR程序：94℃预变性3分钟；然后94℃变性30秒，60℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，如此30个循环；再72℃延伸7分钟。
注意：上述成分充分混匀，最后加入Taq酶并混匀，但不可剧烈振荡；放置PCR管于PCR仪上，用铝箔纸包裹PCR仪上PCR反应区域。
④杂交
将(A)及(B)PCR产物混合，混匀，取7μl PCR产物混合液，加阳性参照溶液(试剂4)1μl及经48℃预热的杂交液(试剂5)6μl，混匀，94℃变性3分钟后置冰上，全部转移到芯片的点样区域(请对照点样矩阵定位芯片)，加盖玻片(注意不要有气泡)；杂交舱里加几滴水，以保持湿度；将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进48℃(±1℃)恒温箱或水浴保温一小时。
⑤洗片
打开杂交舱，取出芯片，用1X洗脱液(试剂6)冲掉盖玻片，然后把芯片放入盛有1X洗脱液(试剂6)的染色缸，室温(25℃±10℃)放置5分钟，用灭菌双蒸水冲洗二遍。室温下干燥。
⑥读片
使用ScanArray4000扫描仪在60-85扫描强度下扫描。
⑦结果分析
采用人工判读或使用配套软件分析。根据基因型分析结果和相关资料给出用药调整意见：
基因型为CYP2C9*3的个体，洛沙坦(Losartan)应使用较大剂量。
基因型为CYP2C19*2及CYP2C19*3的个体，普萘洛尔应使用较小剂量。
基因型为CYP2D6*10的个体，美托洛尔、普萘洛尔、比索洛尔卡维地洛和地尔硫卓均应使用较小剂量。
基因型为ADRB1(G1165C)的个体，在使用美托洛尔或阿替洛尔时应使用较小剂量。
基因型为AGTR1(A1166G)的个体，在使用洛沙坦(Losartan)时应使用小剂量。
本发明个体化用药基因型诊断芯片指标：
检出率(已检出的标本数/标本总数)＞95％
准确性(正确检出的标本数/检出的标本总数)＞99％
重复性(同一标本正确检出的次数/总检测次数)＞99％
表1 高血压个体化用药基因型诊断芯片试剂盒内容
| 试剂编号 | 试剂名称 | 数量 | 贮藏及备注 |
| 1 | 基因芯片 | 5片(2人份/片) | 4℃保存 |
| 2 | 引物混合物1 | 1管 | 使用前加ddH2O溶解至50μl，-20℃保存 |
| 3 | 引物混合物2 | 1管 | 使用前加ddH2O溶解至50μl，-20℃避光保存 |
| 4 | 阳参溶液 | 15μl | -20℃避光保存 |
| 5 | 杂交液 | 1管(100μl) | 4℃保存 |
| 6 | 50X洗脱液 | 1瓶(20ml) | 常温保存，使用前加ddH2O稀释至1X |
| 7 | 盖玻片 | 15片 | 易碎 |
| 8 | 杂交舱 | 1个 | 室温 |
| 9 | 定位玻片 | 1片 | 为带有点样矩阵框印迹的玻片，杂交时用于定位 |
| 其它组成 | 使用说明书 | 1份 |
表2 高血压个体化用药基因型诊断芯片试剂成分
| 试剂编号 | 试剂名称 | 成分 |
| 5 | 杂交液 | 0.2％SDS |
| 6 | 50X洗脱液 | 10％SDS |
表3 高血压个体化用药基因型诊断芯片探针序列
| 探针名称 | 序列(5’-3’) |
| 阳性参照探针 | ACCTTGGAATGTCCACAG |
| CYP2C19*2野生型探针 | CCCAGGAACCCACCGGA |
| CYP2C19*2突变型探针 | GAAGCCTATTTCCCAGT |
| CYP2C9*3野生型探针 | CCAGCATCCCTGGATCCG |
| CYP2C9*3突变型探针 | TCCAGGTTTTACGCGGC |
| CYP2D6*10野生型探针 | ATCCCGCATGAGTAGCG |
| CYP2D6*10突变型探针 | TGAGTAGCGTGATTGCC |
| ADRB1(145A) | CTTAAAGCCCCGATTGGA |
| ADRB1(145G) | GTTAAGCGAAGGCCGGCC |
| ADRB1(1165G) | GGACCGAGCAGTCCCGCA |
| ADRB1(1165C) | ATTGCCGAGCAGTCCGGT |
| AGTR1(1166A) | AAGGGAAAATGAGCATTA |
| AGTR1(1166G) | CTAAACAAATGAGCCTTA |
表4 高血压个体化用药基因型诊断芯片引物序列
| 引物或互补序列名称 | 序列(5’-3’) |
| 阳性参照探针互补序列 | CTGTGGACATTCCAAGGT |
| CYP2C19*2正向引物 | TTGCGGCTAACGAGAGGATTTG |
| CYP2C19*2反向引物 | TTCGGGATATGAAGCAACAGTG |
| CYP2C9*3正向引物 | CTTTTCGTCCATCAGTTTTTCGA |
| CYP2C9*3反向引物 | TCCTTTTCCCGGCATCAGTTTTT |
| CYP2D6*10正向引物 | TCAAAAGCAGGTCGAACTATAA |
| CYP2D6*10反向引物 | TTTCGCAGAGCTGGTGGCATAT |
| ADRB1正向引物 | CCGACACTTTCATGGCGCCTGG |
| ADRB1反向引物 | GGAGCAAATTGTTGTGTTCCAATC |
| ADRB1正向引物 | TTTCGGAGCCCATTTGGAGCGGTA |
| ADRB1反向引物 | GAACCCATTTTGGCGGTAGTGAGG |
| AGTR1正向引物 | CCGGAAGCCATCACGCGTAGCAGA |
| AGTR1反向引物 | GCTTAAGGCGAGGGTTCGTGATGG |
