CN104630387B

CN104630387B - 猪流行性腹泻病毒的lamp检测试剂盒

Info

Publication number: CN104630387B
Application number: CN201510058622.4A
Authority: CN
Inventors: 黄小波; 曹三杰; 朱书权; 文心田; 文翼平; 伍锐; 梁恩涛; 段素芬; 张丹; 张小会
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2017-07-18
Anticipated expiration: 2035-02-04
Also published as: CN104630387A

Abstract

本发明公开了一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，它包括SEQ IDNO：1～4所示引物，用于环介导等温扩增猪流行性腹泻病毒的基因。本发明还公开了SEQ ID NO：1～4所示引物在制备环介导等温扩增猪流行性腹泻病毒的基因的试剂中的用途。本发明检测试剂盒可以准确、有效的检测猪流行性腹泻病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。

Description

猪流行性腹泻病毒的LAMP检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测猪流行性腹泻病毒的LAMP检测试剂盒。

背景技术

猪流行性腹泻病在猪群中的传播速度较猪传染性胃肠炎慢，死亡率也较低，但最近一两年报道，猪流行性腹泻病毒(PEDV)发生变异，死亡率有所增高。哺乳仔猪感染猪流行性腹泻病毒的主要临床症状为：发生水样腹泻并伴有呕吐而导致严重脱水、消瘦、眼窝下陷等症状；粪便较稀，颜色为黄色或灰白色，呕吐多发生于吃奶或进食后；发病猪只一般在5天左右死亡，有的猪场哺乳仔猪的死亡率可高达90％。断奶仔猪与保育猪感染流行性腹泻病毒后症状较轻，常呈现精神沉郁、厌食、拉稀、呕吐等临床症状，如护理得当，猪场比较洁净，无其它疾病续发感染，则死亡率较低，约在10％-20％；育肥与后备猪感染呈现一过性特点，很少发生死亡，一般3-7天可以自然康复。剖检的主要病理变化主要小肠极度膨胀，肠壁呈半透明状，肠系膜淋巴结水充血，胃充满白色乳凝块，小肠内容物稀薄，含有大量的淡黄色液体，小肠绒毛缩短。

传统的检测方法如病毒分离鉴定和血清检查，往往耗时过长。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是众多核苷酸扩增技术(the nucleicacid amplifications tests，NATs)中的一种。自从Notomi等研究者于2000年公布该技术以来，该技术已经被广泛地应用于生命科学领域，其中就包括对病原体感染的检测。当研究者将该技术应用于检测各种病原体的同时，也对该技术提出了很多的改进，使得该技术逐步完善，能够成功地被应用于如疟疾、锥虫病、泰勒尔梨浆虫病和巴贝虫病等疾病病原体的检测。LAMP核酸扩增是在等温条件下进行的，不需要特殊的仪器，可以肉眼观察结果，操作简单。

郑新添等，“环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒”，中国预防兽医学报，2014年10月第36卷第10期，公开了一种采用RT-LAMP检测猪流行性腹泻病毒的方法，其能够检测的猪流行性腹泻病毒的最低检测限度为16copies/μL。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高的可检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒。

本发明检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，它包括SEQ ID NO：1～4所示引物，用于环介导等温扩增猪流行性腹泻病毒的基因。

其中，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：5～6所示引物。

其中，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：7所示的基因片段。

本发明还提供了SEQ ID NO：1～4所示引物在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂中的用途。

其中，所述检测猪流行性腹泻病毒的试剂是环介导等温扩增猪流行性腹泻病毒的基因的试剂。

其中，所述试剂还包括SEQ ID NO：7所示的基因片段。

其中，所述试剂还包括SEQ ID NO：5～6所示引物。

本发明还提供了SEQ ID NO：1～4所示引物在制备环介导等温扩增猪流行性腹泻病毒的基因的试剂中的用途。

其中，所述试剂还包括SEQ ID NO：5～6所示引物。

其中，所述试剂还包括SEQ ID NO：7所示的基因片段。

本发明设计的引物，用LAMP技术可以特异有效地扩增猪流行性腹泻病毒的基因，病毒的最低检测浓度为15copies/μL，最低检测限度略低于现有方法，灵敏度略高，同时，特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 dNTPs对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-8依次对应dNTPs的剂量为:0.5、1.0μL、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0μL。

