CN105018644B - 一种呼吸道病原体检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种呼吸道病原体检测试剂盒，该试剂盒是基于多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色原理使用的，包含了6种引物探针组合中的1种或几种，可用于同时检测甲型流感/禽流感病毒（FluA）、乙型流感病毒(FluB)、SARS‑COV病毒、嗜肺军团菌（LP）、脑膜炎奈瑟菌（N.men）及腺病毒（ADV）。使用该试剂盒检测呼吸道病原体特异性强，灵敏度高，不需要配备昂贵的仪器，通过肉眼即可观察检测结果，可以在基层得到应用。

Description

一种呼吸道病原体检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种呼吸道病原体检测试剂盒。
背景技术
呼吸道感染是人类最常见的疾病之一，一些常见的呼吸道病原体如流感/禽流感病毒、腺病毒、嗜肺军团菌及脑膜炎奈瑟菌等的感染是幼儿、年老体弱者及免疫功能低下者发病及死亡的主要原因。这些病原体的感染具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急、病后无终身免疫力等特点，近年来，SARS病毒、甲型流感H1N1、禽流感H7N9等呼吸道病原体接连肆虐全球，给公共卫生安全造成很大的危害。
因为呼吸道病原体引起的感染症状和流行特点相似，且仅靠临床症状很难确定真正的病原体，而多病毒共感染、病毒的变异和新病毒的出现使呼吸道病毒检测技术面临巨大挑战。快速准确鉴定病原体对于制定治疗和用药方案，控制传染病流行具有重要意义。现有技术中，分离培养虽然是呼吸道病毒检测的 “金标准”，但该方法操作复杂，耗时长，不适合用于早期诊断。抗体检测虽然操作简便，但其灵敏度和特异性变化较大，容易出现假阳性和假阴性。最常用的荧光定量PCR检测有较好的敏感性和特异性，但是需要配备价格昂贵的仪器，且容易发生PCR污染。近年来，多重PCR检测技术因其快速、简便和高通量等特点，在呼吸道病毒检测中得到广泛应用。多重PCR技术是在在同一PCR体系里加入两对或两对以上引物，可以同时检测出多种病原微生物，非常适合成组的呼吸道病原体检测。此外，运用多重PCR方法，还增加了单个样本中多重感染的检出率。然而，仅仅使用多重PCR技术来进行鉴定不同呼吸道病原体时，不同病原体扩增的核酸片段大小需要具有明显差异，否则无法鉴定病原体种类。因此，迫切需要一种快速的高灵敏度、高特异性、可以同时检测多种呼吸道病原体的检测试剂盒，为临床诊断提出实验室依据。
本发明利用多重PCR技术结合核酸侵入反应及纳米金显色来检测一组重要的呼吸道病原微生物, 包括甲型流感/禽流感病毒（FluA）中常见的4种流感亚型，即季节性流感H3N2、H1N1、新型甲流H1N1（swH1N1）、禽流感H5N1，乙型流感病毒(FluB)、SARS-COV病毒、嗜肺军团菌（LP）、脑膜炎奈瑟菌（N.men）及腺病毒（ADV）。本发明所述核酸侵入反应是根据待测靶核酸序列（本实验中为多重PCR扩增产物序列）设计两条寡核苷酸探针，即上游探针和下游探针。其中上游探针与靶序列互补，下游探针含有两个区域，3’端序列与靶序列完全互补，为靶序列特异区域；5’端序列与靶序列不相关。所述上、下游探针在核酸侵入反应体系中可以跟靶核酸形成一种由双链DNA和单链DNA组成的单碱基侵入重叠结构，这种特殊的结构被Flap核酸内切酶识别后，可被切断下游探针与靶序列互补的第一个和第二个碱基之间的化学键，切下的片段称为Flap片段，能够作为模板特异性的信号分子。切割后的下游探针由于与靶核酸杂交不稳定而发生解离，新的下游探针占据该位置，重新形成单碱基侵入重叠结构进一步被核酸内切酶识别，从而实现Flap片段的积累；而切下来的Flap片段可以作为第二步侵入切割反应的侵入探针，与一个具有发卡型结构的发卡探针进行杂交，再次形成单碱基侵入重叠结构，在核酸内切酶的作用下，发卡探针亦被切割成两部分。上述发卡探针在没有被切割前，其3’端和5’端可分别同标记有纳米金的寡核苷酸探针A、探针B互补杂交，使得纳米金探针形成伸展的纳米金颗粒-多核苷酸的多聚网状结构，形成沉淀，反应体系呈现无色透明，视为阴性反应。而当反应体系存在靶核酸时，引起级联信号放大反应，大量发卡探针被切割，不能与两种纳米金探针互补连接，无法引发纳米金的特征离子吸收发生变化，反应体系呈现红色，视为阳性反应。
