具体实施方式
对比例1
采用PCR-直接测序鉴定法鉴定来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.2084。
1.样品处理及DNA提取:将来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.2084灭活后,提取DNA;
2.结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下:
(1)根据现有技术合成下述结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物及下游引物:
靶基因 |
引物序列(5’→3’) |
片段大小(bp) |
rpoB |
上游引物5′-GGT GGT CGC CGC GAT CAA G-3’下游引物5′-CGA GCC GAT CAG ACC GAT GT-3’ |
240 |
katG |
上游引物5′-GCG GCG GTC GAC ATT 3′下游引物5′CTC GAG GAA ACT GTT GTC CC 3′ |
273 |
embB |
上游引物5′-CGC CTG GAC CAG TTG GAC 3′下游引物5′GAA CCA GCG GAA ATA GTT GGA C 3′ |
258 |
rpsL |
上游引物5′-GCA GCG TCG TGG TGT AT 3′下游引物5′CGC GGA TGA TCT TGT AGC 3′ |
215 |
rrs |
上游引物5′-GCC TTC GGG TTG TAA AC-3’下游引物5′-AGT TAA GCC GTG AGA TTT CA 3′ |
200 |
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释,使其浓度为3.75μmol/L;
(2)取10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及5U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用;浓度各为3.75μmol/L的结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和下游引物分别装入一无菌的塑料管中备用。
3.结核分枝杆菌耐药基因检测试剂的保存:将结核分枝杆菌耐药基因检测试剂保存于-20℃冰箱中,不要保存在无霜型冰箱的冷冻室,若保存得当,可保持活性一年。
4.PCR扩增:
①反应体系总体积各100μl。
②在5个0.5ml塑料离心管中分别加入下列试剂:
试剂I 加样顺序 体积(μl)
水 1 57.0
10×PCR缓冲液 2 10.0
3.75μmol/L rpoB上游引物 3 8.0
3.75μmol/L rpoB下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 99.0
试剂II 加样顺序 体积(μl)
水 1 57.0
10×PCR缓冲液 2 10.0
3.75μmol/L katG上游引物 3 8.0
3.75μmol/L katG下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 99.0
试剂III 加样顺序 体积(μl)
水 1 57.0
10×PCR缓冲液 2 10.0
3.75μmol/L embB上游引物 3 8.0
3.75μmol/L embB下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 99.0
试剂IV 加样顺序 体积(μl)
水 1 57.0
10×PCR缓冲液 2 10.0
3.75μmol/L rpsL上游引物 3 8.0
3.75μmol/L rpsL下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 99.0
试剂V 加样顺序 体积(μl)
水 1 57.0
10×PCR缓冲液 2 10.0
3.75μmol/L rrs上游引物 3 8.0
3.75μmol/L rrs下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 99.0
③混匀后,分别于95℃变性8min。
④稍冷却后,分别加Taq DNA聚合酶1μl(含5U),混匀,分别加液体石蜡40μl,以防扩增过程中水份蒸发,离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中,于94℃变性1分钟,58℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,循环35次。最后72℃延伸5分钟。
⑥分别取5μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳检测,结果分别可见一条240bp、273bp、258bp、215bp、200bp的片段。
5.直接测序鉴定法:分别将剩余的95μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR扩增产物和20μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因下游引物一起送上海生工生物技术有限公司进行DNA测序。
6.测序结果如图1-1至图1-5所示,用生物分析软件GENEDOC分析显示结核分枝杆菌临床分离株No.2084的rpoB基因531位密码子(TTG)与结核分枝杆菌标准株rpoB基因531位密码子(TCG)不同,说明该分离株rpoB531位密码子发生点突变;rrs基因513位碱基(C)与结核分枝杆菌标准株rrs基因513位碱基(A)不同,说明该分离株rrs基因513位密码子发生点突变;katG、embB和rpsL基因序列与结核分枝杆菌标准株的完全相同,说明该分离株katG、embB和rpsL基因未发生突变,为野生型。
实施例1
一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
1.结核分枝杆菌耐药基因检测膜片的制备方法如下:
(1)根据现有技术合成下述寡核苷酸探针:
探针编号 |
密码子 |
序列(5’→3’) |
基因型 |
M |
16S rRNA |
5’-TATTAGACCCAGTTTCCC | |
MT |
16S rRNA |
5’-ACAAGACATGCATCCCGT-3’ | |
No.1 |
rpoB 531 |
5′-CC CAG CGC
CGA CAG TC-3’ |
野生型(TCG) |
No.1b |
rpoB 531 |
5′--A GCG C
CA ACA GTC GG-3’ |
突变型(TTG) |
No.1c |
rpoB 531 |
5′--CCA GCG C
CC ACA GTC-3’ |
突变型(TGG) |
No.1d |
rpoB 531 |
5′--CCA GCG C
GT ACA GTC G-3’ |
突变型(TAC) |
No.2 |
rpoB 526 |
5′-GCG CTT
GTG GGT CAA-3’ |