图2 MgSO4对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-8依次对应MgSO4的剂量为:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL。

图3 Bst DNA聚合酶对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-9依次对应Bst大片段DNA聚合酶的剂量为:0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6μL。

图4甜菜碱对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-7依次对应甜菜碱的剂量为:0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μL。

图5反应温度对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-8依次对应反应温度为:58、59、60、61、62、63、64、65℃。

图6内引物浓度对LAMP反应的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-8依次对应内引物浓度的剂量为:0.4、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6μL。

图7不加环引物对反应时间的影响。M:DL2000DNA Marker,泳道1-6依次对应不加环引物不同反应时间为：15min、30min、45min、60min、75min、90min.。

图8环引物浓度对LAMP反应的影响。M:DL2000DNA Marker；；泳道1-9依次对应环引物浓度的剂量为:0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2μL。

图9加环引物对反应时间的影响。M:DL2000DNA Marker,泳道1-6依次对应加环引物不同反应时间为：10min、20min、30min、40min、50min、60min。

图10 AMV反转录酶对RT-LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-6依次对应AMV反转录酶的剂量为:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0μL。

图11特异性试验，电泳图谱。M:DL2000DNA Marker；1-8:RT-LAMP法扩增的EDV、TGEV、PoRV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV和阴性对照的琼脂糖凝胶电泳结果，RT-LAMP反应管由gene genius生物成像系统照相

图12特异性试验。M:DL2000DNA Marker；1-8:RT-LAMP法扩增的EDV、TGEV、PoRV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV和阴性对照的琼脂糖凝胶电泳结果，RT-LAMP反应管由gene genius生物成像系统照相。

图13 RT-LAMP灵敏度试验，电泳图谱。M,Marker DL 2000；1-9:使用10¹-10⁹稀释的阳性RNA模板的RT-LAMP法的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果；10：阴性对照。

图14 RT-LAMP灵敏度试验，反应产物在紫外灯下的显像。M,MarkerDL 2000；1-9:使用10¹-10⁹稀释的阳性RNA模板的RT-LAMP法的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果；10：阴性对照。

具体实施方式

一、实验材料和仪器

病毒及主要试剂与材料

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒(OSU株)、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、乙型脑炎病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、购自中国兽药监察所或本实验室保存。大肠埃希菌DH5a，反转录试剂盒、T7体外转录试剂盒、限制性内切酶NdeⅠ、EcoRⅠ、SpeⅠ、DNAseⅠ等购自大连宝生物有限公司，质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒等购自Omega公司，RNA提取试剂盒、2×PCR Mix(含Taq DNA聚合酶、dNTPs、ddH₂O、MgCl₂)、dNTPs、DNA Marker琼脂糖等购自天根生化有限公司，pGEM T-Easy Vector SystemⅠ和AMV反转录酶购自Progema公司，Bst DNA Polymerase(Large Fragment)、10×ThermoPolBuffer、MgSO₄等购自NEB公司，甜菜碱购自Sigma公司，Goldenview核酸染料购自北京赛百盛生物有限公司，钙黄绿素荧光染料购自广州迪澳生物科技有限公司，所设计的引物送至上海生物工程有限公司合成，50×TAE。

主要仪器设备

MyCyclerTM PCR仪、POWER Pac TM电泳仪及水平电泳槽、UNIVERSAL HOOD凝胶成像系统、Smartspec^TM Plus核酸蛋白仪、移液枪，美国BIO-RAD公司产品；Legend Micro 17Rcentrifuge高速冷冻离心机、恒温振荡培养箱，美国Thermo公司产品；WaterPro Plus超纯水仪，美国LABCONCO公司产品；电子天平，恒温水浴锅。

实施例1 本发明试剂盒的制备

1、材料和仪器

同前述实验材料和仪器。

2、实验方法

2.1引物和模板制备

2.1.1引物设计

设计PEDV的LAMP引物见表1。

引物如下：

2.1.2阳性模板制备

将目的基因片段(SEQ ID NO：7)

