CN103409558B - 用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重pcr引物组 - Google Patents
用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重pcr引物组 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一套用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重PCR引物组。本发明的引物组由三对引物组成，其中，用于猪流行性腹泻病毒检测的引物序列为SEQ？ID？NO：1和2所示；用于猪传染性胃肠炎病毒检测的引物序列为SEQ？ID？NO：3和4所示；用于猪轮状病毒检测的引物序列为SEQ？ID？NO：5和6所示。应用本发明引物序列通过多重PCR方法可同时对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的不同毒株进行检测，结果均为阳性，而对其他常见猪源病毒检测结果均为阴性，说明本发明的引物组特异性强、重复性好；对病毒cDNA梯度稀释后进行PCR检测，说明该引物灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及一套检测病毒的引物，尤其涉及一套用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重PCR引物组，属于病毒检测领域。
背景技术
流行性腹泻病毒（PEDV）是猪流行性腹泻(PED)的病原体。主要危害仔猪，患病哺乳仔猪出现水样腹泻和呕吐症状，新生仔猪感染后常发生严重失水和死亡，断奶猪和育肥猪患病后出现4～6天水样腹泻，康复后生长发育受到影响，育肥后期体重出现减损。由于该病病程短，传播快，致使该病在我国以及世界各国的传播非常广泛，每年都造成严重的经济损失。
传染性胃肠炎病毒（TGEV）是猪传染性胃肠炎(TGE)的病原体。各种年龄及品种的猪对本病均易感，患猪主要表现为呕吐、水样腹泻、脱水，尤其是仔猪（2周龄以下）致死率高达100%。由于该病病程短，传播快，致使该病在我国以及世界各国的传播非常广泛，每年都造成严重的经济损失。
轮状病毒（RV）是轮状病毒病的病原体，轮状病毒病是一种流行广泛的人畜共患病，主要感染幼龄动物的急性肠道传染病，以腹泻和脱水为主要特征，仔猪死亡率可达50%。
目前在我国，猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原体，同时经常存在一种以上疾病的并发感染，给我国畜牧生产带来了巨大的经济损失，因此，迫切需要建立一种快速有效，并且能同时针对三种病原体进行检测的方法。
当前检测PEDV、TGEV、RV的常用的方法主要包括：病毒分离鉴定法，免疫荧光检测法，酶联免疫吸附实验（ELISA）等方法。
病毒分离鉴定法可通过流行病学、病变和症状做初步判断，进一步确诊需要实验室分离培养鉴定病毒，分离鉴定病毒一般可采用乳猪接种试验和细胞培养两种方法。该方法是目前较为通用的方法，其特点是准确、操作简单，但是需要时间较长，且结果误差较大，人力物力花费较大，不能满足实际应用中快速检测的需要。免疫荧光检测法，通过荧光素标记二抗的结合，将信号进行放大，通过荧光显微镜观察鉴定，这在一定程度上提高了检测的灵敏度，但是免疫荧光法中常因为荧光抗体不够稳定，且判定主观性较强，易出现交叉反应，同时，有需要荧光显微镜等特殊设备所以应用时有许多局限性。ELISA法是是当前应用最广泛的一种免疫学检测方法，可以做定性或半定量检测的快速检测方法，已发展了间接ELISA、双抗体夹心ELISA、竞争ELISA和阻断ELISA等，虽然在一定程度上缩短了检测时间，但仍然需要专门的仪器(如酶标仪)，操作过程仍较复杂。
PCR检测技术是通过设计PEDV、TGEV、RV基因组上保守序列的引物，再通过PCR反应进行基因扩增，再进行检测，该检测方法具有灵敏度高，结果可靠，操作简单，检测快速，不受环境因素影响等优点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一套可用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重PCR检测引物组。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
本发明的一套用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重PCR引物组，其特征在于：所述引物组由三对引物组成，其中，用于猪流行性腹泻病毒检测的引物序列分别为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；用于猪传染性胃肠炎病毒检测的引物序列分别为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示；用于猪轮状病毒检测的引物序列分别为SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。
在本发明引物组中，设计合成了一对针对PEDVS基因的引物，分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，扩增片段大小约为750bp，通过特性实验表明：
