CN108950072A - 一种猪流行性腹泻病毒荧光lamp引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种猪流行性腹泻病毒荧光lamp引物组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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曾俊霞
廖秀云
沙才华
罗宝正
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Abstract

本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒荧光LAMP引物组、试剂盒及其检测方法。所述猪流行性腹泻病毒荧光LAMP试剂盒包括2×反应液12.5μL，内引物FIP、BIP 40μmol/L各1.0μL,环引物LF、LB 20μmol/L各1.0μL，外引物F3、B3 5μmol/L各1.0μL，Bst DNA聚合酶0.8μL，逆转录酶0.2μL，荧光染料0.5μL。所述试剂盒的检测方法，包括步骤：1)提取病毒核酸模板；2)将荧光LAMP反应体系与2.0μL的病毒核酸模板混合，补水至25μL，并加入20.0μL的封闭液；3)通过Real‑Time PCR System设定保温阶段63℃30s，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，40个循环；于63℃45s处收集荧光信号。其猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒反应时间比Taqman荧光PCR法可缩短20min以上。

Description

一种猪流行性腹泻病毒荧光LAMP引物组、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种猪流行性腹泻病毒荧光LAMP引物组、试剂盒及其检测方法。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性肠道传染病，以呕吐和水样腹泻为主要特征，各年龄段和各品种的猪均易感，对幼龄仔猪致死率高；PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属，病毒核酸为正义单链RNA，基因组全长约28kb，主要结构蛋白为纤突糖蛋白(S蛋白)、小膜蛋白(E蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)。
该病于1978年在英国首次被报道，后世界各国均有发现。中国于1980年首次报道该病。2010年下半年，PED在中国各地再次大规模暴发，且临床症状较之前严重，仔猪病死率达100％，仅中国南部10省就有过百万头仔猪发病死亡，给养猪业带来重大损失。腹泻流行期间，多数发病猪场都采取了各种防治措施，如选用中国已商品化的PEDV/PGEV二联腹泻苗或国外引进的弱毒疫苗进行疫苗接种，使用各类抗生素或中药制剂对病猪进行药物治疗，采集病猪粪便经处理后进行反饲治疗等，但防治效果均不理想。其次，PEDV与传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、大肠杆菌等肠道感染疾病的临床症状和病理变化相似，只能通过实验室检验进行确诊。
目前，国内外主要通过细胞培养、免疫学和动物实验、分子生物学等方法对病毒进行鉴别诊断，传统的方法存在检测周期长、灵敏度低的缺点，不适用于临床快速诊断和大规模的流行病学调查，而新兴的分子生物学具有灵敏、快捷等特点，在现代动物疫病的流行病学调查和预防中起到了不可替代的关键作用中。2000年，日本学者Notomi在《NucleicAcids Res》公开发表了一种适用于基因诊断的新型恒温核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，受到了WHO和各国的广泛关注。2009年甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学株式会社受WHO委托完成了甲型H1N1流感LAMP试剂盒的研制，通过早期快速诊断对防止该病的快速蔓延起到积极作用。目前，LAMP技术已成功应用于SARS、禽流感、HIV等疾病，也广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫疾病的快速诊断和食品化妆品的快速检测，得到诸多欧美国家的认同。
发明内容
本发明旨在提供提供一种对PEDV灵敏、特异的荧光LAMP引物组。
本发明所采取的技术方案是：
一种猪流行性腹泻病毒荧光LAMP引物组，包括引物FIP、BIP、F3、B3、LF和LB，各引物的序列如SEQ ID№1～6所示。
上述引物组可应用于猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒。
所述猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒，具有LAMP反应体系，包括：
2×反应液12.5μL，内引物FIP和BIP 40μmol/L各1.0μL,环引物LF和LB 20μmol/L各1.0μL，外引物F3和B3 5μmol/L各1.0μL，Bst DNA聚合酶0.8μL，逆转录酶0.2μL，荧光染料0.5μL。
本发明还公开了使用上述猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒的检测方法，包括步骤：
1)提取病毒核酸模板；
2)将LAMP反应体系与2.0μL的病毒核酸模板混合，补水至25μL，并加入20.0μL的封闭液；
3)通过Real-Time PCR System设定保温阶段63℃30s，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，40个循环；于63℃45s处收集荧光信号。
其中，步骤1)所述病毒核酸模板的260/280比值为1.8～2.0，浓度介于200～500ng/μL；步骤2)的LAMP反应体系所使用的荧光染料为SYTO-9。
本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒荧光LAMP引物组、试剂盒及其检测方法。其引物组根据GenBank中PEDV的核苷酸序列而设计，依托于LAMP技术，该方法可使反应时间比Taqman荧光PCR法缩短20min以上，为快速检测提供了技术支持。
附图说明