ATCTGTGAGAACCGCACTCGGATTACTCACAGCTGAGTAGTCGCCGTGTTTGGACCGGACATAGAAAGCCCAACCAGTGCCAGATGGAGCATTGACTGAACGACCAACACGTCCGTAGACAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCGACTGTGACGAAATTAGGTAATTGACTTACCTGTACGCCAGTAGCAACCTTATAGCCCTCTACAAGCAATGTACCACTAAGGAGTGTTAGCGTTACACCAGTTGGTGCTCCAAGCACTGGAATGCAGACCTGTCGGCCCATCACAGAAGTAGTGAGAAGCGCGTCTGTTTCAGGATTGAAAGACCACCAAGAATGTGTCCTGCGCCACAACCGAATGCTATTGACAAAGTACATTATCCACAGCATAAGAGTGATGCAAGCCATAAGGATGCTGAAAGCAAAAAAGACCCAATTGACCTGAAAGCTAGCCCATGCATCAAAAAGTGACAGTGCTAACACAAGGGGCCAAAGTATCCATAGAATAGCCATCTTGACACCATACAAGAACGCAGAGTACTTGTAATGGCCATACTGAAGCACTACAAGTAGTATCGTCAGTATGATATTCCATGTGAAATTCCAGTTTCTAAGGTGTTGAATCACCTCATCAACGGGA

连接包含T7和SP6RNA聚合酶启动子的PGEM-T easy载体，连接体系参照PromegapGEM T-Easy Vector System I说明书反应体系见下表。

表1 目的片段连接PGEM-T载体所需的试剂和用量

反应程序为：22℃孵育2h，4℃过夜。

2.2PEDV的RT-LAMP检测方法的建立

2.2.1反应条件及体系的优化

初步设定RT-LAMP反应条件为63℃反应60min，80℃反应10min的25μL反应体系中各组分及含量见下表，用去离子水补充至25μL。以所制备的阳性质粒为模板，按上述体系进行多组实验，所需优化的试剂预先购买和配制，并配成相应的浓度，在条件优化时方便加样，减少一定的工作量。dNTPs(10mmol/L)、MgSO4(100mmol/L)、甜菜碱(5mol/L)、Bst DNA聚合酶(8U/μL)、内引物FIP、BIP混合后的终浓度(25pmol/L)、外引物F3、B3混合后的终浓度(2.5pmol/L)、环引物LF、LB混合后的终浓度(12.5pmol/L)、AMV反转录酶浓度(10U/μL)，以上述试剂浓度优化反应体系的试剂用量和最佳反反应条件，以确定各个试剂最佳反应浓度。

由于肉眼分辨能力有限，若采用SYBR GreenⅠ、钙黄绿素指示剂的颜色变化、浊度变化等不能准确判读反应的敏感性，所以本试验的条件优化根据琼脂糖凝胶电泳结果判定反应中各个体系的试剂最佳使用量。反应产物于20g/L的琼脂糖凝胶电泳进行分析，选出最佳反应条件。随着条件优化的进行，每次都是从多次重复试验中选定试剂最佳用量及最佳反应条件，进行下一条件优化时，选择上一次的最佳条件及试剂用量，以此类推直到最后一个条件及试剂用量优化完。

dNTPs最佳浓度的优化：分别加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0μL；MgSO4最佳浓度优化：分别加0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL；Bst大片段DNA聚合酶最佳浓度优化：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6μL；甜菜碱最佳浓度优化：分别加0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μL；最佳温度优化：分别为58、59、60、61、62、63、64、65℃；内引物FIP、BIP浓度优化：分别加0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2μL；最佳反应时间优化：分别为15、30、45、60、75、90min；环引物LF、LB浓度优化：分别加0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2μL，反应时间减至30min；加环引物最佳反应时间优化：10、20、30、40、50、60min；AMV反转录酶最佳浓度优化：在以上优化结果试验的基础上，以所制备的病毒RNA模板进行AMV反转录酶优化，AMV反转录酶的范围设为0.1-0.7μL，以0.1递增。

