CN102304574B - 一种耐利福平结核分枝杆菌的诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐利福平结核分枝杆菌的诊断方法。其原理是根据结核分枝杆菌rpoB基因突变位点的特异性设计4条特异性引物，采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63~65°C对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到109~1010个拷贝，通过加入SYBRGreenI观察颜色变化来判断结果。本发明方法具有方便快捷，灵敏度高，特异性高等优点，对于耐利福平结核分枝杆菌的诊断与临床用药具有较高的参考价值，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于临床医学领域，涉及病原微生物的诊断方法，具体涉及一种耐利福平结核分枝杆菌的环介导等温核酸扩增诊断方法。
背景技术
世界卫生组织(WHO)将结核病与艾滋病、疟疾列为二十一世纪人类需要攻克的三大传染性疾病之一。目前中国结核病年发病人数约为130万，由于流动人口数量增加，公共卫生资源不足、公众重视度不够，约有5.5亿人遭到感染，每年约13万人死于结核病。我国是全球22个结核病高负担国家之一，耐药肺结核病疫情严峻，每年新发耐多药肺结核患者数约为12万，广泛耐药肺结核患者9000例。相关研究显示，每个肺结核患者一生可以传染10~15人，防治耐多药肺结核，最好的办法是尽早发现、尽早治疗，但耐药结核病的检测对实验室的生物安全要求较高，很多基层卫生服务机构无法开展，即便在能够检测的部分地市或更高的卫生服务机构，也需要至少２个月的时间才能确诊一例病例。如果耐多药结核病和广泛耐药结核病患者的数量得不到有效控制，疾病的发病和死亡率将成倍增长。
结核耐药性快速诊断方法对结核病的防治具有重要价值，目前我国在结核分枝杆菌耐药性的检测上已有几项专利，如结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法（200410083826.5）、检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的方法和试剂盒（200610037592）等，以上方法存在操作繁琐，所需设备昂贵等不足之处。
发明内容
本发明的目的在于提供一组用于快速诊断耐利福平结核分枝杆菌的特异性引物，及一种耐利福平结核分枝杆菌的诊断方法。本诊断方法方便快捷、用肉眼即可判断，价格低廉，适于推广应用。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
本发明根据结核分枝杆菌rpoB基因突变位点的特异性设计4条特异性引物，利用环介导等温扩增技术，在60~65℃下，60~90分钟内完成扩增反应，并根据显色剂显示的颜色来区分对利福平敏感结核杆菌和耐利福平结核杆菌。
用于快速诊断耐利福平结核分枝杆菌的特异性引物，包括：
内引物1：5’-GTGCACCCGTCGCACTACGGGCCCGACCTCCAGGCGCTG-3’（SEQ ID No.1）；
内引物2：5’-GGGTCAACCCGTTCGGGTTCTGCGGTACGGCGTTTCGAT-3’（SEQ ID No.2）；
外引物1：5’-GCCCGGCGGTCTGTCACGTG-3’（SEQ ID No.3）；
外引物2：5’-GTCGGCGGTCAGGTACACGA-3’（SEQ ID No.4）。
一种耐利福平结核分枝杆菌的诊断方法，包括如下步骤：
（1）模板DNA的制备：提取待检样品的DNA，所述待检样品是已鉴定为含有结核分枝杆菌的样品或分离的结核分枝杆菌；
（2）环介导等温核酸扩增反应：在200μl PCR管配制反应体系：引物混合物1μl，反应液 12.5μl，DNA聚合酶0.5~1μl，模板DNA 2~5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl，然后加入20μl的密封液，将上述反应管于63~65℃反应60~90min；
所述引物混合液含有上述4条特异性引物（SEQ ID No.1~4），其中，内引物1的浓度为4~8 pmol/μl、内引物2的浓度为4~8 pmol/μl、外引物1的浓度为1 pmol/μl、外引物2的浓度为1 pmol/μl；
所述反应液含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4、 5mM Betaine，四者的体积比为7~9：5：2~4：9~11；
（3）结果判断：在上述反应管中加入1~2μl显色剂SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为对利福平敏感结核分枝杆菌，橙色则为耐利福平结核分枝杆菌。
