CN1153969C - 结核分支杆菌耐药性检测芯片及其制作方法和应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及结核分支杆菌耐药性检测芯片及其制作方法和应用方法，主要是根据已知的结核分支杆菌耐利福平、异烟肼等的基因突变信息，设计相应的结核分支杆菌耐药性寡核苷酸探针，然后将合成的探针固定在经修饰的玻片上，从而构成结核分支杆菌耐药性检测芯片，利用设计的相应引物将结核分支杆菌DNA样品扩增并加入荧光标记处理以后，与芯片杂交，然后用芯片信号分析系统扫描芯片，并对杂交信号进行分析，获得有关结核分支杆菌的耐药性信息。
Description
技术领域
本发明涉及对结核分支杆菌耐药性快速检测的方法，特别是一种有关结核分支杆菌耐药性检测芯片及其制作方法和应用方法。
背景技术
DNA芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一，它是物理学、化学、微电子学、精密机械与生命科学交叉综合的高科技。DNA芯片集成的不是电子元器件，而是利用或借助微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，将大量具有生物学意义的特定序列的DNA片段有序地固化在基片上；或者利用微电子机械系统技术(MEMS)和集成光学等将生命科学研究或医学诊断过程中所涉及的许多不连续过程，例如样品制备、样品处理、扩增反应、分析检测等过程有机地集成起来。利用DNA芯片可以快速、高效地获取或处理大量的生命信息(包括基因的设别、基因突变检测、基因表达谱检测和对外来分子的识别等)，它对生命科学研究、医学诊断、新药筛选和司法鉴定等具有革命性的推动作用。
由结核分支杆菌(TB)引起的结核病是现今世界上最普遍的人类传染病之一。全世界现有结核病人约2000万，每年新发病人800-1000万，全球每年死亡300万人，达到历史最高水平，结核病成为传染病的头号死亡杀手。我国的结核病流行一直十分严重，多年来疫情下降缓慢，有些地区还有所回升。我国现有结核病人约600多万，每年还至少有113万新生结核病例发生。每年因结核病死亡人数高达25万，且75％的结核病例发生在15-50岁的青壮年当中，因此，严重影响了我国国民经济和人口素质的发展。此外，由于人类免疫缺陷病毒(HIV)流行日趋严重，HIV感染者中有三分之一同时感染结核病，如果结核病不能得到有效控制，结核病与HIV的双重感染必将对我国的结核病控制带来灾难性影响。
耐多药结核病(MDR-TB)是结核病中最为严重的一种，由于其对多种抗结核分支杆菌药物耐药，治疗极为困难。近年来，美国连续发生了12起MDR-TB的爆发流行，引起了世界的普遍关注。据世界卫生组织估计，全球已有5000万人受到耐多药结核分支杆菌的感染，至少三分之二以上的结核病人有发生MDR-TB的危险。该病传播快，病情发展迅速，从诊断到死亡平均4-6周，死亡率高达37％。在合并HIV感染者中，死亡率更高达72％-89％，大有重新成为不治之症的危险。
现行治疗结核病的一线药物为利福平(RFP)和异烟肼(INH)，其特点是疗效好，见效快，且毒副性小，临床上只要同时耐利福平和异烟肼即被诊断为耐多药性结核病。
RFP的耐药机制比较简单、明确，仅与rpoB基因(细菌RNA聚合酶β亚基的编码基因)的变化有关(Lincoln P.M.，etal. Antimicrob. Agents.Chemother.，1994：38(4)：805-811)。现有的统计结果表明，rpoB基因突变与结核分支杆菌耐药相关性可达96％以上，没有发现地域性差异。这些突变主要发生在rpoB基因81个碱基的核心区域—利福平耐药决定区(RRDR)，包括点突变、短的插入或缺失突变等共40多种(Telenti A.，etal.，Lancet，1993：341：647-670)。这些突变致使利福平不能与RNA聚合酶β亚基结合，从而使细菌产生对利福平的耐受性。其中43％的菌株发生了513-Ser的错义突变，36％的菌株发生了526-His的错义突变，7.3％的菌株发生了516-Asp的错义突变。也就是说，理论上讲只要将该基因这三个位点的所有错义突变制作在芯片上，我们就可以检测到86.3％的RFP耐药性菌株。其它较为常见的突变包括513，514，521，532，533密码子。LiPA(线性探针试验法，Robert C.C.，etal.，J.Clin.Microbiol.，1997；35(5)：1281-83)是一种已经商业化的试剂盒，1993年就已经应用于临床，其原理与DNA芯片相似，也是利用Southern杂交的方法进行RFP耐药性的检测，然而探针仅包括His-526Tyr，Ser-513Leu，Leu-533Pro。
与利福平相比，异烟肼耐药性机制要复杂的多，逐渐成为结核分支杆菌耐药性研究的热点。最近研究发现，结核杆菌的异烟肼耐药性与katG(过氧化氢—过氧化物酶)基因，inhA(酰基转运蛋白还原酶)基因和ahpC(烷基氢过氧化氢还原酶)基因的启动子区域，以及kasA(β-酮醛转运蛋白合成酶)基因发生改变有关。酰基转运蛋白还原酶(inhA)和β-酮醛转运蛋白合成酶(kasA)参与结核分支杆菌分支菌酸合成途径，异烟肼在过氧化氢—过氧化物酶(katG)催化作用下转变成活性构象，该构象作用于inhA或kasA，以致阻断了结核杆菌分支菌酸的合成，从而杀死细菌。烷基氢过氧化物还原酶(ahpC)的生理作用与katG相似，ahpC启动子区域发生突变，导致ahpC的高表达，是结核分支杆菌自身在katG基因缺失，或katG完全或大部分丧失活性时的一种代偿性生理反应。与利福平不同，异烟肼耐药性的地域性差异较大，在我国，现有的报道认为，katG与异烟肼耐药的相关性可达50％-70％左右，协同对inhA和ahpC的检测可以解释90％以上的异烟肼耐药性。