野生型(CAC) |
No.2b |
rpoB 526 |
5′-G GCG CTT
GTA GGT CAA C-3’ |
突变型(TAC) |
No.2c |
rpoB 526 |
5′-G GCG CTT
GTC GGT CA-3’ |
突变型(GAC) |
No.2d |
rpoB 526 |
5′-G GCG CTT
GCG GGT CAA C-3’ |
突变型(CGC) |
No.2e |
rpoB 526 |
5′-CG GCG CTT
GAG GGT CA-3’ |
突变型(CTC) |
No.3 |
rpoB 516 |
5′-GTT CTG
GTC CAT GAA-3’ |
野生型(GAC) |
No.3b |
rpoB 516 |
5′-TT GTT CTG
GCC CAT GA-3’ |
突变型(GGC) |
No.4 |
rpoB 533 |
5′-G CCC
CAG CGC CGA CAG-3’ |
野生型(CTG) |
No.4b |
rpoB 533 |
5′-G CCC
CGG CGC CGA CA-3’ |
突变型(CCG) |
No.5 |
rpoB 513 |
5′-C CAT GAA
TTG GCT CAG C-3’ |
野生型(CAA) |
No.5b |
rpoB 513 |
5′-T GAA
TTT GCT CAG CT-3’ |
突变型(AAA) |
No.6 |
rpoB 511 |
5′-A TTG GCT
CAG CTG GCT-3’ |
野生型(CTG) |
No.6b |
rpoB 511 |
5′-A TTG GCT
CGG CTG GCT-3’ |
突变型(CCG) |
K1 |
katG 315 |
5′-T GCC
GCT GGT GAT CGC-3’ |
野生型(AGC) |
K1b |
katG 315 |
5′-T GCC
GGT GGT GAT CGC-3’ |
突变型(ACC) |
K1c |
katG 315 |
5′-AT GCC
GTT GGT GAT CGC-3’ |
突变型(AAC) |
E1 |
embB306 |
5′-GC
CAT GCC CAG GAT GTA G-3’ |
野生型(ATG) |
E1b |
embB306 |
5′-GC
CAC GCC CAG GAT G-3’ |
突变型(GTG) |
E1c |
embB306 |
5′-GC
CAG GCC CAG GAT G-3’ |
突变型(CTG) |
E1d |
embB306 |
5′-GC
TAT GCC CAG GAT G-3’ |
突变型(ATA) |
E1e |
embB306 |
5′-GC
AAT GCC CAG GAT G-3’ |
突变型(ATT) |
S1 |
rpsL43 |
5′-CTT
CTT CGG AGT GGT-3’ |
野生型(AAG) |
S1b |
rpsL43 |
5′-TCGG CTT
CCT CGG AGT-3’ |
突变型(AGG) |
rrs1 |
rrs 513位碱基 |
5′-C CGC GGC
TGC TGG CAC-3’ |
野生型(A) |
rrs1b |
rrs 513位碱基 |
5′-C CGC GGC
GGC TGG CAC-3’ |
突变型(C) |
rrs1c |
rrs 513位碱基 |
5′-CGC GGC AGC TGG CAC-3’ |
突变型(T) |
所有的寡聚核苷酸探针在3’末端加有100个dT。
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA缓冲液稀释合成的寡核苷酸探针,使其浓度为6pmol/μl;
(3)20×SSC溶液的配制:氯化钠175.3g,柠檬酸钠88.2g,溶于800ml蒸馏水中,用10M氢氧化钠调pH至7.0,然后定容至1000ml,高压灭菌。取20×SSC溶液用蒸馏水稀释10倍成2×SSC溶液,将硝酸纤维膜浸入2×SSC溶液中预处理10min,置37℃温箱烘干;
(4)取0.8μl寡核苷酸探针点于预处理后的硝酸纤维膜上,在紫外灯下照射10分钟,用水简单漂洗,晾干备用;
2.结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下:
(1)根据现有技术合成下述5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物:
靶基因 |
引物序列(5’→3’) |
片段大小(bp) |
16S RNA |
上游引物5′-bio-CGA GTG GCG AAC GGG TGA G--3′下游引物5′-TTG TGC AAT ATT CCC CAC TGC TG--3′ |
280 |
rpoB |
上游引物5′-bio-GGT GGT CGC CGC GAT CAA G-3’下游引物5′-CGA GCC GAT CAG ACC GAT GT-3’ |
240 |
katG |
上游引物5′-bio-GCG GCG GTC GAC ATT 3′下游引物5′CTC GAG GAA ACT GTT GTC CC 3′ |
273 |
embB |
上游引物5′-bio-CGC CTG GAC CAG TTG GAC 3′下游引物5′GAA CCA GCG GAA ATA GTT GGA C 3′ |
258 |
rpsL |
上游引物5′-bio-GCA GCG TCG TGG TGT AT 3′下游引物5′CGC GGA TGA TCT TGT AGC 3′ |
215 |
rrs |
上游引物5′-bio-GCC TTC GGG TTG TAA AC-3’下游引物5′-AGT TAA GCC GTG AGA TTT CA 3′ |
200 |
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释,使其浓度各为3.75μmol/L;
(2)取10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及1U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用;浓度各为3.75μmol/L的5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG基因的上游引物和不带标记的下游引物混合(简称混合引物I)装入一无菌的塑料管中备用;浓度各为3.75μmol/L的5’端带生物素标记的结核分枝杆菌embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物混合(简称混合引物II)装入一无菌的塑料管中备用。
3.结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的装配及保存:将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片密封后和结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂装入一纸盒容器,保存于-20℃冰箱中,不要保存在无霜型冰箱的冷冻室,若保存得当,可保持活性一年。