优选的，所述反应液中，10mM dNTP：10×ThermoPol反应缓冲液：150mM MgSO4：5mM Betaine（体积比）=8：5：3：10。
优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl。
本发明的有益效果在于：本发明的鉴定方法方便快捷，能在较短的时间内诊断出耐利福平结核分枝杆菌，且不需要昂贵的仪器设备；灵敏度高，最低可检测出100个菌/ml；特异性好，本发明根据rpoB基因序列设计4条特异性引物，与目的基因的6个区域结合，具有较高的特异性。本发明对于利福平敏感结核杆菌和耐利福平结核杆菌的诊断与临床用药具有较高的参考价值，适于推广应用。
具体实施方式
根据结核分枝杆菌rpoB基因突变位点的特异性设计4条特异性引物，序列分别如下：
内引物1：5’-GTGCACCCGTCGCACTACGGGCCCGACCTCCAGGCGCTG-3’（SEQ ID No.1）；
内引物2：5’-GGGTCAACCCGTTCGGGTTCTGCGGTACGGCGTTTCGAT-3’（SEQ ID No.2）；
外引物1：5’-GCCCGGCGGTCTGTCACGTG-3’（SEQ ID No.3）；
外引物2：5’-GTCGGCGGTCAGGTACACGA-3’（SEQ ID No.4）。
采用上述4条特异性引物诊断耐利福平结核分枝杆菌，包括如下步骤：
（1）模板DNA的制备：提取待检样品的DNA，所述待检样品是已鉴定为含有结核分枝杆菌的样品或分离的结核分枝杆菌；
（2）环介导等温核酸扩增反应：在200μl PCR管配制反应体系：引物混合物1μl，反应液 12.5μl，DNA聚合酶0.5~1μl，模板DNA 2~5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl，然后加入20μl的密封液，将上述反应管于63~65℃反应60~90min；
所述引物混合液含有上述4条特异性引物（SEQ ID No.1~4），其中，内引物1的浓度为4~8 pmol/μl、内引物2的浓度为4~8 pmol/μl、外引物1的浓度为1 pmol/μl、外引物2的浓度为1 pmol/μl；
所述反应液含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4、 5mM Betaine，四者的体积比为7~9：5：2~4：9~11；
（3）结果判断：在上述反应管中加入1~2μl显色剂SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为对利福平敏感结核分枝杆菌，橙色则为耐利福平结核分枝杆菌。
优选的，所述反应液中，10mM dNTP：10×ThermoPol反应缓冲液：150mM MgSO4：5mM Betaine（体积比）=8：5：3：10。
优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
环介导等温核酸扩增反应体系的准备：
（1）反应液：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4、 5mM Betaine，四者的体积比为8：5：3：10；
（2）引物液：包括4pmol/μl内引物1、4pmol/μl内引物2、1 pmol/μl外引物1、1 pmol/μl外引物2，四条引物序列分别为：
内引物1：5’-GTGCACCCGTCGCACTACGGGCCCGACCTCCAGGCGCTG-3’（SEQ ID No.1）；
内引物2：5’-GGGTCAACCCGTTCGGGTTCTGCGGTACGGCGTTTCGAT-3’（SEQ ID No.2）；
外引物1：5’-GCCCGGCGGTCTGTCACGTG-3’（SEQ ID No.3）；
外引物2：5’-GTCGGCGGTCAGGTACACGA-3’（SEQ ID No.4）；
（3）DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；
（4）显色剂：荧光染料 1×SYBR Green I。
用上述反应体系按以下方法对利福平敏感结核分枝杆菌和耐利福平结核分枝杆菌进行诊断。本实施例的待检样品是已鉴定为结核分枝杆菌患者的痰液，当然，也可以是已鉴定为结核分枝杆菌患者的支气管灌洗液及其它样品，或者分离的结核分枝杆菌。
1、模板DNA提取：
1） 将3ml的标本置于室温；
2） 在标本中加入2倍痰样体积的4%的NaOH；
3） 每隔2min涡旋振荡15s，处理15min，然后吸取1ml加入带旋盖的离心管中；
4） 12000r/min离心15min，去上清液；
5） 加入0.9%的NaCl 1ml，洗涤，12000r/min离心15min，去上清液；
6） 加入100μl的纯化水；
7） 100℃煮20min，然后冰浴10min；