序列表
<110>周，宏灏
<120>个体化用药基因型诊断芯片及其制造方法和应用方法
<150>CN03124852.7
<151>2003-09-22
<160>26
<170>PatentIn version 3.3
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tccttttccc ggcatcagtt ttt 23
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<211>22
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>prim_bind
<222>(1)..(22)
<400>19
tcaaaagcag gtcgaactat aa 22
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<211>22
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>prim_bind
<222>(1)..(22)
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tttcgcagag ctggtggcat at 22
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<211>22
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>prim_bind
<222>(1)..(22)
<400>21
ccgacacttt catggcgcct gg 22
<210>22
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<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
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ggagcaaatt gttgtgttcc aatc 24
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
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<222>(1)..(24)
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tttcggagcc catttggagc ggta 24
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<213>人类(Homo sapiens)
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gaacccattt tggcggtagt gagg 24
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ccggaagcca tcacgcgtag caga 24
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<211>24
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<222>(1)..(24)
<400>26
gcttaaggcg agggttcgtg atgg 24
Claims (3)
1、一种个体化用药基因型诊断芯片，包括承载基片(1)和在基片上呈阵列式分布的基因探针(3)，其特征在于基因探针(3)包含CYP2C19*2(G681A)位点基因型检测探针、CYP2C9*3(A1061C)位点基因型检测探针、CYP2D6*10(C100T)位点基因型检测探针、ADRB1(A145G)位点基因型检测探针、ADRB1(G1165C)位点基因型检测探针、AGTR1(A1166G)位点基因型检测探针。
2、根据权利要求1所述的个体化用药基因型诊断芯片，其特征在于针对CYP2C19*2(G681A)位点设计的正向引物序列为TTGCGGCTAACGAGAGGATTTG，反向引物序列为TTCGGGATATGAAGCAACAGTG，针对CYP2C9*3(A1061C)位点设计的正向引物序列为CTTTTCGTCCATCAGTTTTTCGA；反向引物序列为TCCTTTTCCCGGCATCAGTTTTT，针对CYP2D6*10(C100T)位点设计的正向引物序列为TCAAAAGCAGGTCGAACTATAA；反向引物序列为TTTCGCAGAGCTGGTGGCATAT，针对ADRB1(A145G)位点设计的正向引物序列为CCGACACTTTCATGGCGCCTGG；反向引物序列为GGAGCAAATTGTTGTGTTCCAATC，针对ADRB1(G1165C)位点设计的正向引物序列为TTTCGGAGCCCATTTGGAGCGGTA；反向引物序列为GAACCCATTTTGGCGGTAGTGAGG，针对AGTR1(A1166G)位点设计的正向引物序列为CCGGAAGCCATCACGCGTAGCAGA；反向引物序列为GCTTAAGGCGAGGGTTCGTGATGG。
3、根据权利要求2所述的个体化用药基因型诊断芯片，其特征在于芯片上基因探针(3)阵列里设置参照探针(5)，参照探针(5)的序列为：ACCTTGGAATGTCCACAG。
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