传统的检测药物敏感性的方法是以培养为基础的绝对浓度法或比例法，方法较可靠，无需特殊仪器，但最大弱点是费时间，一般从病人就诊到得到药敏结果需要2-3个月。在此期间，医生只能一般规律用药，而这些药物对病人可能无效，以致延误治疗。近年来应用于临床的Bactec法(黄海荣等，中华结核和呼吸杂志，2000，Vol23(11))可将耐药检测提前到2-4周，但仍不能满足临床需要，而且涉及到同位素的应用和处理等诸多不便；DNA序列分析法一般采用双脱氧末端终止法，其结果直观，排除了人为因素造成的实验结果的不可靠性，具有结果客观的优点，并可在一天内获得结果，但价格相当昂贵，临床无法接受；分子灯塔法(Piatek A.S.，etal.，Nat.Biotech.，1998；16：359-363)简单、易于操作，可以及时得到结果，所需样本量较小，可以对临床标本如痰、胸水、渗出物直接检测，对指导临床用药非常有意义，但反应是在液体环境中进行，一次反应所能检测的探针量有限；RNA/RNA碱基错记法对ropB基因突变的检出率是100％，但无法确定突变的确切类型及部位，也不能对多个基因同时进行操作，且对RNA进行操作难度比较高，难以进行临床应用；LiPA是一种商业化的试剂盒，用于测定结核杆菌耐利福平的情况，是生物芯片的雏形，由于探针固定在膜片上，涉及有限的突变位点，只能对rpoB基因进行粗筛，对低突变率位点的检测无能为力，因此也难以在临床上推广。
发明内容
本发明的构思是为了克服上述已有技术的不足，利用DNA芯片的方法，将已经合成的寡核苷酸探针点阵并固定于载玻片表面，通过待测样本的DNA或RNA与芯片杂交，即可获取大量与结核分支杆菌耐药性相关的基因突变信息，从而确定其耐药性。
本发明目的是提供一种结核分支杆菌耐药性检测芯片及其制作方法和应用方法，以实现对结核分支杆菌耐药性特别是对利福平、异烟肼等耐药性的低成本、高灵敏、特异、快速的检测。
本发明的目的是这样实现的：一种结核分子杆菌耐药性检测芯片，在一经修饰的载玻片上，固定有一系列寡核苷酸点阵探针，其特征在于
(1)所说的探针是针对rpoB基因、KatG基因、inhA基因、KasA基因、ahpC基因等的突变而设计的；
(2)每一探针长度至少为10个碱基，并且各个探针长度相同；
(3)突变点尽可能位于探针中间；
所说的探针主要针对rpoB基因的496、505、507、509、510、511、512、513、514、515、516，518、520、521、522、523、524、526、528、531、533、541、553、569、579、583等密码子的突变，katG基因的1、20、63、99、108、122-125、138、140、142、160、172、180、262、275、295、300、302、304、315、328、335、336、350、463、477、501、515、567、587、593、629、710等密码子的突变，inhA基因的16、21、47、78、94、95、194等密码子的突变，kasA基因的66、121、269、312、387、413等密码子的突变和ahpC基因的2、3、73、191、-46、-44、-39、-34、-32、-12、-10、-6、-4、4、33等密码子的突变；
所说的探针主要是针对rpoB基因的533、532、531、526、516、514、513、511等密码子的突变；
针对rpoB基因的533、532、531、526、516、514、513、511等密码子的突变而设计的探针如下表所示：
| 探针号 | 序列 | 基因型 | (G-C)％ |
| 1a1b2a2b3a3b3c3d3e4a4b4c4d4e4f4g5a5b5c6a6b6c7a7b7c8a8b8c | 5′CTG TCG GCG CTG GGG CCC GG3′5′CTG TCG GCG CcG GGG CCC GG3′5′CGA CTG TCG GCG CTG GGG CC3′5′CGA CTG TCG GtG CTG GGG CC3′5′CGA CTG TCG GCG CTG GGG CC3′5′GC CGA CTG TtG GCG CTG GGG3′5′GC CGA CTG TgG GCG CTG GGG3′5′GC CGA CTG Ttc GCG CTG GGG3′5′GC CGA CTG Tac GCG CTG GGG3′5′GGG TTG ACC CAC AAG CGC CG3′5′GGG TTG ACC tAC AAG CGC CG3′5′GGG TTG ACC CtC AAG CGC CG3′5′GGG TTG ACC CgC AAG CGC CG3′5′GGG TTG ACC gcC AAG CGC CG3′5′GGG TTG ACC aAC AAG CGC CG3′5′GGG TTG ACC gAC AAG CGC CG3′5′AA TTC ATG GAC CAG AAC AAC3′5′AA TTC ATG GtC CAG AAC AAC3′5′AA TTC ATG tAC CAG AAC AAC3′5′CTG AGC CAA TTC ATG