CN104611466B - 一种快速鉴别三种仔猪病毒性腹泻的分子试剂盒与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的试剂盒，它包括SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：5～6所示引物对，分别特异扩增猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因。本发明还公开了SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：5～6所示引物对在制备检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的试剂中的用途。本发明检测试剂盒可以准确、有效的检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。

Description

一种快速鉴别三种仔猪病毒性腹泻的分子试剂盒与应用
技术领域
本发明涉及一种检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒的试剂盒。
背景技术
随着集中化养猪的规模日益扩大，猪的腹泻疾病变得日趋严重。而引起仔猪腹泻疾病的病原研究证实有而且还在不断增加大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、温和猪瘟、猪痢疾、猪球虫等。而由猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒引起的仔猪病毒性腹泻疾病日趋增多，该三类疫病能引起仔猪的高发病率和高死亡率，且有部分地区已经呈现出混合感染和继发感染的现象，对养猪业造成了极大的损失。鉴于这三种病毒在生产中对仔猪危害极大，包括我国在内的许多国家和地区为预防和控制这三种主要的腹泻类疫病，投入了大量的人力、物力、财力，但却收效甚微。
由于该三类腹泻类疫病在临床症状及流行趋势上都极其相似，尚无有效疫苗能将疫情控制，因此在临床诊断、治疗，以及防治上有极大的难度。临川症状具体表现在：一般2周龄以内的仔猪感染后12-24小时会出现呕吐，继而出现严重的水样或糊状腹泻，粪便呈黄色，常夹有未消化的凝乳块，恶臭，体重迅速下降，仔猪明显脱水，发病2-7天死亡，死亡率达100％；在2-3周龄的仔猪，死亡率在0-10％；断乳猪感染后2-4天发病，表现水泻，呈喷射状，粪便呈灰色或褐色，个别猪呕吐，在5-8天后腹泻停止，极少死亡，但体重下降，常表现发育不良，成为僵猪；一些耐过猪和呈隐形感染的猪群往往也是带毒猪。
传统的检测这三种疾病的方法如病毒分离鉴定和血清检查，往往耗时过长。最近国外和国内均建立了RT-PCR/PCR检测方法，以及多重PCR检测方法，如，公开号为103409558的专利申请公开了一种同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重PCR引物组，其对PEDV、TGEV、PoRV的最低检测浓度分别为4.75ng/μL、31.1ng/μL、38.625ng/μL。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高的可同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的试剂盒。
本发明检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的试剂盒，它包括SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：5～6所示引物对，分别特异扩增猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因。
其中，所述猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因分别如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
其中，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的基因片段，作为阳性对照。
本发明提供了SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：5～6所示引物对在制备检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的试剂中的用途。
其中，所述检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的试剂是扩增猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因的试剂。
其中，所述猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因分别如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
其中，所述试剂还包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的基因片段，作为阳性对照。
本发明还提供了SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：5～6所示引物对在扩增猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因中的用途。
所述猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因分别如SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
本发明三对引物组成的试剂盒可以有效检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒，三对引物之间无相互干扰，灵敏度高，三种病毒的最低检测浓度低至3.80×10-5pg/μL、8.54×10-5pg/μL、5.59×10-5pg/μL，比现有检测方法的最低检测限低了8个数量级，且特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1重组质粒PGEM T-N和PGEM T-M的PCR鉴定。M为DL2000DNA Marker；1-2泳道依次对应重组质粒分别为：PGEM T-N、PGEM T-M；3、4泳道为阴性对照。
图2重组质粒PGEM T-VP7的PCR鉴定。M为DNA MarkerⅢ；1泳道为阴性对照；2、3泳道为重组质粒PGEM T-VP7。
图3重组质粒PGEM T-N和PGEM T-M酶切鉴定。M为DL2000DNA Marker；1、2泳道依次对应EcoR I酶切的重组质粒PGEM T-N和PGEM T-M。
图4重组质粒PGEM T-VP7酶切鉴定。M为DL2000DNA Marker；1-3泳道对应EcoR I酶切的重组质粒PGEM T-VP7。
图5质粒线性化结果。M为DNA MarkerⅢ；1-3泳道依次对应Nde I酶切的重组质粒分别为：PGEM T-N、PGEM T-M、PGEM T-VP7。.