结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的应用:
(1)样品处理及DNA提取:将来自于解放军309医院的分枝杆菌临床分离株No.2084灭活后,提取DNA;
(2)PCR扩增:
①反应体系总体积各100μl。
②在2个0.5ml塑料离心管中分别加入下列试剂:
试剂I 加样顺序 体积(μl)
水 1 65.0
10×PCR缓冲液 2 10.0
3.75μmol/L混合引物I 3 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 4 8.0
和dTTP
DNA样品 5 8.0
总计 99.0
试剂II 加样顺序 体积(μl)
水 1 65.0
10×PCR缓冲液 2 10.0
3.75μmol/L混合引物II 3 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 4 8.0
和dTTP
DNA样品 5 8.0
总计 99.0
③混匀后,分别于95℃变性8min。
④稍冷却后,分别加Taq DNA聚合酶1μl(含5U),混匀,分别加液体石蜡40μl,以防扩增过程中水份蒸发,离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中,于94℃变性1分钟,58℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,循环35次。最后72℃延伸5分钟。
分别取5μl试剂I和试剂II的PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳检测,结果分别可见二条240bp和273-280bp以及二条258bp、215-200bp的片段。
(3)预杂交液配制:6×SSC溶液,5×Denharts溶液,0.1mg/ml小牛胸腺DNA,0.5十二烷基硫酸钠(简称SDS)溶液。
50×Denharts溶液 10ml
20×SSC溶液 30ml
10SDS溶液 5ml
10mg/ml小牛胸腺DNA 1ml
加水定容至 100ml
(4)预杂交:将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片和4ml预杂交液装入杂交袋中,于37℃水浴孵育30min;
(5)杂交:将试剂I和试剂II的PCR扩增产物40μl分别置98℃变性10min,置冰浴中冷却5min后,加入杂交袋中,于37℃水浴孵育30min;
(6)洗膜:用洗液I2×SSC-0.1%SDS于室温洗膜10min,再用洗液II0.2×SSC-0.1%SDS于室温洗膜10min;
(7)加酶:将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片转入新的杂交袋中,与1∶1000的链亲和素-碱性磷酸酶(SA-AP)于37℃水浴反应30min;
(8)洗膜:用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05%TritonX-100(pH7.5))于室温洗膜10min,用洗液IV(100M Tris-HCl-150mMNaCl-1mM MgCl2(pH9.5))于室温洗膜10min;
(9)显色:将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片转入新的杂交袋中,在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(简称BCIP)和硝基蓝四氮唑(简称NBT)底物中闭光显色10min。结果见图2。
(10)结果判定:如图2所示,根据探针杂交的蓝紫色信号强弱,可见M探针和a探针杂交阳性,其余探针杂交阴性,从而可判定该细菌属于分枝杆菌属,并可鉴定为结核分枝杆菌复合群;结核分枝杆菌rpoB 531位突变型探针No.1b的杂交信号远远强于野生型探针No.1,说明rpoB 531位密码子由TCG突变为TTG;而katG 315位野生型探针K1的杂交信号远远强于突变型探针K1b和K1c,说明katG 315位密码子未发生突变;embB306位野生型探针E1的杂交信号远远强于突变型探针E1b、E1c、E1d和E1e,说明embB306位密码子未发生突变;rpsL43位野生型探针S1的杂交信号远远强于突变型探针S1b,说明rpsL43位密码子未发生突变;rrs 513位碱基突变型探针rrs1b远远强于野生型探针rrs1和突变型探针rrs1c的杂交信号,说明rrs 513位碱基A突变为C。
对比例2
采用PCR-直接测序鉴定法鉴定来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.99-41。
1.样品处理及DNA提取:将来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.99-41灭活后,提取DNA;
2.结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下:
(1)根据现有技术合成下述结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物及下游引物:
靶基因 |
引物序列(5’→3’) |
片段大小(bp) |
rpoB |
上游引物5′-GGT GGT CGC CGC GAT CAA G-3’下游引物5′-CGA GCC GAT CAG ACC GAT GT-3’ |
240 |
katG |
上游引物5′-GCG GCG GTC GAC ATT 3′下游引物5′CTC GAG GAA ACT GTT GTC CC 3′ |
273 |
embB |
上游引物5′-CGC CTG GAC CAG TTG GAC 3′下游引物5′GAA CCA GCG GAA ATA GTT GGA C 3′ |
258 |
rpsL |
上游引物5′-GCA GCG TCG TGG TGT AT 3′下游引物5′CGC GGA TGA TCT TGT AGC 3′ |
215 |
rrs |
上游引物5′-GCC TTC GGG TTG TAA AC-3’下游引物5′-AGT TAA GCC GTG AGA TTT CA 3′ |
200 |
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释,使其浓度各为2.5μmol/L;
(2)取5倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L 的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及1U/μlTaq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用;浓度各为2.5μmol/L的结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和下游引物分别装入一无菌的塑料管中备用。
3.结核分枝杆菌耐药基因检测试剂的保存:将结核分枝杆菌耐药基因检测试剂保存于-20℃冰箱中,不要保存在无霜型冰箱的冷冻室,若保存得当,可保持活性一年。