GAC CA3′5′TG AGC CAA ttc TCC ATG GAC3′5′CTG AGC CAA gTC ATG GAC CA3′5′CAG CTG AGC CAA TTC ATG GA3′5′CAG CTG AGC CcA TTC ATG GA3′5′CAG CTG AGC aAA TTC ATG GA3′5′CC AGC CAG CTG AGC CAA TTC3′5′CC AGC CAG CcG AGC CAA TTC3′5′CC AGC CAG CgG AGC CAA TTC3′ | WtMtWtMtWtMtMtMtMtWtMtMtMtMtMtMtWtMtMtWtMtMtWtMtMtWtMtMt | 85％90％80％75％80％75％80％75％75％70％65％70％75％75％65％70％40％40％35％50％50％55％50％55％45％60％65％65％ |
探针长度相同为20mer，其中Mt、Wt分别表示突变型和野生型；
上述结核分支杆菌耐药性检测芯片的制作方法包括如下步骤：
(1)根据所设计的寡核苷酸探针进行探针的合成；
(2)用去离子水将合成的探针稀释，并与点样溶液(spoting solution)等体积混合，使终浓度为75pmol/μl；
(3)载玻片表面用醛基修饰；
(4)利用Cartesian公司的微阵列芯片制作系统将探针点阵在用醛基修饰的载玻片表面；
(5)置于相对湿度70％，室温条件下经48-72小时进行固定；
(6)室温下将玻片浸入0.2％SDS中振荡数分钟，再浸入纯水中振荡数分钟，再浸入0.2％SDS中三次，每次1分钟，再浸入100℃纯水中2秒，然后挥发干，备用；
所说寡核苷酸探针的5′末端需加一定长度(8-20聚)的连接臂(PolyT)，该连接臂的5′末端需加氨基修饰；
上述结核分支杆菌闹药性检测芯片的应用方法包括以下步骤：
(1)样品处理，取病人痰液少量，用结核杆菌PCR杂交诊断试剂盒提取DNA；
(2)荧光标记：
获得待测样品的DNA以后，需进行荧光标记处理：
(1)取制备好的DNA样品5μl与20μl PCR扩增体系混合，(扩增体系包括2.5μl PCR反应缓冲液，5nmols dATP，5nmols dGTP，5nmols dCTP，2nmols dTTP，1nmol Cy5-dUTP，各15pmols的上游及下游引物，1.25U pfuDNA聚合酶)通过以下热循环过程制备荧光标记的DNA样品目的片断：首先94℃，5mins，以94℃，40s，58℃，1min，72℃，1min循环30次，最后，72℃延伸5mins；
(2)取荧光标记的目的DNA样品10μl，用Dnase I(核酸酶I)消化为200bp左右的DNA片段；
(3)芯片杂交
(4)检测和信号分析，最后用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描并分析结果；
所说的芯片杂交就是：
取标记并打断的目的DNA片断5μl，99℃变性5mins，然后与20μl EasyHyb杂交液(罗氏公司)混匀，取10μl滴于芯片表面，盖上盖玻片，置于60℃湿盒中杂交30mins，然后置45℃洗液中荡洗10mins，凉干。
所说的上游和下游引物如下：
| 基因 | 引物序列 | Tm | 产物长度(bp) | |
| RpoB | 5’-AGG ACG TGG AGG CGA TCA CA-3’ | 63.3 | 350 | |
| 5’-GGG TTG ACC CGC GCG TA-3’ | 63.1 | |||
| KatG | 5’-CC GGC TTC CTG TTG GAC GAC-3’ | 64.9 | 2447 | |
| 5’-CGG CGC GAT TTG TCA GAC C-3’ | 64.5 | |||
| InhA | 启动子 | 5’-CT CGC TGC CCA GAA AGG GA-3’ | 63.3 | 248 |
| 5’-CCC CGG TTT CCT CCG GT-3’ | 62.4 | |||
| 结构 | 5’-TT CAT GAC AGG ACT GCT GGA CG-3’ | 63.2 | ||
| 5’-CT AGA GCA ATT GGG TGT GCG C-3’ | 63.1 | |||
| KasA | 5’-ATT GAG TCG GAC AAC CCC GA-3’ | 62.3 | 1389 | |
| 5’-CCT TCC ATA TCG GTC CGA CTC-3’ | 61.9 | |||
| AhpC | 启动子 | 5’-CCG ATG AGA GCG GTG AGC TG-3’ | 63.8 | 236 |
| 5’-C ACT GCT TTG CCG CCA CC-3’ | 62.9 | |||
| 结构 | 5’-CTT GCG GCA CTG CTG AAC C-3’ | 62.3 | ||
| 5’-GCT GCT GCG GGT GAT TGA G-3’ | 62.2 | |||
本发明的优点和效果：
a.本发明的结核分支杆菌耐药性检测芯片所用的探针设计方法简单、易行；
b.本发明的结核分支杆菌耐药性检测芯片具有检测灵敏度高，可以分辨单个碱基的差别；
c.本发明的结核分支杆菌耐药性检测芯片可以检测与利福平、异烟肼等相关的耐药位点的基因突变信息，覆盖率高；
附图说明