图1是所述猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒特异性试验结果图。
图2是所述猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒灵敏度试验结果图。
图3是所述猪流行性腹泻病毒荧光LAMP试剂盒对已通过病毒分离确认为猪流行性腹泻病的病猪样本检测结果图。
图4和图5是所述猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒第一次和第二次稳定性试验结果，试验选择稀释浓度为103的猪流行性腹泻病毒质粒作为模板。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1，猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒特异性试验。
猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒包括如下试剂：
LAMP引物组的引物如下所示：
使用上述猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒的检测方法检测其特异性，包括步骤：
1)取猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、口蹄疫病毒(2份)、猪繁殖与呼吸综合症病毒为疫苗毒，猪水疱病病毒和猪水疱性口炎病毒为病毒核酸质粒，7种共8份病毒核酸模板；
2)将LAMP反应体系与2.0μL的病毒核酸模板混合，补水至25μL，并加入20.0μL的封闭液；
3)通过Real-Time PCR System设定保温阶段63℃30s，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，40个循环；于63℃45s处收集荧光信号。
其中，步骤1)所述病毒核酸模板的260/280比值为1.8～2.0，浓度介于200～500ng/μL；步骤2)的LAMP反应体系所使用的荧光染料为SYTO-9。结果如图1所示，2份猪流行性腹泻病毒核酸模板均出现显著扩增曲线，其他病毒核酸模板均未出现扩增曲线。
实施例2，猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒灵敏度试验。
将猪流行性腹泻病毒质粒浓度稀释至109～101作为病毒核酸模板，将上述病毒核酸模板使用实施例1的试剂盒进行检测。结果如图2所示，稀释至109～102的病毒核酸模板均出现显著扩增曲线，稀释至101的病毒核酸模板未出现扩增曲线，表明则该试剂盒灵敏度为102拷贝。
实施例3，猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒实样检测。
取已通过病毒分离确认为猪流行性腹泻病的病猪内脏7份，提取RNA作为病毒核酸模板，将上述病毒核酸模板使用实施例1的试剂盒进行检测。结果如图3所示，7份病猪样本的RNA病毒核酸模板均出现不同程度的显著扩增。
实施例4，猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒稳定性试验。
取猪流行性腹泻病毒合成质粒稀释至103作为病毒核酸模板，分别进行两次试验，对获得的Ct值进行分析。结果如图4和图5所示，每组中20个重复样品出现扩增曲线的Ct值均为18左右，且两组试验结果高度重叠，重复性良好。
SEQUENCE LISTING
<110> 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 一种猪流行性腹泻病毒荧光LAMP引物组、试剂盒及检测方法
<130> 2018
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcctcctctg ttctgagaag cgaggcaaca accagtcc 38
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aataagtctc gtaaccagtc caagaacgca gccaccagat catc 44
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggcaatggc aacaaca 17
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caaagattta agggcatcct tg 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cacgattctg tgaattacca cg 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgaccgtgg tggaatgac 19

Claims (5)

1.一种猪流行性腹泻病毒荧光LAMP引物组，包括引物FIP、BIP、F3、B3、LF和LB，各引物的序列如SEQ ID№1～6所示。
2.一种猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒，包括LAMP反应体系，其特征在于，所述LAMP反应体系包括如权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应体系包括2×反应液12.5μL，内引物FIP和BIP 40μmol/L各1.0μL，环引物LF和LB20μmol/L各1.0μL，外引物F3和B3 5μmol/L各1.0μL，Bst DNA聚合酶0.8μL，逆转录酶0.2μL，荧光染料0.5μL。
4.一种猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测方法，其特征在于，使用如权利要求3所述的试剂盒，包括步骤：
1)提取病毒核酸模板；
2)将LAMP反应体系与2.0μL的病毒核酸模板混合，补水至25μL，并加入20.0μL的封闭液；
3)通过Real-Time PCR System设定保温阶段63℃30s，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，40个循环；于63℃45s处收集荧光信号。
5.根据权利要求4所述的猪流行性腹泻病毒LAMP检测方法，其特征在于，步骤1)所述病毒核酸模板的260/280比值为1.8～2.0，浓度介于200～500ng/μL。
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