4.PCR扩增:
①反应体系总体积各100μl。
②在5个0.5ml塑料离心管中分别加入下列试剂:
试剂I 加样顺序 体积(μl)
水 1 43.0
5×PCR缓冲液 2 20.0
2.5μmol/L rpoB上游引物 3 8.0
2.5μmol/L rpoB下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 95.0
试剂II 加样顺序 体积(μl)
水 1 43.0
5×PCR缓冲液 2 20.0
2.5μmol/L katG上游引物 3 8.0
2.5μmol/L katG下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 95.0
试剂III 加样顺序 体积(μl)
水 1 43.0
15×PCR缓冲液 2 20.0
2.5μmol/L embB上游引物 3 8.0
2.5μmol/L embB下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 95.0
试剂IV 加样顺序 体积(μl)
水 1 43.0
5×PCR缓冲液 2 20.0
2.5μmol/L rpsL上游引物 3 8.0
2.5μmol/L rpsL下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 95.0
试剂V 加样顺序 体积(μl)
水 1 43.0
5×PCR缓冲液 2 20.0
2.5μmol/L rrs上游引物 3 8.0
2.5μmol/L rrs下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 95.0
③混匀后,分别于95℃变性8min。
④稍冷却后,分别加Taq DNA聚合酶5μl(含5U),混匀,分别加液体石蜡40μl,以防扩增过程中水份蒸发,离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中,于94℃变性1分钟,58℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,循环35次。最后72℃延伸5分钟。
⑥分别取5μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳检测,结果分别可见一条240bp、273bp、258bp、215bp、200bp的片段。
5.直接测序鉴定法:分别将剩余的95μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR扩增产物和20μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因下游引物一起送上海生工生物技术有限公司进行DNA测序。
6.测序结果如图2-1至图2-5所示,用生物分析软件GENEDOC分析显示结核分枝杆菌临床分离株No.99-41的rpoB基因526位密码子(GAC)与结核分枝杆菌标准株rpoB基因526位密码子(CAC)不同,说明该分离株rpoB526位密码子发生点突变;embB基因306位密码子(GTG)与结核分枝杆菌标准株embB基因306位密码子(ATG)不同,说明该分离株embB306位密码子发生点突变;rpsL基因43位密码子(AGG)与结核分枝杆菌标准株rpsL基因43位密码子(AAG)不同,说明该分离株rpsL43位密码子发生点突变;katG和rrs基因序列与结核分枝杆菌标准株的完全相同,说明该分离株katG和rrs基因未发生突变,为野生型。
实施例2
一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
1.结核分枝杆菌耐药基因检测膜片的制备方法如下:
(1)根据现有技术合成下述寡核苷酸探针:
探针编号 |
密码子 |
序列(5’→3’) |
基因型 |
M |
16S rRNA |
5’-TATTAGACCCAGTTTCCC | |
MT |
16S rRNA |
5’-ACAAGACATGCATCCCGT-3’ | |
No.1 |
rpoB 531 |
5′-CC CAG CGC
CGA CAG TC-3’ |
野生型(TCG) |
No.1b |
rpoB 531 |
5′--A GCG C
CA ACA GTC GG-3’ |
突变型(TTG) |
No.1c |
rpoB 531 |
5′--CCA GCG C
CC ACA GTC-3’ |
突变型(TGG) |
No.1d |
rpoB 531 |
5′--CCA GCG C
GT ACA GTC G-3’ |
突变型(TAC) |
No.2 |
rpoB 526 |
5′-GCG CTT
GTG GGT CAA-3’ |
野生型(CAC) |
No.2b |
rpoB 526 |
5′-G GCG CTT
GTA GGT CAA C-3’ |
突变型(TAC) |
No.2c |
rpoB 526 |
5′-G GCG CTT
GTC GGT CA-3’ |
突变型(GAC) |
No.2d |
rpoB 526 |
5′-G GCG CTT
GCG GGT CAA C-3’ |
突变型(CGC) |
No.2e |
rpoB 526 |
5′-CG GCG CTT
GAG GGT CA-3’ |
突变型(CTC) |
No.3 |
rpoB 516 |
5′-GTT CTG
GTC CAT GAA-3’ |
野生型(GAC) |
No.3b |
rpoB 516 |
5′-TT GTT CTG
GCC CAT GA-3’ |
突变型(GGC) |
No.4 |
rpoB 533 |
5′-G CCC
CAG CGC CGA CAG-3’ |
野生型(CTG) |
No.4b |
rpoB 533 |
5′-G CCC
CGG CGC CGA CA-3’ |
突变型(CCG) |
No.5 |
rpoB 513 |
5′-C CAT GAA
TTG GCT CAG C-3’ |
野生型(CAA) |
No.5b |
rpoB 513 |
5′-T GAA
TTT GCT CAG CT-3’ |
突变型(AAA) |
No.6 |
rpoB 511 |
5′-A TTG GCT
CAG CTG GCT-3’ |
野生型(CTG) |
No.6b |
rpoB 511 |
5′-A TTG GCT
CGG CTG GCT-3’ |
突变型(CCG) |
K1 |
katG 315 |
5′-T GCC
GCT GGT GAT CGC-3’ |
野生型(AGC) |
K1b |
katG 315 |
5′-T GCC
GGT GGT GAT CGC-3’ |
突变型(ACC) |
K1c |
katG 315 |
5′-AT GCC
GTT GGT GAT CGC-3’ |
突变型(AAC) |
E1 |
embB306 |
5′-GC
CAT GCC CAG GAT GTA G-3’ |
野生型(ATG) |
E1b |
embB306 |
5′-GC
CAC GCC CAG GAT G-3’ |
突变型(GTG) |
E1c |
embB306 |
5′-GC
CAG GCC CAG GAT G-3’ |
