CN112063760A

CN112063760A - 一种同时检测鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒的引物探针组合、试剂盒

Info

Publication number: CN112063760A
Application number: CN202011089643.XA
Authority: CN
Inventors: 傅光华; 黄瑜; 程龙飞; 傅秋玲; 刘荣昌; 万春和; 陈红梅; 施少华; 林建生
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-10-13
Filing date: 2020-10-13
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2040-10-13
Also published as: CN112063760B

Abstract

本发明提供了一种同时检测鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒的引物探针组合，属于畜禽疾病诊断技术领域，包括引物对和探针，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针包括鸭圆环病毒探针、鸭瘟病毒探针和鸭3型腺病毒探针，所述鸭圆环病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述鸭瘟病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述鸭3型腺病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。采用本发明提供的引物探针组合能够同时检测出鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒。

Description

一种同时检测鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒的引物探针组合、试剂盒

技术领域

本发明属于畜禽疾病诊断技术领域，尤其涉及一种同时检测鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒的引物探针组合、试剂盒。

背景技术

鸭圆环病毒(duck circovirus，DuCV)是近年来发现的严重影响鸭生长性能及机体免疫应答能力的重要病原。目前已知该病毒在鸭群中广泛存在，不同品种及生长阶段的鸭均可感染。肉鸭感染圆环病毒后多表现为生长迟缓、被毛杂乱，发病鸭比同日龄未感染鸭体重减轻35％以上，临床上还发现鸭圆环病毒检测为阳性的病例，多存在其他病原混合感染的现象。

鸭瘟病毒(Duck plaque virus,DPV)是引起鸭发生鸭瘟的急性、败血性、高度致死性传染病病原。鸭瘟可感染不同品种及日龄的鸭，传播迅速、流行广泛，发病急、死亡率高，是危害养鸭业的主要疫病之一。肉鸭感染后主要表现为体温升高、两腿软弱，下痢，流泪，部分鸭出现头颈肿胀。

鸭3型腺病毒(duck adenovirus 3，DAdV-3)是近年来我国鸭群新出现一种鸭源腺病毒。肉鸭感染后引起实质性脏器尤其是肝脏肿大、局灶性散状出血，脾脏肿大，肾脏肿大、出血。该病发病率20％～50％、病死率40％～60％。

鸭圆环病毒、鸭瘟病毒及鸭3型腺病毒这三种DNA病毒在我国鸭群感染较普遍，且严重阻碍鸭的生长发育，极大降低了鸭肉的产品质量，发病时有较多相似的临床特征和病变特征，容易混淆，易造成误诊，严重损害养殖生产企业的市场竞争力和经济效益。实际生产中迫切需要建立一种快速检测三种DNA病毒的方法以指导临床的疫病诊断和治疗方案制定，从而减少经济损失。目前已有检测鸭圆环病毒、鸭瘟病毒及鸭3型腺病毒的单一PCR方法，鸭圆环病毒、鸭瘟病毒与另外一种病毒的三重PCR检测方法，但尚未见仅用一对引物即可同时检测并区分鸭圆环病毒、鸭瘟病毒及鸭3型腺病毒的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒的引物探针组合、试剂盒，采用本发明提供的引物探针组合能够同时检测出鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种同时检测鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒的引物探针组合，包括引物对和探针，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述探针包括鸭圆环病毒探针、鸭瘟病毒探针和鸭3型腺病毒探针，所述鸭圆环病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述鸭瘟病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述鸭3型腺病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

本发明还提供了一种同时检测鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒的试剂盒，包括鸭圆环病毒Rep蛋白基因质粒、鸭瘟病毒gH蛋白基因质粒、鸭3型腺病毒DNA聚合酶蛋白基因质粒和上述技术方案所述的引物探针组合。

优选的，所述引物对的工作摩尔浓度为0.04～0.8μmol/L。

优选的，所述引物对的工作摩尔浓度为0.2μmol/L。

优选的，所述探针的工作摩尔浓度为0.04～0.4μmol/L。

优选的，所述鸭圆环病毒探针、鸭瘟病毒探针和鸭3型腺病毒探针的工作摩尔浓度比为2～4:1.5～3:1～2。

优选的，所述质粒标准品的浓度为2×10⁵copies/μL。

优选的，所述引物探针组合的使用方法包括：利用上述技术方案所述的引物探针组合对样品进行PCR扩增，经1％凝胶琼脂糖电泳后得到检测结果，当扩增出466bp的片段时，所述样品中含有鸭圆环病毒；当扩增出316bp的片段时，所述样品中含有鸭瘟病毒；当扩增出202bp的片段时，所述样品中含有鸭3型病毒。