2.2.2试剂盒的组装

2.2.2.1RT-LAMP检测方法条件优化结果

包括10×T Buffer最佳PH值及用量，10mmol/L的dNTPs、100mmol/L的MgSO₄、5pmol/L的外引物、50pmol/L的内引物、8U/μL的Bst大片段DNA聚合酶、5mol/L的甜菜碱、最佳温度、不加环引物反应时间、加环引物后的反应时间、10U/μL的AMV反转录酶的用量。

2.2.2.2试剂盒组装

在完成RT-LAMP反应体系及条件的优化后，重新进行所有试剂的重新购买与配制，按优化好的体系进行试剂盒的试剂的配制与组装。

3、实验结果

3.1dNTPs最佳浓度的优化

随着dNTPs量的增加，条带的亮度增加，当dNTPs增加至3μL时，随着dNTPs继续增加条带亮度慢慢减弱(图1)。本试验确定10mmol/L的dNTPs的最佳用量为2.5μL，反应终浓度为1mmol/L。

3.2MgSO₄最佳浓度优化

当Mg²⁺的用量超过2.0μL出现明显的抑制反应，扩增条带的亮度明显减弱，加入适量的Mg²⁺可以使酶达到最高的催化活性而不影响DNA的合成(图2)。本试验结果也表明，当扩增反应较小时无法通过肉眼观察浊度无法区分阴性扩增反应。本试验确定100mmol/L的MgSO₄的最佳用量为1μL，反应终浓度为4mmol/L。

3.3Bst大片段DNA聚合酶最佳浓度优化

试验结果表明酶加0.2μL反应就可以进行，但条带比较暗，随着酶的用量增加，合成的DNA量也增加，生成的焦磷酸也增加，从反应管的混浊度也可以看出，酶加到0.8μL时就可以以看见明显的混浊，但扩增反应较小时无法通过肉眼观察浊度无法区分阴性扩增反应，0和0.2μL酶用量无法肉眼区别有扩增(图3)。电泳结果表明当酶用量高于0.6μL时其扩增产物并无明显增多，由于酶的价钱比较贵，本试验确定8U/μL的酶的用量为0.8μL。

3.4甜菜碱最佳浓度优化

甜菜碱具有减少非特异性扩增的作用，增加DNA扩增的效率的作用，试验结果表明甜菜碱对LAMP反应并不是必须的，从结果中可以看出不加甜菜碱也可以扩增，但扩增的量比较低(图4)。本试验确定5mol/L的甜菜碱的用量为3μL，最佳反应浓度为0.6M。

3.5最佳温度优化

试验结果表明，LAMP在58-65℃均能进行反应，在59-64℃时的扩增反应的电泳条带无明显的区别，58和65℃的扩增反应的电泳条带相对较淡(图5)。本试验确定反应的温度为63℃以进行后续试验。

3.6内引物浓度优化

优化的结果表明，内引物用量为0.4μL就有较好的扩增效果，没有引物二聚体现象，说明引物完全反应；1.2μL时就有较亮的扩增条带，而且无引物二聚现象；随着引物的且量增加，扩增的条带越来越亮，直至引物量为2.8、3.2μL扩增条带亮度明显降低，引物二聚体现象严重，出现明显的抑制反应(图6)。本试验确定25pmol/L的内引物FIP、BIP的用量为1.2μL。

3.7时间优化

扩增产物量与扩增时间有直接的关系，扩增时间越久，扩增产物越多，从试验电泳图可以看出，在30min就出现比较明显的条带，随着反就的进行，条带的亮度也越来越亮(图7)。本试验确定最佳反应时间为60min。

3.8环引物浓度优化

由电泳图可以明显看出，不加环引物的对照组的扩增条带明显比其它加环引物的亮度低，但环引物的的用量对反应无太大的影响(图8)。本试验确定12.5pmol/L的环引物的用量为0.8μL。

3.9加环引物最佳反应时间优化

加入环引物与不加环物的反应时间有着明显的区别，加入环引物后只需10min就可以出现明显扩增条带，20min后条带的亮度达到最大及随着反应时间的增加条带的亮度无明显的变化(图9)。本试验确定最佳反应时间为30min。