突变型(CTG) |
E1d |
embB306 |
5′-GC
TAT GCC CAG GAT G-3’ |
突变型(ATA) |
E1e |
embB306 |
5′-GC
AAT GCC CAG GAT G-3’ |
突变型(ATT) |
S1 |
rpsL43 |
5′-CTT
CTT CGG AGT GGT-3’ |
野生型(AAG) |
S1b |
rpsL43 |
5′-TCGG CTT
CCT CGG AGT-3’ |
突变型(AGG) |
rrs1 |
rrs 513位碱基 |
5′-C CGC GGC
TGC TGG CAC-3’ |
野生型(A) |
rrs1b |
rrs 513位碱基 |
5′-C CGC GGC
GGC TGG CAC-3’ |
突变型(C) |
rrs1c |
rrs 513位碱基 |
5′-CGC GGC AGC TGG CAC-3’ |
突变型(T) |
所有的寡聚核苷酸探针在3’末端加有90个dT。
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA缓冲液稀释合成的寡核苷酸探针,使其浓度为4pmol/μl;
(3)20×SSC溶液的配制:氯化钠175.3g,柠檬酸钠88.2g,溶于800ml蒸馏水中,用10M氢氧化钠调pH至7.0,然后定容至1000ml,高压灭菌。取20×SSC溶液用蒸馏水稀释10倍成2×SSC溶液,将硝酸纤维膜浸入2×SSC溶液中预处理10min,置37℃温箱烘干;
(4)取0.6μl寡核苷酸探针点于预处理后的硝酸纤维膜上,60℃烘烤1小时,用水简单漂洗,晾干备用;
2.结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下:
(1)根据现有技术合成下述5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物:
靶基因 |
引物序列(5’→3’) |
片段大小(bp) |
16S RNA |
上游引物5′-bio-CGA GTG GCG AAC GGG TGA G--3′下游引物5′-TTG TGC AAT ATT CCC CAC TGC TG--3′ |
280 |
rpoB |
上游引物5′-bio-GGT GGT CGC CGC GAT CAA G-3’下游引物5′-CGA GCC GAT CAG ACC GAT GT-3’ |
240 |
katG |
上游引物5′-bio-GCG GCG GTC GAC ATT 3′下游引物5′CTC GAG GAA ACT GTT GTC CC 3′ |
273 |
embB |
上游引物5′-bio-CGC CTG GAC CAG TTG GAC 3′下游引物5′GAA CCA GCG GAA ATA GTT GGA C 3′ |
258 |
rpsL |
上游引物5′-bio-GCA GCG TCG TGG TGT AT 3′下游引物5′CGC GGA TGA TCT TGT AGC 3′ |
215 |
rrs |
上游引物5′-bio-GCC TTC GGG TTG TAA AC-3’下游引物5′-AGT TAA GCC GTG AGA TTT CA 3′ |
200 |
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释,使其浓度为2.5μmol/L;
(2)取5倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及1U/μlTaq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用;浓度各为2.5μmol/L的5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG基因的上游引物和不带标记的下游引物混合(简称混合引物I)装入一无菌的塑料管中备用;浓度各为2.5μmol/L的5’端带生物素标记的结核分枝杆菌embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物混合(简称混合引物II)装入一无菌的塑料管中备用。
3.结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的装配及保存:将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片密封后和结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂装入一纸盒容器,保存于-20℃冰箱中,不要保存在无霜型冰箱的冷冻室,若保存得当,可保持活性一年。
结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的应用:
(1)样品处理及DNA提取:将来自于解放军309医院的分枝杆菌临床分离株No.99-41灭活后,提取DNA;
(2)PCR扩增:
①反应体系总体积各100μl。
②在2个0.5ml塑料离心管中分别加入下列试剂:
试剂I 加样顺序 体积(μl)
水 1 51.0
5×PCR缓冲液 2 20.0
2.5μmol/L混合引物I 3 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 4 8.0
和dTTP
DNA样品 5 8.0
总计 95.0
试剂II 加样顺序 体积(μl)
水 1 51.0
5×PCR缓冲液 2 20.0
2.5μmol/L混合引物II 3 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 4 8.0
和dTTP
DNA样品 5 8.0
总计 95.0
③混匀后,分别于95℃变性8min。
④稍冷却后,分别加Taq DNA聚合酶5μl(含5U),混匀,分别加液体石蜡40μl,以防扩增过程中水份蒸发,离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中,于94℃变性1分钟,58℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,循环35次。最后72℃延伸5分钟。
分别取5μl试剂I和试剂II的PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳检测,结果分别可见二条240bp和273-280bp以及二条258bp、215-200bp的片段。
(3)预杂交液配制:6×SSC溶液,5×Denharts溶液,0.1mg/ml小牛胸腺DNA,0.5十二烷基硫酸钠(简称SDS)溶液。
50×Denharts溶液 10ml
20×SSC溶液 30ml
10SDS溶液 5ml
10mg/ml小牛胸腺DNA 1ml
加水定容至 100ml
(4)预杂交:将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片和4ml预杂交液装入杂交袋中,于37℃水浴孵育30min;
(5)杂交:将试剂I和试剂II的PCR扩增产物40μl分别置98℃变性10min,置冰浴中冷却5min后,加入杂交袋中,于37℃水浴孵育30min;