优选的，所述PCR扩增的扩增体系每30μL包括以下组分含量：10×DNA连接酶反应缓冲液3μL，DNA连接酶1μL，10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液3μL，Taq DNA聚合酶1μL，浓度为10mmol/L的dNTPs 1μL，浓度为10μmol/L的探针3μL，浓度为10μmol/L的上下游引物各1μL，样品2μL，加去离子水补足至30μL。

优选的，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃ 5min；进入循环95℃ 50s；55℃～63℃ 5～10min；循环6次后进入下一个变温循环95℃ 30s，52℃～56℃ 30s，72℃ 30s进行35个循环，循环结束后于72℃ 10min结束反应。

本发明的有益效果：

与检测鸭圆环病毒的PCR方法、检测鸭瘟病毒的PCR方法、检测鸭3型腺病毒的PCR方法相比，本发明能在一个PCR反应体系和一次PCR反应中同时检测三种病毒，减轻工作量并节省时间。达到快速检测病原的目的。与检测鸭圆环病毒、鸭瘟病毒及其相关的二重或三重PCR检测方法相比，本发明最大的优势在于在PCR扩增阶段工作的引物仅一对，这样最大限度的排除了引物间的相互干扰，避免了因多对引物混合后，引物间的自联而导致PCR扩增效率降低及非特异性扩增的现象。PCR扩增时引物数量的减少极大的保障了PCR扩增的准确性、特异性。

因为双重PCR方法设计时比普通PCR难度更高，必须考虑引物和引物之间、引物本身、产物和产物之间不能有错配，相对而言，双重PCR方法的特异性较差，假阳性或假阴性的概率较大。三重PCR方法对引物设计的要求、PCR反应体系的优化等提出更高的要求。

附图说明

图1为鸭圆环病毒PCR检测结果，M为DNA相对分子质量标准；1为鸭圆环病毒样品；2为阴性对照；

图2为鸭瘟病毒PCR检测，M为DNA相对分子质量标准；1为鸭瘟病毒样品；2为阴性对照；

图3为鸭3型腺病毒PCR检测，M为DNA相对分子质量标准；1为鸭3型腺病毒样品；2为阴性对照；

图4为鸭圆环病毒、鸭瘟病毒及鸭3型腺病毒PCR检测，M为DNA相对分子质量标准；1为鸭圆环病毒、鸭瘟病毒、鸭3型腺病毒混合样品；2为鸭圆环病毒样品；3为鸭瘟病毒样品；4为鸭3型腺病毒样品；5为阴性对照。

具体实施方式

本发明提供了一种同时检测鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒的引物探针组合，包括引物对和探针，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针包括鸭圆环病毒探针、鸭瘟病毒探针和鸭3型腺病毒探针，所述鸭圆环病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述鸭瘟病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述鸭3型腺病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

本发明优选基于鸭圆环病毒Rep蛋白基因、鸭瘟病毒gH蛋白基因和鸭3型腺病毒DNA聚合酶蛋白基因保守序列及绿色荧光蛋白基因序列，设计合成分别针对鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒核酸的3条特异性杂交探针和引物对。本发明设计的探针扩增引物3末端为绿色荧光蛋白基因序列，而且扩增获得的3个探针序列除了两端各20多个核苷酸为相应的病毒基因序列外，中间的序列均为绿色荧光蛋白基因序列。

在本发明中，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

5’-GCA GAA CAC CCC CAT CGG CGA-3’；

所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

5’-GTT CTT CTG CTT GTC GGC CAT G-3’。

在本发明中，所述探针包括鸭圆环病毒探针、鸭瘟病毒探针和鸭3型腺病毒探针，所述鸭圆环病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，加粗的序列为编码绿色荧光蛋白的序列，具体如下：

所述鸭瘟病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，加粗的序列为编码绿色荧光蛋白的序列，具体如下：

所述鸭3型腺病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，加粗的序列为编码绿色荧光蛋白的序列，具体如下：