发明内容
本发明所解决的技术问题是：针对现有技术中的不足，提供一种操作简单、费用低廉且灵敏度较高的呼吸道病原体检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：提供一种呼吸道病原体检测试剂盒，其特征在于，包括如下6组引物探针组合：所述第一组引物探针组合用于检测腺病毒，上、下游引物如SEO ID NO:1和SEO ID NO:2所示，上、下游探针如SEO ID NO:13和SEOID NO:14所示；所述第二组引物探针组合用于检测甲型流感/禽流感病毒病毒，上、下游引物如SEO ID NO:3和SEO ID NO:4所示，上、下游探针如SEO ID NO:15和SEO ID NO:16所示；
所述第三组引物探针组合用于检测SARS-COV病毒，上、下游引物如SEO ID NO:5和SEO ID NO:6所示，上、下游探针如SEO ID NO:17和SEO ID NO:18所示；
所述第四组引物探针组合用于检测嗜肺军团菌，上、下游引物如SEO ID NO:7和SEO ID NO:8所示，上、下游探针如SEO ID NO:19和SEO ID NO:20所示；
所述第五组引物探针组合用于检测脑膜炎奈瑟菌，上、下游引物如SEO ID NO:9和SEO ID NO:10所示，上、下游探针如SEO ID NO:21和SEO ID NO:22所示；
所述第六组引物探针组合用于检测乙型流感病毒，上、下游引物如SEO ID NO:11和SEO ID NO:12所示，上、下游探针如SEO ID NO:23和SEO ID NO:24所示。
优选的，该试剂盒还包括杂交探针，如SEQ ID NO:25所示，核酸内切酶AfuFEN，纳米金探针a和纳米金探针b, 其序列分别为SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。6组引物及探针组合中，各引物在多重PCR反应体系中的终浓度为0.5-2 μM，各探针在反应体系中的终浓度为0.1-0.3μM。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明所提供试剂盒首次将多重PCR技术结合核酸侵入反应及纳米金显色应用于呼吸道病原体检测，样本的阳性显色结果均为肉眼可见的红色，而阴性对照为无色，不需要配备昂贵的仪器，通过肉眼即可观察检测结果，成本低廉。而且核酸侵入反应不依赖核酸序列，而只依赖核酸形成的特异性结构，并且由于该反应并非扩增待测模版本身，极大的降低了模版交叉污染的风险，可以在基层得到应用。
此外，本发明的引物和探针的特异性强，灵敏度高，可一次性分析大量样本，同时对多种呼吸道病原体进行检测，减少操作步骤，节省了资源。
附图说明
图1为核酸侵入反应及纳米金显色结果；1和2：FluB胶体金检测结果及其阴性对照、3和4：SARS-COV胶体金检测结果及其阴性对照、5和6：LP胶体金检测结果及其阴性对照、7和8：N.men胶体金检测结果及其阴性对照、9和10：ADV胶体金检测结果及其阴性对照。
图2为FluA病原体核酸侵入反应及纳米金显色结果；1和2：swH1N1胶体金检测结果及其阴性对照、3和4：H1N1胶体金检测结果及其阴性对照、5和6：H3N2胶体金检测结果及其阴性对照、7和8：H5N1胶体金检测结果及其阴性对照。
图3为甲型流感病毒H1N1 RNA模板量为0、100、101、102、103、104、105拷贝时经多重PCR扩增结合核酸侵入反应及纳米金显色方法后的检测结果。
图4为FluB RNA模板量为0、100、101、102、103、104拷贝时经多重PCR扩增结合核酸侵入反应及纳米金显色方法后的检测结果。
图5为SARS-COV RNA模板量为0、100、101、102、103、104拷贝时经多重PCR扩增结合核酸侵入反应及纳米金显色方法后的检测结果。
图6为ADV病毒DNA模板量为0、100、101、102、103拷贝时经多重PCR扩增结合核酸侵入反应及纳米金显色方法后的检测结果。
图7为 LP DNA模板量为0、100、101、102、103拷贝时经多重PCR扩增结合核酸侵入反应及纳米金显色方法后的检测结果.