(6)洗膜:用洗液I2×SSC-0.1%SDS于室温洗膜10min,再用洗液II0.2×SSC-0.1%SDS于室温洗膜10min;
(7)加酶:将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片转入新的杂交袋中,与1∶1000的链亲和素-碱性磷酸酶(SA-AP)于37℃水浴反应30min;
(8)洗膜:用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05%TritonX-100(pH7.5))于室温洗膜10min,用洗液IV(100M Tris-HCl-150mMNaCl-1mM MgCl2(pH9.5))于室温洗膜10min;
(9)显色:将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片转入新的杂交袋中,在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(简称BCIP)和硝基蓝四氮唑(简称NBT)底物中闭光显色10min。结果见图4。
(10)如图4所示,为应用本发明耐药基因检测膜片测定来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.99-41的结果。根据探针杂交的蓝紫色信号强弱,可见M探针和a探针杂交阳性,其余探针杂交阴性,从而可判定该细菌属于分枝杆菌属,并可鉴定为结核分枝杆菌复合群;结核分枝杆菌rpoB 526位突变型探针No.2c的杂交信号远远强于野生型探针No.2,说明rpoB 526位密码子由CAC突变为GAC;而katG 315位野生型探针K1的杂交信号远远强于突变型探针K1b和K1c,说明katG 315位密码子未发生突变;embB306位突变型探针E1b的杂交信号远远强于野生型探针E1,说明embB306位密码子由ATG突变为GTG;rpsL43位突变型探针S1b的杂交信号远远强于野生型探针S1,说明rpsL43位密码子由AAG突变为AGG;rrs 513位碱基野生型探针rrs1的杂交信号远远强于突变型探针rrs1b和rrs1c,说明rrs 513位碱基未发生突变。
对比例3
采用PCR-直接测序鉴定法鉴定来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.816。
1.样品处理及DNA提取:将来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.816灭活后,提取DNA;
2.结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下:
(1)根据现有技术合成下述结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物及下游引物:
靶基因 |
引物序列(5’→3’) |
片段大小(bp) |
rpoB |
上游引物5′-GGT GGT CGC CGC GAT CAA G-3’下游引物5′-CGA GCC GAT CAG ACC GAT GT-3’ |
240 |
katG |
上游引物5′-GCG GCG GTC GAC ATT 3′下游引物5′CTC GAG GAA ACT GTT GTC CC 3′ |
273 |
embB |
上游引物5′-CGC CTG GAC CAG TTG GAC 3′下游引物5′GAA CCA GCG GAA ATA GTT GGA C 3′ |
258 |
rpsL |
上游引物5′-GCA GCG TCG TGG TGT AT 3′下游引物5′CGC GGA TGA TCT TGT AGC 3′ |
215 |
rrs |
上游引物5′-GCC TTC GGG TTG TAA AC-3’下游引物5′-AGT TAA GCC GTG AGA TTT CA 3′ |
200 |
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释,使其浓度为12.5μmol/L;
(2)取10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及10U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用;浓度各为12.5μmol/L的结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和下游引物分别装入一无菌的塑料管中备用。
3.结核分枝杆菌耐药基因检测试剂的保存:将结核分枝杆菌耐药基因检测试剂保存于-20℃冰箱中,不要保存在无霜型冰箱的冷冻室,若保存得当,可保持活性一年。
4.PCR扩增:
①反应体系总体积各100μl。
②在5个0.5ml塑料离心管中分别加入下列试剂:
试剂I 加样顺序 体积(μl)
水 1 57.5
10×PCR缓冲液 2 10.0
12.5μmol/L rpoB上游引物 3 8.0
12.5μmol/L rpoB下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 99.5
试剂II 加样顺序 体积(μl)
水 1 57.5
10×PCR缓冲液 2 10.0
12.5μmol/L katG上游引物 3 8.0
12.5μmol/L katG下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 99.5
试剂III 加样顺序 体积(μl)
水 1 57.5
10×PCR缓冲液 2 10.0
12.5μmol/L embB上游引物 3 8.0
12.5μmol/L embB下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 99.5
试剂IV 加样顺序 体积(μl)
水 1 57.5
10×PCR缓冲液 2 10.0
12.5μmol/L rpsL上游引物 3 8.0
12.5μmol/L rpsL下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 99.5
试剂V 加样顺序 体积(μl)
水 1 57.5
10×PCR缓冲液 2 10.0
12.5μmol/L rrs上游引物 3 8.0
12.5μmol/L rrs下游引物 4 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0
和dTTP
DNA样品 6 8.0
总计 99.5
③混匀后,分别于95℃变性8min。
④稍冷却后,分别加Taq DNA聚合酶0.5μl(含5U),混匀,分别加液体石蜡40μl,以防扩增过程中水份蒸发,离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中,于94℃变性1分钟,58℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,循环35次。最后72℃延伸5分钟。