图1是本发明包括32种探针的结核分支杆菌耐药性检测芯片用于检测实际样品的结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。
实施例一 根据结核分支杆菌基因组DNA序列的新设计的芯片探针，如表1所示：
表1 根据结核分支杆菌基因组DNA序列所设计的探针
| 基因 | 密码子 | 探针序列 | 基因型 |
| rpoB | 496 | tc aac atc cgg ccg gtg gtc | wt |
| tc aac atc cga ccg gtg gtc | mt | ||
| 505 | tc aag gag ttc ttc ggc acc | wt | |
| tc aag gag ttg ttc ggc acc | mt | ||
| 507 | ag ttc ttc ggc acc agc cag | wt | |
| ag ttc ttc gac acc agc cag | mt | ||
| 509 | tc ggc acc agc cag ctg agc | wt | |
| tc ggc acc ttc cag ctg agc | mt | ||
| 510 | gc acc agc cag ctg agc caa | wt | |
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| 511 | cc agc cag ctg agc caa ttc | wt | |
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| 526 | ggg ttg acc cac aag cgc cg | wt | |
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| 531 | cga ctg tcg gcg ctg ggg cc | wt | |
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| 553 | tg cac ccg tcg cac tac ggc | wt | |
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| 579 | cg gtg tac gcg cgg gtc aac | wt | |
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| 20 | gc aac ggc tgt ccc gtc gtg | wt | |
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| 63 | gcg gcg ttc gac tat gcc gc | wt | |
| gcg gcg ttc cac tat gcc gc | mt | ||
| 99 | ggc cac tac ggg ccg ctg tt | wt | |
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| 122-125 | c ggc gcc ggg ggc ggc atg c | wt | |
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| 138 | tgg ccc gac aac gcc agc tt | wt | |
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| 142 | gcc agc ttg gac aag gcg cg | wt |
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| 172 | ggc aac tgc gcg ctg gaa tc | wt | |
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| 180 | ggc ttc aag acg ttc ggg tt | wt | |
| ggc ttc aag aag ttc ggg tt | mt | ||
| 262 | gac gtc gaa aca gcg gcg ct | wt | |
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| 275 | ttc ggt aag acc cat ggc gcc | wt | |
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| ggc ttg ggc tag aag agc tc | mt | ||
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| 302 | ggc tgg aag agc tcg tat gg | wt | |
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| 304 | aag agc tcg tat ggc acc gg | wt | |
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| 315 | cg atc acc agc ggt atc gag | wt | |