图6线性化质粒体外转录产物电泳结果。M为DL2000DNA Marker；1-3泳道依次对应：PGEM T-M、PGEM T-VP7、PGEM T-N。
图7转录产物Dnase Ⅰ处理并经酚氯仿抽提结果。M为DL2000DNA Marker；1-3泳道分别为PGEM T-VP7、PGEM T-M、PGEM T-N。
图8PEDV、PoRV、TGEV单重PCR退火温度优化。M为DL2000DNA Marker；1-8泳道依次对应退火温度分别为：53℃、53.5℃、54.4℃、55.8℃、57.5℃、58.8℃、59.6℃、60℃。
图9PEDV、PoRV、TGEV单重PCR引物浓度的优化。M为DL2000DNA Marker；1-4泳道依次对应单重PCR引物浓度分别为：0.5、1.0、1.5、2μL。
图10TGEV、PEDV双重PCR引物浓度优化。M为DL2000DNA Marker；1-7:TGEV引物计量分别为：1μL、1μL、1μL、1μL、1μL、0μL,PEDV引物计量分别为：0.8μL、1.2μL、1.6μL、2.0μL、2.4μL、1μL、0μL.
图11引物浓度对多重PCR反应的影响。M:DL2000DNA Marker；1-8:TGEV引物计量分别为：1μL、1μL、1μL、1μL、1μL、1μL、0μL、0μL,PEDV引物计量分别为：0.8μL、0.8μL、0.8μL、0.8μL、0.8μL、0μL、0.8μL。
图12三重PCR最佳退火温度的优化。M:DL2000DNA Marker；1-8泳道依次对应三重PCR退火温度分别为：53℃、53.5℃、54.4℃、55.8℃、57.5℃、58.8℃、59.6℃、60℃。
图13多重PCR特异性结果。M:DL2000DNA Marker；1-8泳道依次对应特异性试验选用的病毒分别为：PEDV/TGEV/PoRV、TGEV、PEDV、PoRV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV；9泳道为阴性对照。
图14多重RT-PCR敏感性试验。M:DL2000DNA Marker；1-9，RNA阳性样品101-108倍比稀释和阴性样品。
具体实施方式
一、实验材料和仪器
病毒及主要试剂与材料
反转录试剂盒、T7体外转录试剂盒、限制性内切酶Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ、Spe Ⅰ、DNAse Ⅰ等购自大连宝生物有限公司，质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒等购自Omega公司，RNA提取试剂盒、2×PCR Mix(含Taq DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O、MgCl2)、dNTPs、DNA Marker琼脂糖等购自天根生化有限公司，pGEM T-Easy Vector System Ⅰ和AMV反转录酶购自Progema公司，Bst DNA Polymerase(Large Fragment)、10×ThermoPol Buffer、MgSO4等购自NEB公司，甜菜碱购自Sigma公司，Goldenview核酸染料购自北京赛百盛生物有限公司，钙黄绿素荧光染料购自广州迪澳生物科技有限公司，所设计的引物送至上海生物工程有限公司合成，50×TAE。
猪轮状病毒(OUS株)、TGEV、PEDV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、乙型脑炎病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒,购自中国兽药检查所或四川农业大学传染病实验室保存；大肠埃希菌DH5a购自天根生化有限公司。
主要仪器设备
MyCyclerTM PCR仪、POWER Pac TM电泳仪及水平电泳槽、UNIVERSAL HOOD凝胶成像系统、SmartspecTM Plus核酸蛋白仪、移液枪，美国BIO-RAD公司产品；Legend Micro 17Rcentrifuge高速冷冻离心机、恒温振荡培养箱，美国Thermo公司产品；WaterPro Plus超纯水仪，美国LABCONCO公司产品；电子天平，恒温水浴锅。
实施例1本发明试剂盒的制备
1、材料和仪器
同前述实验材料和仪器。
2、实验方法
2.1PCR引物设计