本发明还提供了一种同时检测鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒的试剂盒，包括鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒的试剂盒，包括鸭圆环病毒Rep蛋白基因质粒、鸭瘟病毒gH蛋白基因质粒、鸭3型腺病毒DNA聚合酶蛋白基因质粒和上述技术方案所述的引物探针组合。

在本发明中，所述质粒标准品的浓度优选为2×10⁵copies/μL。

在本发明中，所述引物对的工作摩尔浓度优选为0.04～0.8μmol/L，更优选为0.2μmol/L。

在本发明中，所述探针的工作摩尔浓度优选为0.04～0.4μmol/L。在本发明中，所述鸭圆环病毒探针、鸭瘟病毒探针和鸭3型腺病毒探针的工作摩尔浓度比优选为2～4:1.5～3:1～2。

在本发明中，所述引物探针组合的使用方法优选包括：利用上述技术方案所述的引物探针组合对样品进行PCR扩增，经1％凝胶琼脂糖电泳后得到检测结果，当扩增出466bp的片段时，所述样品中含有鸭圆环病毒；当扩增出316bp的片段时，所述样品中含有鸭瘟病毒；当扩增出202bp的片段时，所述样品中含有鸭3型病毒。

在本发明中，所述样品优选为应用商品化的病毒核酸(DNA)提取试剂盒对临床上采集的疑似含毒鸭组织、棉拭子样品或含毒尿囊液等材料进行核酸提取获得DNA样品。

在本发明中，所述PCR扩增的扩增体系每30μL优选包括以下组分含量：10×DNA连接酶反应缓冲液3μL，DNA连接酶1μL，10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液3μL，Taq DNA聚合酶1μL，浓度为10mmol/L的dNTPs 1μL，浓度为10μmol/L的探针3μL，浓度为10μmol/L的上下游引物各1μL，样品2μL，加去离子水补足至30μL。在本发明中，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃ 5min；进入循环95℃ 50s；55℃～63℃ 5～10min；循环6次后进入下一个变温循环95℃30s，52℃～56℃ 30s，72℃ 30s进行35个循环，循环结束后于72℃ 10min结束反应。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)杂交探针扩增引物的设计与制备

参照鸭圆环病毒Rep蛋白基因、鸭瘟病毒gH蛋白基因和鸭3型腺病毒DNA聚合酶蛋白基因保守序列及绿色荧光蛋白基因序列，设计了3对用于合成分别针对鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒核酸的3条特异性杂交探针和扩增引物，引物信息见表1，加粗的序列为编码绿色荧光蛋白的序列。以上引物送福州铂尚生物技术有限公司合成后，用无菌超纯水稀释成10μM的浓度，-20℃保存备用。

表1引物信息

(2)杂交探针制备与纯化

以绿色荧光蛋白质粒(pIRES2-EGFP,Takara生物技术有限公司)作为模板，分别用以上3对引物进行扩增。PCR反应体系为50μL：2x Phanta Max Super-Fidelity Buffer 25μL，DNA聚合酶1μL(5u/μL)，dNTP 1μL(10mM)，上、下游引物(10μM)各1μL，模板2μL(100ng)，用去离子水补充体积至50μL。反应程序如下：94℃预变性15min，按95℃ 30s、55℃ 30s、72℃50s进行35个循环，最后72℃延伸10min结束反应，取5μL产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，扩增产物经纯化回收后即可作为病毒核酸特异性杂交探针。为验证这些探针的正确性，可将纯化回收探针克隆进平端克隆载体pEASY-Blunt，送生工上海生物工程有限公司进行测序，3种探针的序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。

实施例2

多病毒PCR检测方法的建立

1.杂交探针检测引物的设计与制备参照杂交探针中绿色荧光蛋白基因序列，设计1对用于检测该杂交探针扩增的反向扩增引物，上游引物为SEQ ID No.1(JC-GFPF):5’-GCAGAA CAC CCC CAT CGG CGA-3’，下游引物为SEQ ID No.2(JC-GFPR):GTT CTT CTG CTT GTCGGC CAT G-3’。应用这对引物进行检测时，鸭圆环病毒应扩增出466bp的特异性片段、鸭瘟病毒316bp的特异性片段和鸭3型腺病毒202bp的特异性片段。