| cg atc acc aac ggt atc gag | mt | ||
| cg atc acc aca ggt atc gag | mt | ||
| cg atc acc aac ggt atc gag | mt | ||
| 328 | ccg acg aaa tgg ggc aac ag | wt | |
| ccg acg aaa ggg ggc aac ag | mt | ||
| 335 | ttc ctc gag atc ctg tac gg | wt | |
| ttc ctc gag acc ctg tac gg | mt | ||
| 336 | ctc gag atc ctg tac ggc ta | wt | |
| ctc gag atc cgg tac ggc ta | mt | ||
| 350 | cct gct ggc gct tgg caa ta | wt | |
| cct gct ggc tct tgg caa ta | mt | ||
| 463 | agc cag atc cgg gca tcg gg | wt | |
| agc cag atc ctg gca tcg gg | mt | ||
| 477 | cg acc gca tgg gcg gcg gcg | wt | |
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| 501 | cga ctgcag cca caa gtc gg | wt |
| cga ctgcag gca caa gtc gg | mt | ||
| 515 | ggg gat ctg cgc aag gtc at | wt | |
| ggg gat ctg tgc aag gtc at | mt | ||
| 567 | acg gtg ccc ttc acc ccg gg | wt | |
| acg gtg ccc tcc acc ccg gg | mt | ||
| 587 | ttt gcc gtg ctg gag ccc aa | wt | |
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| 593 | aag gca gat ggc ttc cga aa | wt | |
| aag gca gat gac ttc cga aa | mt | ||
| 629 | gtg ctg gta ggt ggc ctg cg | wt | |
| gtg ctg gta agt ggc ctg cg | mt | ||
| 710 | ctt gtc gag gtc tat ggc gcc | wt | |
| ctt gtc gag gcc tat ggc gcc | mt | ||
| inhA | 16 | agc gga atc atc acc gac tc | wt |
| agc gga atc acc acc gac tc | mt | ||
| 21 | gac tcg tcg atc gcg ttt ca | wt | |
| gac tcg tcg gtc gcg ttt ca | mt | ||
| 47 | ctg cgg ctg att cag cgc at | wt | |
| ctg cgg ctg act cag cgc at | mt | ||
| 78 | gcc ggc cgg gtg acc gag gc | wt | |
| gcc ggc cgg gcg acc gag gc | mt | ||
| 94 | gtg gtg cat tcg att ggg tt | wt | |
| gtg gtg cat gcg att ggg tt | mt | ||
| 95 | gtg cat tcg att ggg ttc at | wt | |
| gtg cat tcg cct ggg ttc at | mt | ||
| 194 | gca ggc cct atc cgg acg ct | wt | |
| gca ggc cct acc cgg acg ct | mt | ||
| kasA | 66 | cac ctc aag gat ccg gtc ga | wt |
| cac ctc aag aat ccg gtc ga | mt | ||
| 121 | gga gcc gag agg att gtc ga | wt | |
| gga gcc gag aag att gtc ga | mt | ||
| 269 | ctg ggt gcc ggt atc acc tc | wt | |
| ctg ggt gcc agt atc acc tc | mt | ||
| 312 | aac gcg cac ggc acg gcg ac | wt | |
| aac gcg cac agc acg gcg ac | mt | ||
| 387 | gtc gtc gcc ggc gaa ccg cg | wt | |
| gtc gtc gcc gac gaa ccg cg | mt | ||
| 413 | cg ctt gcc ttc ggg cgt tac | wt |
| cg ctt gcc tta ggg cgt tac | mt | ||
| ahpC | 2 | gc gtc atg cca ctg cta acc | wt |