根据猪传染性胃肠炎病毒TGEV的N基因(GenBank登陆号：DQ443743)、猪流行性腹泻病PEDV的M基因(GenBank登陆号：AY974335)、猪轮状病毒PoRV的VP7基因(GenBank登陆号：X04613.1)，按多重PCR引物设计原则，各设计合成一对引物；并设计三对构建阳性质粒的引物，引物由上海生工生物科技有限公司合成。引物合成后为肉眼无法看清干粉状，需经离心机瞬离后，用灭菌超纯水溶解，引物保存浓度100pmol/μL，保存于-20℃,工作浓度用灭菌超纯水将上游引物和下游引物稀释至一个EP管内，终浓度为5pmol/μL。
引物对如下：
PEDV扩增片段(SEQ ID NO：7)：
GGGCATCGGGCAGTGATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTATCTGTGAGAACCGCACTCGGATTACTCACAGCTGAGTAGTCGCCGTGTTTGGACCGGACATAGAAAGCCCAACCAGTGCCAGATGGAGCATTGACTGAACGACCAACACGTCCGTAGACAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCGACTGTGACGAAATTAGGTAATTGACTTACCTGTACGCCAGTAGCAACCTTATAGCCCTCTACAAGCAATGTACCACTAAGGAGTGTTAGCGTTACACCAGTTGGTGCTCCAAGCACTGGAATGCAGACCTGTCGGCCCATCACAGAAGTAGTGAGAAGCGCGTCTGTTTCAGGATTGAAAGACCACCAAGAATGTGTCCTGCGCCACAACCGAATGCTATTGACAAAGTACATTATCCACAGCATAAGAGTGATGCAAGCCATAAGGATGCTGAAAGCAAAAAAGACCCAATTGACCTGAAAGCTAGCCCATGCATCAAAAAGTGACAGTGCTAACACAAGGGGCCAAAGTATCCATAGAATAGCCATCTTGACACCATACAAGAACGCAGAGTACTTGTAATGGCCATACTGAAGCACTACAAGTAGTATCGTCAGTATGATATTCCATGTGAAATTCCAGTTTCTAAGGTGTTGAATCACCTCATCAACGGGAAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGG
TGEV扩增片段(SEQ ID NO：8)：
GGCATCGGGCAGTGATTGTATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTACTCGCTATCGCATGGTGAAGGGCCAACGTAAAGAGCTTCCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTACTTAGGTACTGGACCTCATGCAGATGCCAAATTTAAAGATAAATTAGATGGAGTTGTCTGGGTTGCCAAGGATGGTGCCATGAACAAACCAACCACGCTTGGTAGTCGTGGTGCTAATAATGAATCCAAAGCTTTGAAATTCGATGGTAAAGTGCCAGGCGAATTTCAACTTGAAGTTAATCAATCAAGAGACAATTCAAGGTCACGCTCTCAATCTAGATCTCGGTCTAGAAATAGATCTCAATCTAGAGGCAGGCAACAATTCAATAACAAGAAGGATGACAGTGTAGAACAAGCTGTTCTTGCCGCACTTAAAAAGTTAGGTGTTGACACAGAAAAACAACAGCAACGCTCTCGTTCTAAATCTAAAGAACGTAGTAACTCTAAGACAAGAGATACTACACCTAAGAATGAAAACAAACACACCTGGAAGAGAACTGCAGGTAAAGGTGATGTGACAAGATTTTATGGAGCTAGAAGCAGTTCAGCCAATTTTGGTGACACTGACCTCGTTGCCAATGGGAGCAGTGCCAAGCATTACCCACAACTGGCTGAATGTGTTCCATCTGTGTCTAGCATTCTGTTTGGAAGCTATTGGACTTCAAAGGAAGATGGCGACCAGATAGAAGTCACGTTCACACACAAATACCACTTGCCAAAGGATGATCCTAAGACTGGACAATTCCGTCAGCAGATTAATGCCTATGCTCGTCCATCAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGG
PoRV扩增片段(SEQ ID NO：9)：
AGTGGCGAAGTCGCATGCTCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTTAGTCGTACTTGCACCGCTCATTAAAGCTCAAAATTACGGAATTAATTTACCAATAACTGGATCTATGGATACGCCATATATGGATTCAACTACAAGTGAAACATTTTTGACTTCGACATTATGTCTATATTATCCAAATGAAGCAGCTACAGAAATTGCAGATACAAAATGGACAGAAACATTGTCGCAGTTGTTTTTAACAAAAGGATGGCCAACAGGGTCAGTTTATTTTAAAGGATATGCAGATATTGCGTCATTTTCTGTAGAACCGCAGTTATACTGCGACTATAATATTGTACTAATGAAATATGATGGAAATTTACAGTTAGACATGTCTGAATTGGCTGATTTAATATTGAATGAATGGCTATGTAATCCAATGGATATAATGCTATATTATTATCAGCAAACAGATGAAGCTAATAAATGGATATCAATGGGTACATCATGTACGATTAAAGTATGTCCTCTAAATACGCAGACTCTCGGGATAGGATGTTCGACTACAGAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGG
2.2阳性模板的构建
2.2.1目的片段TA克隆
感受态细胞的制备：将培养至OD600约0.5左右的大肠杆菌DH5α转入50mL无菌离心管，冰浴30min后于4℃2000r/min离心10min，弃上清液，收集的菌体用20mL预先冰浴好的0.1mol/L CaCl2轻轻重悬，冰浴30min后4℃2000r/min离心10min，弃上液清收集菌体；重复上一步；加入2.5mL 0.1mol/L CaCl2轻轻混匀，100μL/管分装于灭菌EP管中，-80℃保存备用。
取本实验室冷冻保存的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒，室温自然解冻后依照总RNA提取试剂盒说明书分别提取3种病毒的总RNA，用RNase-freeddH2O溶解后，将所提取RNA大量反转录成cDNA，剩余的RNA在-80℃保存备用，以防RNA降解。以cDNA为模板，分别用构建阳性质粒的引物经PCR扩增目的片段，扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳，依照胶回收试剂盒(Omega公司)说明书分别回收3种病毒的PCR扩增产物。
将胶回收产物连接包含T7和SP6RNA聚合酶启动子的PGEM-T easy载体，连接体系参照Promega pGEM T-Easy Vector System I说明书反应体系见表1。
表1目的片段连接PGEM-T载体所需的试剂和用量
反应程序为：22℃孵育2h，4℃过夜。
连接产物转化DH5α感受态细胞：取上述所制备DH5α感受态细胞于冰上溶解，加入连接产物于EP管中，轻轻混匀，冰浴30min；将含有连接产物的感受太细胞于42℃热激90s后迅速置于冰上冰浴2～3min；加入600μLLB培养基于EP管中，180r/min振荡培养60min；取100μL菌液涂布于含有100μg/mL Amp的LB平板，37℃过夜培养约16h。
克隆鉴定：从平板中挑取单个菌落于5mL含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，220r/min 37℃振荡培养12h，分别提取质粒，质粒提取步骤参照OMEGA质粒提取试剂盒，取所提取的质粒进行PCR鉴定和质粒酶切鉴定，并将鉴定为阳性模板送生工生物工程(上海)有限公司测序。测序后进行软件分析，确定为所需的目的片段基因后，大量提取的阳性质粒为模板，进行体外转录制作阳性RNA模板。阴性对照的构建，收取电阻率为18.2欧姆的纯化水，加DEPC至终浓度为0.10g/L，充分震荡摇匀，室温处理过夜，高压蒸汽灭菌30min。
2.2.2阳性RNA模板的制备
使用Nde I(Takara CodeNo.1161A)质粒进行线性化处理，反应体系见表2。琼脂糖凝胶电泳鉴定后，使用OMEGA胶回收试剂盒对产物进行胶回收(参照OMEGA胶回收试剂盒提取步骤)。