图8为N.men DNA模板量为0、100、101、102、103拷贝时经多重PCR扩增结合核酸侵入反应及纳米金显色方法后的检测结果。
具体实施方式
下面将结合说明书附图，对本发明作进一步的说明。
本发明所述呼吸道病原体检测试剂盒采用多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色原理，首先对待测样本进行多重PCR扩增，实现对目标模板的扩增；接着进行核酸侵入信号放大反应，将目标模板的检测转化为信号分子的检测，并实现检测信号放大；最后进行纳米金探针杂交反应，实现对信号分子的检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例一：9种常见呼吸道病原体试剂盒检测方法
1样本选择：选择常见的呼吸道病原体：RNA病毒，包括H3N2、H1N1、swH1N1、H5N1、FluB、SARS-COV病毒。DNA病毒或细菌，包括LP、N.men及ADV病毒。毒株或样本均为本实验室分离、鉴定、保存。
2核酸提取：核酸提取按照Roche公司MagNA Pure LC全自动核酸提取仪和MagNAPure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit的使用要求，提取核酸并放置于-80℃保存.
3逆转录： 根据Invitrogen公司SuperScript First-Strand SynthesisSuperMix 说明书操作方法，使用该试剂盒提供的随机引物将FluA、FluB、SARS-COV病毒核酸逆转录为DNA置于-20℃保存。
4多重PCR引物及核酸侵入反应探针的设计与合成：检索文献、查询NCBI Genebank数据库，下载病原体基因序列，通过MEGA 5.1软件进行序列比对，查找相关病原基因保守序列，通过blast比对排除同源基因片段，最终确定待测病原体靶片段。通过Primer 5.0设计多重PCR扩增引物。利用Universal Invader 1.2.4 软件设计核酸侵入反应所需上游探针和下游探针。序列如表1及表2所示，以上引物均由上海生工生物工程公司合成。
表1 多重PCR引物
表2核酸侵入反应所需上下游探针
5 多重PCR反应:利用表1中多重PCR引物，参照QIAGEN Multiplex PCR Kit说明书针对不同核酸配置各自的反应体系，模板量为200ng。其中每个体系中，各引物终浓度0.5-2μM,反应条件为：95℃变性15 min, 94℃，30 s，60℃，90 s, 72℃，90 s，40个循环，72℃延伸10 min，99℃，10 min灭活DNA酶。扩增产物通过QIAxcel毛细管电泳仪进行检测。
6核酸侵入反应：以PCR产物作为模板，建立核酸侵入反应体系（20 μL），该体系含上、下游探针及杂交探针0.1-0.3μM，杂交探针序列如SEQ ID NO:25所示，即为：5’-GTCTTGTGGTACTGCACTCGTCTCGGTTTTCCGAGACGAGTCCTCGGCGCGAATATTGATAATCAT-3’，核酸内切酶AfuFEN 1μL，体系配制完成后，每管加入10 μL矿物油，再加入5 μL PCR产物；核酸侵入反应程序：85℃，1 min,63℃，20 min。对于多重呼吸道病原体感染的样本，该样本的PCR扩增产物可分别建立不同的核酸侵入反应体系分别进行验证。
7纳米金探针杂交反应：向反应完成的核酸侵入反应体系中加入纳米金显色体系，即纳米金探针6μL（由南京军区军事医学研究所周国华课题组提供），纳米金探针序列A和B分别如SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示，即A ：5’-AAAAAAAAAAATGATTATCAATATT-3’， B：5’-GCAGTACCACAAGACAAAAAAAAAA-3’，3 M NaCl 5μL震荡混匀稍微离心后55 ℃，30 min进行纳米金显色反应。
8结果分析：多重PCR反应结果显示，对上述呼吸道病原体的核酸进行多重PCR反应，扩增产物通过QIAxcel毛细管电泳仪进行检测，检测结果均在预测位置上出现单一的目的条带。核酸侵入反应及纳米金显色结果显示，PCR反应产物经核酸侵入反应及纳米金显色后，各个样品的显色结果均为肉眼可见的红色，而阴性对照为无色。