| gc gtc atg cct ctg cta acc | mt | ||
| 3 | gtc atg cca ctg cta acc at | wt | |
| gtc atg cca aag cta acc at | mt | ||
| 73 | aag ctc aat gac gag ttc ga | wt | |
| aag ctc aat cac gag ttc ga | mt | ||
| 191 | ggc gaa ctc ctc aag gct tc | wt | |
| ggc gaa ctc cgc aag gct tc | mt | ||
| -46 | aat atg gtg tga tat atc ac | wt | |
| aat atg gtg taa tat atc ac | mt | ||
| t atg gtg tga tat ata tca c | mt | ||
| -44 | atg gtg tga tat atc acc tt | wt | |
| atg gtg tga aat atc acc tt | mt | ||
| -39 | tg tga tat atc acc ttt gcc | wt | |
| tg tga tat att acc ttt gcc | mt | ||
| -34 | tat atc acc ttt gcc tga ca | wt | |
| tat atc acc tct gcc tga ca | mt | ||
| -32 | atc acc ttt gcc tga cag cg | wt | |
| atc acc ttt acc tga cag cg | mt | ||
| -12 | ga ctt cac ggc acg atg gaa | wt | |
| ga ctt cac ggt acg atg gaa | mt | ||
| -10 | tt cac ggc acg atg gaa tgt | wt | |
| tt cac ggc aag atg gaa tgt | mt | ||
| tt cac ggc aca atg gaa tgt | mt | ||
| -6 | ac ggc acg atg gaa tgt cgc | wt | |
| ac ggc acg ata gaa tgt cgc | mt | ||
| -4 | gc acg atg gaa tgt cgc aac | wt | |
| gc acg atg gga tgt cgc aac | mt | ||
| 4 | tg gaa tgt cgc aac caa atg | wt | |
| tg gaa tgt cgt aac caa atg | mt | ||
| 33 | tt tga tga tga gga gag tca | wt | |
| tt tga tga taa gga gag tca | mt |
注：wt表示野生型；mt表示突变型
实施例二 探针设计和芯片制作
根据已知目的DNA片段序列(结核杆菌基因组)及其耐利福平突变位点(533、532、531、526、516、514、513、511点突变)的情况，设计长度相同(20mer)的探针。如表2示：其中：Mt、Wt分别表示突变型和野生型。
表2
| 探针号 | 序列 | 基因型 | (G-C)％ |
| 1a1b2a2b3a3b3c3d3e4a4b4c4d4e4f4g5a5b5c6a6b6c7a7b7c8a8b8c | 5′CTG TCG GCG CTG GGG CCC GG3′5′CTG TCG GCG CcG GGG CCC GG3′5′CGA CTG TCG GCG CTG GGG CC3′5′CGA CTG TCG GtG CTG GGG CC3′5′CGA CTG TCG GCG CTG GGG CC3′5′GC CGA CTG TtG GCG CTG GGG3′5′GC CGA CTG TgG GCG CTG GGG3′5′GC CGA CTG Ttc GCG CTG GGG3′5′GC CGA CTG Tac GCG CTG GGG3′5′GGG TTG ACC CAC AAG CGC CG3′5′GGG TTG ACC tAC AAG CGC CG3′5′GGG TTG ACC CtC AAG CGC CG3′5′GGG TTG ACC CgC AAG CGC CG3′5′GGG TTG ACC gcC AAG CGC CG3′5′GGG TTG ACC aAC AAG CGC CG3′5′GGG TTG ACC gAC AAG CGC CG3′5′AA TTC ATG GAC CAG AAC AAC3′5′AA TTC ATG GtC CAG AAC AAC3′5′AA TTC ATG tAC CAG AAC AAC3′5′CTG AGC CAA TTC ATG GAC CA3′5′TG AGC CAA ttc TCC ATG GAC3′5′CTG AGC CAA gTC ATG GAC CA3′5′CAG CTG AGC CAA TTC ATG GA3′5′CAG CTG AGC CcA TTC ATG GA3′5′CAG CTG AGC aAA TTC ATG GA3′5′CC AGC CAG CTG AGC CAA TTC3′5′CC AGC CAG CcG AGC CAA TTC3′5′CC AGC CAG CgG AGC CAA TTC3′ | WtMtWtMtWtMtMtMtMtWtMtMtMtMtMtMtWtMtMtWtMtMtWtMtMtWtMtMt | 85％90％80％75％80％75％80％75％75％70％65％70％75％75％65％70％40％40％35％50％50％55％50％55％45％60％65％65％ |