3.10AMV反转录酶最佳浓度优化

AMV反转录酶的用量直接影响到cDNA的合成，用量太小影响反应DNA的合成，无AMV反转录酶RT-LAMP无法进行，AMV反转录酶的用量越大，扩增的DNA也越大，但由于AMV反转录酶的价格昂贵，本试验确定10U/μL的AMV反转录酶的用量为0.5μL(图10)。

3.11试剂盒

根据上述结构，优选25μL反应体系中：

10mmol/L的dNTPs 2.5μL；

100mmol/L的MgSO₄1.0μL；

5pmol/L的外引物1μL；

50pmol/L的内引物0.6μL；

Bst大片段DNA聚合酶用量大于0.8μL；

5mol/L的甜菜碱3μL；

10U/μL的AMV反转录酶用量0.5μL；

10×T Buffer PH值为8.76，用量为3.0μL。

最佳温度63℃、不加环引物反应时间为60min，加环引物反应时间为30min。

加ddH₂O补足至25μL。

实施例2 特异性实验

一、试验方法

提取TGEV、PEDV、PoRV、CSFV、PRRSV、JEV和PRV的核酸，按实施例1的最优条件进行RT-LAMP检测，检验其特异性，设DEPC处理水作为阴性对照。

二、结果

实验结果如图11～12采用本发明方法检测，只有PEDV才有阳性结果，琼脂糖凝胶电泳呈现梯状条带，反应产物于紫外灯下可见明显的绿色荧光反应，而TGEV、PoRV、PEDV、CSFV、PRRSV、JEV和PRV检测均为阴性，琼脂糖凝胶电泳无梯状条带，反应产物于紫外灯下无绿色荧光反应。

本发明方法只会检出PEDV病毒，不会检出其他病毒，说明本发明引物和试剂盒的特异性强。

实施例3 灵敏度试验

一、试验方法

将所制备的阳性RNA模板用DEPC处理水稀释，分别调整PEDV的RNA浓度为1.5×10⁸copies/μL，将模板10倍梯度稀释，按实施例1的最优条件进行RT-LAMP检测，进行敏感性试验，同时以DEPC处理水作为阴性对照。

二、结果

如图13～14所示，对10倍梯度稀释的阳性RNA模板进行检测表明，1-7泳道均有明显的梯状条带及反应产物在紫外灯下有明显绿色荧光反应，PEDV的RT-LAMP可以检测到10⁷倍稀释的所制备的阳性RNA模板，即15copies/μL的样本。

实验结果说明，采用本发明试剂盒检测PEDV的最低检测浓度为15copies/μL，灵敏度高。

实施例4 临床检测

1、实验方法

取送检的31份腹泻临床病料，按实施例1的最优条件进行RT-LAMP方法进行检测，样品信息见下表：

表2 样品统计表

2、实验结果

如下表3所示：

表3 床样品检测结果

送检地	检测份数	结果P+
			绵阳	5	5
茂县	4	3
			射洪	5	5
蒲江	4	4
			乐山	5	5
大邑	4	4
			安岳	4	0
总数	31	26

31份临床样品中，26份PEDV阳性。

实验结果说明，本发明试剂盒可用于临床检测。

综上，本发明试剂盒可以同时检测猪流行性腹泻病毒，特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

Claims

1.一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO：1~4所示引物，用于环介导等温扩增猪流行性腹泻病毒的基因；

所述试剂盒还包括SEQ ID NO：5~6所示引物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括SEQ ID NO：7所示的基因片段。

3.SEQ ID NO：1~4所示引物在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂中的用途；所述试剂还包括SEQ ID NO：5~6所示引物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述检测猪流行性腹泻病毒的试剂是环介导等温扩增猪流行性腹泻病毒的基因的试剂。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述试剂还包括SEQ ID NO：7所示的基因片段。

6.SEQ ID NO：1~4所示引物在制备环介导等温扩增猪流行性腹泻病毒的基因的试剂中的用途；所述试剂还包括SEQ ID NO：5~6所示引物。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述试剂还包括SEQ ID NO：7所示的基因片段。