实施例二 利用本发明所述试剂盒检测呼吸道常见病原体的特异性
用已优化的多重PCR体系，扩增FluA、FluB、SARS-COV、LP、N.men、ADV、人偏肺病毒的核酸样品，反应产物采用实施例一中所述核酸侵入反应及纳米金显色方法进行检测。结果如表3所示，呼吸道病原体：FluA、FluB、SARS-COV、LP、N.men、ADV在采用多重PCR反应技术结合核酸侵入反应及纳米金显色进行检测时只有采用相应的引物探针时，纳米金显色后才会显示阳性，在检测其他病原体时结果均为阴性，表明本方法检测呼吸道病原体具有较高特异性。
表3 本发明所述试剂盒检测呼吸道常见病原体特异性检测结果
说明：√表示检测结果为阳性，×表示检测结果为阴性
实施例三 利用本发明所提供的试剂盒检测呼吸道常见病原体的敏感性
针对RNA病毒：FluB、SARS-COV、H3N2、H1N1、swH1N1、H5N1的核酸样品，以带有T7RNA聚合酶启动子序列5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAG -3'的上游引物，以上述RNA病毒核酸为模版扩增5′端UTR区基因片段，扩增产物纯化回收后，以T7 RNA聚合酶进行体外转录，经纯化定量后10倍稀释成1×101-1×105拷贝/μL。每个稀释度取1μL作为模板逆转录后，采用本发明提供的试剂盒利用多重PCR反应技术结合核酸侵入反应及纳米金显色原理进行检测。针对DNA病毒或细菌样本：LP、N.men、ADV的核酸样品，直接定量后10倍稀释成1×101-1×105拷贝/μL，每个稀释度取1μL采用本发明提供的试剂盒利用多重PCR反应技术结合核酸侵入反应及纳米金显色原理进行检测。
结果显示，该试剂盒检测FluA病毒最低检测线为10000拷贝， FluB病毒最低检测线100拷贝、SARS-COV病毒最低检测线100拷贝、LP最低检测线10拷贝、N.men最低检测线10拷贝、ADV病毒最低检测线10拷贝。
以上显示和描述了本发明的基本原理,主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种呼吸道病原体检测试剂盒，其特征在于，包括如下6组引物探针组合：
所述第一组引物探针组合用于检测腺病毒，上、下游引物如SEO ID NO:1和SEO ID NO:2所示，上、下游探针如SEO ID NO:13和SEO ID NO:14所示；
所述第二组引物探针组合用于检测甲型流感/禽流感病毒病毒，上、下游引物如SEO IDNO:3和SEO ID NO:4所示，上、下游探针如SEO ID NO:15和SEO ID NO:16所示；
所述第三组引物探针组合用于检测SARS-COV病毒，上、下游引物如SEO ID NO:5和SEOID NO:6所示，上、下游探针如SEO ID NO:17和SEO ID NO:18所示；
所述第四组引物探针组合用于检测嗜肺军团菌，上、下游引物如SEO ID NO:7和SEO IDNO:8所示，上、下游探针如SEO ID NO:19和SEO ID NO:20所示；
所述第五组引物探针组合用于检测脑膜炎奈瑟菌，上、下游引物如SEO ID NO:9和SEOID NO:10所示，上、下游探针如SEO ID NO:21和SEO ID NO:22所示；
所述第六组引物探针组合用于检测乙型流感病毒，上、下游引物如SEO ID NO:11和SEOID NO:12所示，上、下游探针如SEO ID NO:23和SEO ID NO:24所示。
2.根据权利要求1所示一种呼吸道病原体检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交探针，如SEQ ID NO:25所示，核酸内切酶AfuFEN，纳米金探针a和纳米金探针b, 其序列分别为SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。
3.根据权利要求1所示一种呼吸道病原体检测试剂盒，其特征在于，6组引物及探针组合中，各引物在多重PCR反应体系中的终浓度为0.5-2 μM，各探针在反应体系中的终浓度为0.1-0.3μM。
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