⑥分别取5μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳检测,结果分别可见一条240bp、273bp、258bp、215bp、200bp的片段。
5.直接测序鉴定法:分别将剩余的95μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR扩增产物和20μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因下游引物一起送上海生工生物技术有限公司进行DNA测序。
6.测序结果如图5-1至图5-10所示,用生物分析软件GENEDOC分析显示结核分枝杆菌临床分离株No.816的rpoB基因序列与结核分枝杆菌标准株的完全相同,说明该分离株rpoB基因未发生突变,为野生型;katG 315位密码子(ACC)与结核分枝杆菌标准株315位密码子(AGC)不同,说明该分离株katG 315位密码子发生点突变;embB基因306位密码子(ATA)与结核分枝杆菌标准株embB基因306位密码子(ATG)不同,说明该分离株embB306位密码子发生点突变;rrs基因513位碱基(T)与结核分枝杆菌标准株rrs基因513位碱基(A)不同,说明该分离株rrs基因513位密码子发生点突变;rpsL序列与结核分枝杆菌标准株的完全相同,说明该分离株rpsL基因未发生突变,为野生型。
实施例3
一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
1.结核分枝杆菌耐药基因检测膜片的制备方法如下:
(1)根据现有技术合成下述寡核苷酸探针:
探针编号 |
密码子 |
序列(5’→3’) |
基因型 |
M |
16S rRNA |
5’-TATTAGACCCAGTTTCCC | |
MT |
16S rRNA |
5’-ACAAGACATGCATCCCGT-3’ | |
No.1 |
rpoB 531 |
5′-CC CAG CGC
CGA CAG TC-3’ |
野生型(TCG) |
No.1b |
rpoB 531 |
5′--A GCG C
CA ACA GTC GG-3’ |
突变型(TTG) |
No.1c |
rpoB 531 |
5′--CCA GCG C
CC ACA GTC-3’ |
突变型(TGG) |
No.1d |
rpoB 531 |
5′--CCA GCG C
GT ACA GTC G-3’ |
突变型(TAC) |
No.2 |
rpoB 526 |
5′-GCG CTT
GTG GGT CAA-3’ |
野生型(CAC) |
No.2b |
rpoB 526 |
5′-G GCG CTT
GTA GGT CAA C-3’ |
突变型(TAC) |
No.2c |
rpoB 526 |
5′-G GCG CTT
GTC GGT CA-3’ |
突变型(GAC) |
No.2d |
rpoB 526 |
5′-G GCG CTT
GCG GGT CAA C-3’ |
突变型(CGC) |
No.2e |
rpoB 526 |
5′-CG GCG CTT
GAG GGT CA-3’ |
突变型(CTC) |
No.3 |
rpoB 516 |
5′-GTT CTG
GTC CAT GAA-3’ |
野生型(GAC) |
No.3b |
rpoB 516 |
5′-TT GTT CTG
GCC CAT GA-3’ |
突变型(GGC) |
No.4 |
rpoB 533 |
5′-G CCC
CAG CGC CGA CAG-3’ |
野生型(CTG) |
No.4b |
rpoB 533 |
5′-G CCC
CGG CGC CGA CA-3’ |
突变型(CCG) |
No.5 |
rpoB 513 |
5′-C CAT GAA
TTG GCT CAG C-3’ |
野生型(CAA) |
No.5b |
rpoB 513 |
5′-T GAA
TTT GCT CAG CT-3’ |
突变型(AAA) |
No.6 |
rpoB 511 |
5′-A TTG GCT
CAG CTG GCT-3’ |
野生型(CTG) |
No.6b |
rpoB 511 |
5′-A TTG GCT
CGG CTG GCT-3’ |
突变型(CCG) |
K1 |
katG 315 |
5′-T GCC
GCT GGT GAT CGC-3’ |
野生型(AGC) |
K1b |
katG 315 |
5′-T GCC
GGT GGT GAT CGC-3’ |
突变型(ACC) |
K1c |
katG 315 |
5′-AT GCC
GTT GGT GAT CGC-3’ |
突变型(AAC) |
E1 |
embB306 |
5′-GC
CAT GCC CAG GAT GTA G-3’ |
野生型(ATG) |
E1b |
embB306 |
5′-GC
CAC GCC CAG GAT G-3’ |
突变型(GTG) |
E1c |
embB306 |
5′-GC
CAG GCC CAG GAT G-3’ |
突变型(CTG) |
E1d |
embB306 |
5′-GC
TAT GCC CAG GAT G-3’ |
突变型(ATA) |
E1e |
embB306 |
5′-GC
AAT GCC CAG GAT G-3’ |
突变型(ATT) |
S1 |
rpsL43 |
5′-CTT
CTT CGG AGT GGT-3’ |
野生型(AAG) |
S1b |
rpsL43 |
5′-TCGG CTT
CCT CGG AGT-3’ |
突变型(AGG) |
rrs1 |
rrs 513位碱基 |
5′-C CGC GGC
TGC TGG CAC-3’ |
野生型(A) |
rrs1b |
rrs 513位碱基 |
5′-C CGC GGC
GGC TGG CAC-3’ |
突变型(C) |
rrs1c |
rrs 513位碱基 |
5′-CGC GGC AGC TGG CAC-3’ |
突变型(T) |
所有的寡聚核苷酸探针在3’末端加有80个dT。
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA缓冲液稀释合成的寡核苷酸探针,使其浓度为2pmol/μl;
(3)20×SSC溶液的配制:氯化钠175.3g,柠檬酸钠88.2g,溶于800ml蒸馏水中,用10M氢氧化钠调pH至7.0,然后定容至1000ml,高压灭菌。取20×SSC溶液用蒸馏水稀释10倍成2×SSC溶液,将硝酸纤维膜浸入2×SSC溶液中预处理10min,置37℃温箱烘干;
(4)取1μl寡核苷酸探针点于预处理后的硝酸纤维膜上,在紫外灯下照射20分钟,用水简单漂洗,晾干备用;
2.结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下:
(1)根据现有技术合成下述5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物:
靶基因 |
引物序列(5’→3’) |
片段大小(bp) |
16S RNA |
上游引物5′-bio-CGA GTG GCG AAC GGG TGA G--3′下游引物5′-TTG TGC AAT ATT CCC CAC TGC TG--3′ |
280 |
rpoB |