将合成的寡核苷酸溶于水中，然后与相同体积的Spoting Solution混合，使终浓度为75pmol/μl，用Cartesian公司的微阵列芯片制作系统点阵在醛基修饰的载玻片表面，置于室温下，70％相对湿度保存48-72小时进行固定，然后，室温下将玻片浸入0.2％SDS中振荡数分钟，再浸入纯水中振荡数分钟，再浸入0.2％的SDS三次，每次1分钟，再浸入100℃纯水中2秒，然后挥发干备用。
实施例三 目的DNA片段的荧光标记
设计一对引物，用PCR扩增产生荧光标记的目的DNA片段，其中模板为结核杆菌基因组DNA，引物序列为5′AGGACGTGGAGGCGATCACA3′和5′AACGGGTTGACCCGCGCGTA3′。扩增体系如下：50mM KCl、10mMTris-HCl(PH9.0at25℃)、0.1％Tritonx-100、1.5mM MgCl2、500μM dGTP、dCTP、dATP，200μM dTTP、100μM Cy5-dUTP、0.4mM的上游及下游引物、0.1ng/μl模板。此体系在94℃保温5min，然后以94℃ 40秒，58℃1min，72℃ 40秒循环35次，最后72℃保温5min，扩增产物长度307bp。
实施例四 标记的目的片段与芯片的杂交
将荧光标记的目的片段5μl 99℃5分钟变性后与20μl配制好的含各种浓度TMACL的杂交液混合，滴于芯片，60℃杂交30分钟。然后于45℃的TMACL洗液荡洗30min后凉干。同时取5μl PCR产物与20μl杂交液混合，滴于另一块芯片表面。于25℃杂交30min作为对照，室温下用2×SSC(含0.2％SDS)荡洗10min，并用0.1×SSC溶液冲洗一下凉干。
实施例五 信号检测和分析
杂交后的芯片用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray3000进行扫描分析，根据杂交结果得到相应的突变信息，然后与相应样品的测序结果进行对比(表3所示)。(样品测序委托博亚公司完成)
表3 用结核分支杆菌耐药性检测芯片检测利福平耐药性结果与测序结果比较
利福平 基因型
菌株号
耐药性 芯片检测结果 测序结果
H37Rv S Wt wt
1.1 R 526：CAC→GAC 526：CAC→GAC
1.2 R 531：TCG→TAC 531：TCG→TAC
2.1 R * 583：CCG→CG
513：CAA→AAA
2.2 R 513：CAA→AAA 569：ATC→GTC
531：TCG→TTG
2.3 R 531：TCG→TTG 583：CCG→CG
2.5 R 526：CAC→CGC 526：CAC→CGC
2.6 R 531：TCG→TTG 531：TCG→TTG
2.7 R 514：TTC insert 514：TTC insert
2.8 R 531：TCG→TTC 531：TCG→TTC
2.9 R * 583：CCG→CG
4.2 R 526：CAC→AAC 526：CAC→AAC
4.4 R 526：CAC→GCC 526：CAC→GCC
4.5 R 531：TCG→TTG 531：TCG→TTG
4.6 R 531：TCG→TTG 531：TCG→TTG
4.7 R - -
4.9 R 526：CAC→GAC 526：CAC→GAC
4.10 R 531：TCG→TTG 531：TCG→TTG
注：H37Rv：标准株；S：药敏性；R：耐药性；wt：野生型；“-”：未见突变；
*：由于芯片上未设计相应的探针，因此未检出。
由表3可见，芯片检测结果与测序结果的符合率为100％。由此可见，用结核分支杆菌耐药性检测芯片检测由rpoB突变所造成的耐药性敏感性可达90％以上，特异性为100％。
用结核分支杆菌耐药性检测芯片，从样品制备到PCR扩增，到得到检测结果，仅需4小时的时间，大大缩短了病人的诊断时间。另外，由于该法所需样品量极少，而芯片所包含的信息量却是极大，以极少的样品即可获得一个菌株对所有一线抗痨药物的耐药性情况。如果合成的探针包括所有的突变类型，即能通过一次试验检测到100％的突变。
Claims (9)
1.一种结核分支杆菌耐药性检测芯片，在一经修饰的载玻片上，固定有一系列寡核苷酸点阵探针，其特征在于：
(1)所说的探针是针对rpoB基因、katG基因、inhA基因、kasA基因、ahpC基因的突变而设计的；
(2)每个探针长度至少为10个碱基，并且各个探针长度相同；
(3)突变点尽可能位于探针中间。
2.根据权利要求1所述的结核分支杆菌耐药性检测芯片，其特征在于所说的探针主要针对rpoB基因的496、505、507、509、510、511、512、513、514、515、516、518、520、521、522、523、524、526、528、531、533、541、553、569、579、583密码子的突变，katG基因的1、20、63、99、108、122-125、138、140、142、160、172、180、262、275、295、300、302、304、315、328、335、336、350、463、477、501、515、567、587、593、629、710密码子的突变，inhA基因的16、21、47、78、94、95、194密码子的突变，kasA基因的66、121、269、312、387、413密码子的突变和ahpC基因的2、3、73、191、-46、-44、-39、-34、-32、-12、-10、-6、-4、4、33密码子的突变。