表2质粒线性化所需的试剂和用量
使用宝生物in vitro Transcription T7Kit(Code No.6140)体外转录试剂盒，20μL反应体系见表3。
表3体外转录所需的试剂和用量
2.2.3RNA的纯化
使用Recombinant DNase I(RNase-free)(Takara Code No.2270A)对转录的RNA进行DNase处理，24μL反应体系见表4。
表4RNA经DNase处理所需的试剂和用量
对上述经DNase处理的反应液进行酚氯仿抽提，加入DEPC水补足至300μL。再加入300μL的苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)。充分混匀后12000r/min离心5min，取上层(水层)移至另一微量1.5mL离心管中。加入300μL的氯仿/异戊醇(24：1)。充分混匀后12000r/min离心5min，取上层(水层)移至另一微量1.5mL离心管中。加入1/10量的3mol/L的NaOAC(pH5.2)，上下颠倒混匀。加入3μL NA Carrier,充分混匀。加入1倍量的异丙醇,充分混匀，冰上放置10min。4℃13000r/min离心20min，用枪吸弃上清，留沉淀(注意不要取到白色沉淀)。加入500μL 80％的冷乙醇清洗沉淀。4℃13000r/min离心5min，用枪吸弃上清，留沉淀。自然干燥。分别溶于16μL RNase-free水中，取1μL进行变性(65℃，10min)后，进行20g/L琼脂糖凝胶电泳。最终溶于50μLRNase-free Water(Takara Code No.9012)，-80℃保存备用。
2.3三重RT-PCR鉴别检测方法的建立
2.3.1cDNA模板的制备
取本实验室冷冻保存的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒，依照总RNA提取试剂盒说明书分别提取3种病毒的总RNA，将所提取RNA大量反转录成cDNA，20μL反应体系试剂及用量(见表5)。
表5RNA反转录所需的试剂和用量
反转录程序为：37℃20min、85℃5s，cDNA经PCR鉴定后小量分装放于-20℃保存备用。
2.3.2单重PCR最佳退火温度的确定
为确定退火温度对反应的影响，以梯度PCR仪自动设置8个温度梯度：53℃、53.5℃、54.4℃、55.8℃、57.5℃、58.8℃、59.6℃、60℃，15μL反应体系试剂及用量(见表6)。
表6PCR所需的试剂和用量
反应程序为：95℃2min，95℃30s，梯度退火温度(53℃、53.5℃、54.4℃、55.8℃、57.5℃、58.8℃、59.6℃、60℃)30s，72℃1min，30个循环，72℃5min，16℃保存，取5μL PCR扩增产物于10g/L的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，多次重复试验后选出各项PCR最佳的退火温度。
2.3.3TGEV、PEDV、PoRV单重PCR引物浓度的确定
为确定引物浓度对PCR产物的影响以及对琼脂糖凝胶电泳中条带亮度对判定的影响，分别对不同浓度的引物进行试验，通过多次重复试验确定最佳单重RT-PCR引物浓度，以确定后续试验进行，15μL反应体系试剂及用量(见表7)。
表7PCR反应体系所需的试剂和用量
反应程序为：95℃2min，95℃30s，退火(以上述优化的最佳退火温度)30s，72℃1min，30个循环，72℃5min，16℃保存，取5μL PCR扩增产物于10g/L的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，多次重复试验后确定引浓度对反应的影响。
2.3.4TGEV、PEDV双重PCR引物浓度的确定
为确定引浓度对双重PCR反应的影响，以评判两对引物能否实现同时扩增，确定后续试验的第三对引物未加入时的反应的状态好差，以及确定要不要进行第三对引物试验。选取TGEV引物浓度1μL，PEDV引物浓度分别为0.8μL、1.2μL、1.6μL、2.0μL、2.4μL，25μL反应体系试剂及用量(见表8)。
表8PCR反应体系所需的试剂和用量
反应程序为：95℃2min，95℃30s，退火(以上述优化的最佳退火温度)30s，72℃1min，30个循环，72℃5min，16℃保存，取5μL PCR扩增产物于10g/L的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，多次重复试验后确定双重PCR引物浓度。