2.鸭圆环病毒的PCR检测取保存的鸭圆环病毒，瞬时离心后，取200μL上清，参照QIAGEN公司病毒DNA提取试剂盒操作说明书提取样品DNA。提取获得的DNA样品用NanoDrop2000超微量分光光度计测定核酸浓度，配成100ng/μL的样品。取上述制备的样品DNA、切胶回收的杂交探针及检测引物进行PCR检测分析。PCR反应体系为30μL：包括10×Taq DNA连接酶反应缓冲液3μL，Taq DNA连接酶0.5μL(5U/μL)，10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液3μL(含Mg²⁺)，Taq DNA聚合酶0.50μL(5U/μL)，dNTPs 1μL(10mM)，检测引物SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2各1μL(浓度10μmol/L)，杂交探针Seq ID No.34pg，样品DNA 200ng或2μL ddH₂O为空白对照，去离子水补足至30μL。反应程序如下：95℃ 15min；95℃ 30s，58℃ 7min循环6次；95℃ 30s，53 30s，72℃ 30s进行35个循环，最后72℃ 10min结束反应。取产物5μL扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳观察扩增结果。空白对照无扩增产物，鸭圆环病毒样品可扩增出466bp的片段(见图1)。

3.鸭瘟病毒的PCR检测取200μL含鸭瘟病毒的鸭胚尿囊液，参照QIAGEN公司病毒DNA提取试剂盒操作说明书提取样品DNA。提取获得的DNA样品测定核酸浓度，稀释成100ng/μL的样品。取制备鸭瘟病毒DNA样品、杂交探针及检测引物进行PCR检测分析。PCR反应体系为30μL：包括3μL Taq DNA连接酶反应缓冲液，0.5μL Taq DNA连接酶，3μL Taq DNA聚合酶反应缓冲液，0.50μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，1μL dNTPs(10mM)，检测引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2各1μL(浓度10μmol/L)，3pg杂交探针SEQ ID No.4，样品DNA 200ng或2μLddH₂O为空白对照，去离子水补足至30μL。反应程序如下：95℃ 15min；95℃ 30s，58℃ 7min循环6次；95℃ 30s，53 30s，72℃ 30s进行35个循环，最后72℃ 10min结束反应。取产物5μL扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳观察扩增结果。空白对照无扩增产物，鸭瘟病毒样品可扩增出316bp的片段(见图2)。

4.鸭3型腺病毒的PCR检测取200μL含鸭3型腺病毒鸭胚尿囊液，参照病毒DNA提取试剂盒操作说明书提取样品DNA。获得的DNA样品测定核酸浓度，稀释成100ng/μL的样品。取制备鸭3型病毒DNA样品、杂交探针及检测引物进行PCR扩增。反应体系为30μL，包括：3μL 10×Taq DNA连接酶反应缓冲液，0.5μL Taq DNA连接酶(5U/μL)，3μL 10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液(含Mg²⁺)，0.50μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，1μL dNTPs(10mM)，检测引物SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2各1μL(浓度10μmol/L)，杂交探针SEQ ID No.52pg，样品DNA 200ng或2μL ddH₂O为空白对照，去离子水补足至30μL。反应程序为：95℃ 15min；95℃ 30s，58℃ 7min循环6次；95℃ 30s，53 30s，72℃ 30s进行35个循环，最后72℃ 10min结束反应。取产物5μL扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳观察扩增结果。空白对照无扩增产物，鸭3型病毒样品可扩增出202bp的片段(见图3)。

5.鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒的PCR检测含鸭圆环病毒鸭胚尿囊液、含鸭瘟病毒鸭胚尿囊液和鸭3型腺病毒鸭胚尿囊液各取200μL，参照QIAGEN公司病毒DNA提取试剂盒操作说明书分别提取病毒DNA核酸。获得的DNA样品测定核酸浓度，稀释成100ng/μL的样品。PCR反应体系为30μL：包括3μL Taq DNA连接酶反应缓冲液,0.5μL Taq DNA连接酶,3μL Taq DNA聚合酶反应缓冲液，0.50μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，1μL dNTPs(10mM)，检测引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2各1μL(浓度10μmol/L)，杂交探针SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5分别取4pg、3pg和2pg，检测模板为鸭圆环病毒、鸭瘟病毒及鸭3型腺病毒核酸样品各200ng或200ng鸭圆环病毒核酸样品或200ng鸭瘟病毒核酸样品或200ng鸭3型腺病毒核酸样品或6μL ddH₂O为空白对照，去离子水补足至30μL。反应程序如下：95℃15min；95℃ 30s，58℃ 7min循环6次；95℃ 30s，53 30s，72℃ 30s进行35个循环，最后72℃10min结束反应。扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳观察扩增结果。空白对照无扩增产物，鸭圆环病毒、鸭瘟病毒及鸭3型腺病毒三种核酸混合样品可扩增出三个片段，大小分别为466bp、316bp和202bp，一种核酸只能扩增出相应大小的片段(见图4)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种同时检测鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒的引物探针组合、试剂盒