8） 离心取上清液转移至另一支离心管中作为模板DNA。
2、环介导等温核酸扩增反应：在200 ul PCR管配制反应体系：引物混合物1μl，反应液 12.5μl，DNA聚合酶1μl，模板DNA 4μl，用灭菌去离子水补齐到25μl，然后加入20μl的密封液，将上述反应管放入63℃水浴锅内，反应60min后取出反应管。
3、结果判定：在上述反应管中加入1μl 1×SYBR Green I，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为对利福平敏感结核分枝杆菌，橙色则为耐利福平结核分枝杆菌。
本实施例中，PCR管显橙色，表明待检样品所感染的结核分枝杆菌为耐利福平结核分枝杆菌。
将本实施例样品中分离得到的结核分枝杆菌接种于含有利福平药物的改良罗氏培养基上，对照组为不含利福平药物的培养基，37℃培养6周，观察结果，实验结果本实施例的LAMP检测结果相一致。
实施例2
环介导等温核酸扩增反应体系的准备：
（1）反应液：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4、 5mM Betaine，四者的体积比为9：5：4：11；
（2）引物液：包括8pmol/μl内引物1、8pmol/μl内引物2、1 pmol/μl外引物1、1 pmol/μl外引物2，四条引物的序列与实施例1相同；
（3）DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；
（4）显色剂：荧光染料 1×SYBR Green I。
用上述反应体系按以下方法对利福平敏感结核分枝杆菌和耐利福平结核分枝杆菌进行诊断。本实施例的待检样品是已鉴定为结核分枝杆菌患者的支气管灌洗液。
1、模板DNA提取：
1） 取2ml的待检样品置于室温；
2） 加入1倍样品体积的4%的NaOH；
3） 每隔2min涡旋振荡15s，处理15min，然后吸取1ml加入带旋盖的离心管中；
4） 12000r/min离心15min，去上清液；
5） 加入0.9%的NaCl 1ml，洗涤，12000r/min离心15min，去上清液；
6） 加入100μl的纯化水；
7） 100℃煮20min，然后冰浴10min；
8） 离心取上清液转移至另一支离心管中作为模板DNA。
2、环介导等温核酸扩增反应：在200 ul PCR管配制反应体系：引物混合物1μl，反应液 12.5μl，DNA聚合酶1μl，模板DNA 4μl，用灭菌去离子水补齐到25μl，然后加入20μl的密封液，将上述反应管放入63℃水浴锅内，反应60min后取出反应管。
3、结果判定：在上述反应管中加入2μl 1×SYBR Green I，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为对利福平敏感结核分枝杆菌，橙色则为耐利福平结核分枝杆菌。
本实施例中，PCR管显绿色，表明待检样品所感染的结核分枝杆菌为对利福平敏感结核分枝杆菌。
将本实施例样品中分离得到的结核分枝杆菌接种于含有利福平药物的改良罗氏培养基上，对照组为不含利福平药物的培养基，37℃培养6周，观察结果，。实验结果与本实施例的LAMP检测结果相一致。
<110> 广东省结核病控制中心
广州迪澳生物科技有限公司
<120> 一种耐利福平结核分枝杆菌的诊断方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
gtgcacccgt cgcactacgg gcccgacctc caggcgctg 39
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
gggtcaaccc gttcgggttc tgcggtacgg cgtttcgat 39
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
gcccggcggt ctgtcacgtg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
gtcggcggtc aggtacacga 20
Claims (1)
1.用于快速诊断耐利福平结核分枝杆菌的特异性引物，其特征在于，包括：
内引物1：5’-GTGCACCCGTCGCACTACGGGCCCGACCTCCAGGCGCTG-3’（SEQ ID No.1）；
内引物2：5’-GGGTCAACCCGTTCGGGTTCTGCGGTACGGCGTTTCGAT-3’（SEQ ID No.2）；
外引物1：5’-GCCCGGCGGTCTGTCACGTG-3’（SEQ ID No.3）；
外引物2：5’-GTCGGCGGTCAGGTACACGA-3’ （SEQ ID No.4）。
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