2.3.5三重PCR引物浓度的确定
以优化好的双重PCR的引物浓度为基础，优化PoRV引物浓度，反应体系试剂及用量(见表9)。
表9PCR反应体系所需的试剂和用量
2.3.6三重PCR最佳退火温度的确定
以PCR仪自动设置8个温度梯度：53℃、53.5℃、54.4℃、55.8℃、57.5℃、58.8℃、59.6℃、60℃，25μL反应体系试剂及用量见表10。
表10PCR反应体系所需的试剂和用量
3、实验结果
3.1TGEV、PEDV、PoRV目的片段TA克隆
质粒阳性DNA模板制备结果：将提取的质粒进行PCR反应鉴定，结果可以扩增出目的片段(图1、图2)；因为在PGEM-T easy载体两端有两个EcoR I酶切位点，用EcoR I做单酶切过夜，可以把连接的目的片段切下来，单酶切结果表明能切出与目的片段大小相当的片段(图3、图4),成功构建重组阳性质粒模板。
3.2TGEV、PEDV、PoRV阳性RNA模板的制备结果
使用Nde I对构建的转录质粒进行线性化(图5)，线性化的质粒经切胶回收，体外转录合成RNA，转录产物RNA琼脂糖凝胶电泳显示有明显目的条带(图6)，对转录产物进行Dnase Ⅰ处理后琼脂糖凝胶电泳显示有明显目的条带，且无其它非目的片段(图7)。
实验结果说明，本发明三对引物可以分别扩增TGEV、PEDV、PoRV的基因，得到特异性目标条带，而不会扩增其他条带。
3.3单重PCR最佳退火温度的确定
PCR仪自动设置8个温度梯度：53℃、53.5℃、54.4℃、55.8℃、57.5℃、58.8℃、59.6℃、60℃都可以有较好扩增结果，结果表明退火温度对本试验PEDV、PoRV的PCR影响较小，各个温度下都有较好的扩增，但退火温度对TGEV的PCR影响稍大(图8)。
综合三个退火温度的影响，本发明退火温度优选为57.5℃。
3.4最佳引物浓度的确定
3.4.1TGEV、PEDV、PoRV单重PCR引物浓度的确定
0.5、1.0、1.5、2μL引物都可以扩增出明显的条带，随着引物量增加到1.0μL时，扩增目的片段的亮度不变，最下面的引物二聚体的亮度增加(图9)，说明本试验引物增加1.0μL就可以扩增出明显的结果，由于反应试剂的原料有限或者随着引物浓度增加易形成引物二聚体。
本发明选择引物的用量优选为1.0μL。
3.4.2TGEV、PEDV双重PCR引物浓度的确定
试验结果表明25μL反应体系可以进行TGEV、PEDV双重PCR反应可以扩增出明显两个目的片段(图10)，本试验初步选择PEDV引物用量0.8μL，TGEV引物用量1.0μL。
3.4.3TGEV、PEDV、PoRV三重PCR引物浓度的确定
由于在三重PCR条件优化过程中发现，PEDV扩增的目的片段最亮，而TGEV、PoRV扩增的目的片段较淡，在多次试验后怀疑可能是因为反应体系的dNTPs此原料不够(图11)。因为PEDV引物扩增的片段短，引物扩增效率较其它引物高，扩增出的目的片段总是比其它目的片段的条带亮，确定后减少PEDV引物的用量至0.8μL。而试验结果也表明，随着加入dNTPs的量增加，三个引物都可以扩增出较亮的目的片段。本试验选择加入1.5μL dNTPs为dNTPs最佳添加量。由凝胶电泳图可知，各个引物浓度都可以扩增出较好的检测结果，本试验选择三个引物浓度为PEDV引物用量为0.8μL、PoRV引物用量为1.2μL、TGEV引物用量为1.0μL。
3.4.4TGEV、PEDV、PoRV三重PCR最佳退火温度的确定
PCR仪自动设置8个温度梯度：53℃、53.5℃、54.4℃、55.8℃、57.5℃、58.8℃、59.6℃、60℃，在所优化25μL反应体系中都可以扩增出较好的结果(图12)，本试验选择最佳的退火温度为57.5℃。
综上，本发明三重PCR的最佳反应体系如表10所示，最佳反应条件：95℃2min，95℃30s，退火温度58.8℃30s，72℃1min，30个循环，72℃5min，16℃保存。
表10三重PCR所需的试剂和用量
实验结果说明，本发明设计的三对引物可以特异扩增扩增TGEV、PEDV、PoRV的目标条带，且不会相互影响。
实施例2特异性实验
一、试验方法
分别抽提TGEV、PEDV、PoRV、CSFV、PRRSV、JEV和PRV等病毒RNA或DNA，采用实施例1的三对引物扩增，同时以DEPC处理水作为空白对照。以验证本发明基因芯片和试剂盒的特异性。
反应条件：95℃2min，95℃30s，退火温度58.8℃30s，72℃1min，30个循环，72℃5min，16℃保存。