3.根据权利要求2所述的结核分支杆菌耐药性检测芯片，其特征在于所说的探针主要是针对rpoB基因的533、532、531、526、516、514、513、511密码子的突变。
4.根据权利要求3所述的结核分支杆菌耐药性检测芯片，其特征在于针对rpoB基因的533、532、531、526、516、514、513、511密码子的突变而设计的探针如下表所示：
探针号
序列
基因型
(G-C)％
1a1b2a
5′CTG TCG GCG CTG GGG CCC GG3′5′CTG TCG GCG CcG GGG CCC GG3′5′CGA CTG TCG GCG CTG GGG CC3′
WtMtWt
85％90％80％
探针长度相同为20mer，其中Mt、Wt分别表示突变型和野生型。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的结核分支杆菌耐药性检测芯片的制作方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)根据所设计的寡核苷酸探针进行探针的合成；
(2)用去离子水将合成的探针稀释，并与点样溶液(spoting solution)等体积混合，使终浓度为75pmol/μl；
(3)载玻片表面用醛基修饰；
(4)利用Cartesian公司的微阵列芯片制作系统将探针点阵在用醛基修饰的载玻片表面；
(5)置于相对湿度70％，室温条件下经48-72小时进行固定；
(6)室温下将玻片浸入0.2％SDS中振荡数分钟，再浸入纯水中振荡数分钟，再浸入0.2％SDS中三次，每次1分钟，再浸入100℃纯水中2秒，然后挥发干，备用。
6.根据权利要求5所述的结核分支杆菌耐药性检测芯片的制作方法，其特征在于所说寡核苷酸探针的5′末端需加一定长度(8-20聚)的连接臂(Poly T)，该连接臂的5′末端需加氨基修饰。
7.根据权利要求1所述的结核分支杆菌耐药性检测芯片的应用方法，其特征在于该应用方法包括以下步骤：
(1)样品处理，取病人痰液少量，用结核杆菌PCR杂交诊断试剂盒提取DNA；
(2)荧光标记：
获得待测样品的DNA以后，需进行荧光标记处理：1.取制备好的DNA样品5μl与20μl PCR扩增体系混合，(扩增体系包括2.5μl PCR反应缓冲液，5nmols dATP，5nmols dGTP，5nmols dCTP，2nmols dTTP，1nmol Cy5-dUTP，各15pmols的上游及下游引物，1.25U pfu DNA聚合酶)通过以下热循环过程制备荧光标记的DNA样品目的片断：首先94℃，5mins，以94℃，40s，58℃，1min，72℃，1min循环30次，最后，72℃延伸5mins。2.取荧光标记的目的DNA样品10μl，用Dnase I(核酸酶I)消化为200bp左右的DNA片段。
(3)芯片杂交
(4)检测和信号分析，最后用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描并分析结果。
8.根据权利要求7所述的结核分支杆菌耐药性检测芯片的应用方法，其特征在于所说的芯片杂交就是：
取标记并打断的目的DNA片断5μl，99℃变性5mins，然后与20μl EasyHyb杂交液(罗氏公司)混匀，取10μl滴于芯片表面，盖上盖玻片，置于60℃湿盒中杂交30mins，然后置45℃洗液中荡洗10mins，凉干。
9.根据权利要求7所述的结核分支杆菌耐药性检测芯片的应用方法，其特征在于所说的上游和下游引物如下： 基因 引物序列 Tm
产物长度(bp)
RpoB
5’-AGG ACG TGG AGG CGA TCA CA-3’
63.3 350
5’-GGG TTG ACC CGC GCG TA-3’
63.1
KatG
5’-CC GGC TTC CTG TTG GAC GAC-3’
64.9 2447
5’-CGG CGC GAT TTG TCA GAC C-3’
64.5
InhA 启动子
5’-CT CGC TGC CCA GAA AGG GA-3’
63.3 248
5’-CCC CGG TTT CCT CCG GT-3’
62.4
结构
5’-TT CAT GAC AGG ACT GCT GGA CG-3’
63.2
5’-CT AGA GCA ATT GGG TGT GCG C-3’
63.1
KasA
5’-ATT GAG TCG GAC AAC CCC GA-3’
62.3 1389
5’-CCT TCC ATA TCG GTC CGA CTC-3’
61.9
AhpC 启动子
5’-CCG ATG AGA GCG GTG AGC TG-3’
63.8 236
5’-C ACT GCT TTG CCG CCA CC-3’
62.9
结构
5’-CTT GCG GCA CTG CTG AAC C-3’
62.3
5’-GCT GCT GCG GGT GAT TGA G-3’
62.2
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