上游引物5′-bio-GGT GGT CGC CGC GAT CAA G-3’下游引物5′-CGA GCC GAT CAG ACC GAT GT-3’ |
240 |
katG |
上游引物5′-bio-GCG GCG GTC GAC ATT 3′下游引物5′CTC GAG GAA ACT GTT GTC CC 3′ |
273 |
embB |
上游引物5′-bio-CGC CTG GAC CAG TTG GAC 3′下游引物5′GAA CCA GCG GAA ATA GTT GGA C 3′ |
258 |
rpsL |
上游引物5′-bio-GCA GCG TCG TGG TGT AT 3′下游引物5′CGC GGA TGA TCT TGT AGC 3′ |
215 |
rrs |
上游引物5′-bio-GCC TTC GGG TTG TAA AC-3’下游引物5′-AGT TAA GCC GTG AGA TTT CA 3′ |
200 |
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释,使其浓度为12.5μmol/L;
(2)取10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及10U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用;浓度各为12.5μmol/L的5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG基因的上游引物和不带标记的下游引物混合(简称混合引物I)装入一无菌的塑料管中备用;浓度各为12.5μmol/L的5’端带生物素标记的结核分枝杆菌embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物混合(简称混合引物II)装入一无菌的塑料管中备用。
3.结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的装配及保存:将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片密封后和结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂装入一容器,保存于-20℃冰箱中,不要保存在无霜型冰箱的冷冻室,若保存得当,可保持活性一年。
结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的应用:
(1)样品处理及DNA提取:将来自于解放军309医院的分枝杆菌临床分离株No.816灭活后,提取DNA;
(2)PCR扩增:
①反应体系总体积各100μl。
②在2个0.5ml塑料离心管中分别加入下列试剂:
试剂I 加样顺序 体积(μl)
水 1 65.5
10×PCR缓冲液 2 10.0
12.5μmol/L混合引物I 3 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 4 8.0
和dTTP
DNA样品 5 8.0
总计 99.5
试剂II 加样顺序 体积(μl)
水 1 65.5
10×PCR缓冲液 2 10.0
12.5μmol/L混合引物II 3 8.0
2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 4 8.0
和dTTP
DNA样品 5 8.0
总计 99.5
③混匀后,分别于95℃变性8min。
④稍冷却后,分别加Taq DNA聚合酶0.5μl(含5U),混匀,分别加液体石蜡40μl,以防扩增过程中水份蒸发,离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中,于94℃变性1分钟,58℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,循环35次。最后72℃延伸5分钟。
分别取5μl试剂I和试剂II的PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳检测,结果分别可见二条240bp和273-280bp以及二条258bp、215-200bp的片段。
(3)预杂交液配制:6×SSC溶液,5×Denharts溶液,0.1mg/ml小牛胸腺DNA,0.5十二烷基硫酸钠(简称SDS)溶液。
50×Denharts溶液 10ml
20×SSC溶液 30ml
10SDS溶液 5ml
10mg/ml小牛胸腺DNA 1ml
加水定容至 100ml
(4)预杂交:将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片和4ml预杂交液装入杂交袋中,于37℃水浴孵育30min;
(5)杂交:将试剂I和试剂II的PCR扩增产物40μl分别置98℃变性10min,置冰浴中冷却5min后,加入杂交袋中,于37℃水浴孵育30min;
(6)洗膜:用洗液I2×SSC-0.1%SDS于室温洗膜10min,再用洗液II0.2×SSC-0.1%SDS于室温洗膜10min;
(7)加酶:将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片转入新的杂交袋中,与1∶1000的链亲和素-碱性磷酸酶(SA-AP)于37℃水浴反应30min;
(8)洗膜:用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05%TritonX-100(pH7.5))于室温洗膜10min,用洗液IV(100M Tris-HCl-150mMNaCl-1mM MgCl2(pH9.5))于室温洗膜10min;
(9)显色:将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片转入新的杂交袋中,在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(简称BCIP)和硝基蓝四氮唑(简称NBT)底物中闭光显色10min。结果见图6。
(10)结果判定:如图6所示,根据探针杂交的蓝紫色信号强弱,可见M探针和a探针杂交阳性,其余探针杂交阴性,从而可判定该细菌属于分枝杆菌属,并可鉴定为结核分枝杆菌复合群;结核分枝杆菌rpoB 531、526、516、533、513、511位野生型探针No.1、2、3、4、5、6的杂交信号远远强于突变型探针No.1b、No.1c No.1d、No.2b、No.2c、No.2d、No.2e、No.3b、No.4b、No.5b、No.6b,说明rpoB基因未发生突变;katG 315位突变型探针K1b的杂交信号远远强于野生型探针K1和突变型探针K1c,说明katG 315位密码子由AGC突变为ACC;embB306位突变型探针E1d的杂交信号远远强于野生型探针E1,说明embB306位密码子由ATG突变为ATA;rrs 513位碱基突变型探针rrs1c远远强于野生型探针rrs1和突变型探针rrs1b的杂交信号,说明rrs 513位碱基A突变为T;rpsL43位密码子野生型探针S1的杂交信号远远强于突变型探针S1b,说明rpsL43位密码子未发生突变。