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagaacacc cccatcggcg a 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttcttctgc ttgtcggcca tg 22

<210> 3

<211> 190

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcatgcctc atgttcgcgg cagcagcacg gggccgtcgc cgatgggggt gttctgctgg 60

tagtggtcgg cgagctgcac gctgccgtcc tcgatgttgt ggcggatctt gaagttcacc 120

ttgatgccgt tcttctgctt gtcggccatg atatagacgt tgtggctgtt gcggtctagt 180

ctcctagctg 190

<210> 4

<211> 191

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acataaggaa gtacacacag cagcagcacg gggccgtcgc cgatgggggt gttctgctgg 60

tagtggtcgg cgagctgcac gctgccgtcc tcgatgttgt ggcggatctt gaagttcacc 120

ttgatgccgt tcttctgctt gtcggccatg atatagacgt tgtggctgtt gggtaataga 180

ccgctgtcta a 191

<210> 5

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtggcggctg gtacagctga gcagcacggg gccgtcgccg atgggggtgt tctgctggta 60

gtggtcggcg agctgcacgc tgccgtcctc gatgttgtgg cggatcttga agttcacctt 120

gatgccgttc ttctgcttgt cggccatgat atagacgttg tggctgttga gcctggcaag 180

atgctcggt 189

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcatgcctc atgttcgcgg cagcagcacg gggccgt 37

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagctaggag actagaccgc aacagccaca acgtct 36

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acataaggaa gtacacacag cagcagcacg gggccgt 37

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttagacagcg gtctattacc caacagccac aacgtct 37

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtggcggctg gtacagctga gcagcacggg gccgt 35

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

accgagcatc ttgccaggct caacagccac aacgtct 37

Claims

1.一种同时检测鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒的引物探针组合，其特征在于，包括引物对和探针，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

2.一种同时检测鸭圆环病毒、鸭瘟病毒和鸭3型腺病毒的试剂盒，其特征在于，包括鸭圆环病毒Rep蛋白基因质粒、鸭瘟病毒gH蛋白基因质粒、鸭3型腺病毒DNA聚合酶蛋白基因质粒和权利要求1所述的引物探针组合。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的工作摩尔浓度为0.04～0.8μmol/L。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的工作摩尔浓度为0.2μmol/L。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的工作摩尔浓度为0.04～0.4μmol/L。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述鸭圆环病毒探针、鸭瘟病毒探针和鸭3型腺病毒探针的工作摩尔浓度比为2～4:1.5～3:1～2。

7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒标准品的浓度为2×10⁵copies/μL。

8.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合的使用方法包括：利用权利要求1所述的引物探针组合对样品进行PCR扩增，经1％凝胶琼脂糖电泳后得到检测结果，当扩增出466bp的片段时，所述样品中含有鸭圆环病毒；当扩增出316bp的片段时，所述样品中含有鸭瘟病毒；当扩增出202bp的片段时，所述样品中含有鸭3型病毒。

9.根据权利要求8所述的引物探针组合，其特征在于，所述PCR扩增的扩增体系每30μL包括以下组分含量：10×DNA连接酶反应缓冲液3μL，DNA连接酶1μL，10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液3μL，Taq DNA聚合酶1μL，浓度为10mmol/L的dNTPs 1μL，浓度为10μmol/L的探针3μL，浓度为10μmol/L的上下游引物各1μL，样品2μL，加去离子水补足至30μL。

10.根据权利要求8或9所述的引物探针组合，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃5min；进入循环95℃50s；55℃～63℃5～10min；循环6次后进入下一个变温循环95℃30s，52℃～56℃30s，72℃30s进行35个循环，循环结束后于72℃10min结束反应。