反应体系如下：
二、结果
实验结果如图13所示，采用本发明方法检测，PEDV、TGEV、PoRV检测结果呈阳性，其它病毒的的检测结果均呈阴性。
本发明方法只会检出本发明3种病毒，不会检出其他病毒，说明本发明试剂盒的特异性强。
实施例4灵敏度试验
一、试验方法
分别调整TGEV、PEDV、PoRV的RNA拷贝数为1.5×108copies/μL，将三种模板混匀后10倍梯度稀释，按反转录试剂盒(宝生物)说明书反转录成cDNA采用实施例1的三对引物扩增，同时以DEPC处理水作为空白对照。
反应条件：95℃2min，95℃30s，退火温度58.8℃30s，72℃1min，30个循环，72℃5min，16℃保存。
反应体系如下：
二、结果
结果如图14所示，对10倍梯度稀释的阳性RNA模板进行检测表明，1-4泳道均可看到有目的条带，可以检测到104倍稀释的所制备的阳性RNA模板，即浓度为1.5×104copies/μL的样本。
实验结果说明，采用本发明试剂盒检测，PEDV、TGEV、PoRV的最低检测浓度为1.5×104copies/μL，即浓度分别为3.80×10-5pg/μL、8.54×10-5pg/μL、5.59×10-5pg/μL，灵敏度高。
实施例4临床检测
1、实验方法
取送检的31份腹泻临床病料，按实施例1的最优条件进行RT-LAMP方法进行检测，样品信息见下表：
表11样品统计表
2、实验结果
如下表3所示：
表122014-2015年部分临床样品检测结果
140份临床样品中，4份TGEV阳性，119份PEDV阳性，3份PoRV阳性。
实验结果说明，本发明试剂盒可用于临床检测。
综上，本发明试剂盒可以同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒，特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

Claims (6)

1.一种检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：5～6所示引物对，分别特异扩增猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因；
所述猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因分别如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示；
所述试剂盒为PCR扩增用试剂盒，包含的试剂和用量如下表：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9所示的基因片段。
3.SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：5～6所示引物对在制备检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的试剂中的用途；所述猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因分别如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的试剂是扩增猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因的试剂。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述试剂还包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的基因片段。
6.SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4和SEQ ID NO：5～6所示引物对在制备扩增猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因的试剂中的用途；所述猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的基因分别如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQID NO：9所示。
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