1.使用该对引物对猪流行性腹泻病毒进行检测，具有较高的特异性，与引起仔猪病毒性腹泻的常见病原体猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒均无交叉反应。
2.使用该对引物对猪流行性腹泻病毒进行检测，具有很好的可重复性，对于LJB-03，SCSZ-1两株不同来源的PEDV都可以被很好的检出。
3.使用该对引物对猪流行性腹泻病毒进行检测，检测灵敏性高，最小核酸检出量为4.75ng/μL。
在本发明引物组中，设计合成了一对针对TGEVS基因的引物，分别如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，扩增片段大小约500bp，通过特性实验表明：
1.使用该对引物对猪传染性胃肠炎病毒进行检测，具有较高的特异性，与引起仔猪病毒性腹泻的常见病原体猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒和伪狂犬病毒均无交叉反应。
2.使用该对引物对猪传染性胃肠炎病毒进行检测，具有很好的可重复性，对于SCZY-1，TH-98两株不同来源的TGEV都可以被很好的检出。
3.使用该对引物对猪传染性胃肠炎病毒进行检测，检测灵敏性高，最小核酸检出量为31.1ng/μL。
在本发明引物组中，设计合成了一对针对RVVP6基因的引物，分别如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示，扩增片段大小约250bp，通过特性实验表明：
1.使用该对引物对猪轮状病毒进行检测，具有较高的特异性，与引起仔猪病毒性腹泻的常见病原体猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒和伪狂犬病毒均无交叉反应。
2.使用该对引物对猪轮状病毒进行检测，具有很好的可重复性，对于JL94，SL-1两株不同来源的PRV都可以被很好的检出。
3.使用该对引物对猪轮状病毒进行检测，检测灵敏性高，最小核酸检出量为38.625ng/μL。
同时，本发明还提出了一种用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于包含本发明所述的引物组。
进一步的，本发明还提供了所述的引物组在制备检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒试剂中应用。及
所述的试剂盒在制备检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒试剂中应用。
更进一步的，本发明提供了一种检测样品中PEDV、TGEV和RV的多重PCR检测方法，分别针对PEDVS基因、TGEVS基因和RVVP6基因的保守区段设计引物，其中，用于猪流行性腹泻病毒检测的引物序列分别为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；用于猪传染性胃肠炎病毒检测的引物序列分别为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示；用于猪轮状病毒检测的引物序列分别为SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。当样品中有PEDV存在时可扩增片段大小为750bp，当样品中存在TGEV时，可扩增片段大小约为500bp，当样品中存在RV时，可扩增片段大小约为250bp，结果如图1所示。
本发明与目前常见检测方法比较具有下列优点:
本发明根据PEDVS基因保守序列设计了一对PCR检测PEDV病原的特异性引物，该对引物对PEDV具有较好的检出效果，与其他引起仔猪病毒性腹泻的病原体无交叉反应。
本发明根据TGEVS基因保守序列设计了一对PCR检测PEDV病原的特异性引物，该对引物对TGEV具有较好的检出效果，与其他引起仔猪病毒性腹泻的病原体无交叉反应。
本发明根据RVVP6基因保守序列设计了一对PCR检测PEDV病原的特异性引物，该对引物对RV具有较好的检出效果，与其他引起仔猪病毒性腹泻的病原体无交叉反应。
本发明在PEDV、TGEV和RV的PCR检测基础上建立了多重PCR检测方法，经试验验证，该检测方法具有灵敏性高，特异性好，可重复性强的特点。
本发明建立的多重RT-PCR检测方法，与传统的检测方法相比较，具有操作简单，检测快速，灵敏性高的特点。
附图说明
图1为采用本发明的多重PCR方法对PEDV、TGEV、PRV进行检测的结果；
M：dM2000；1：PEDV细胞培养物；2：TGEV细胞培养物；3：PRV细胞培养物；4：PEDV、TGEV混合细胞培养物；5：PEDV、PRV混合细胞培养物；6：TGEV、PRV混合细胞培养物；7：PEDV、TGEV、PRV混合细胞培养物；
图2为采用本发明的多重PCR方法对PEDV进行灵敏性检测的试验结果；
M：dM2000；1：PEDV；2：2倍稀释；3：22倍稀释；4：23倍稀释；5：24倍稀释；6：25倍稀释；7：26倍稀释；8：27倍稀释；9：28倍稀释；10：29倍稀释；
检测最大稀释倍数为26，检测的最小病毒核酸检出量为4.75ng/μL;
图3为采用本发明的多重PCR方法对TGEV进行灵敏性检测的试验结果；
M：dM2000；1：TGEV；2：2倍稀释；3：22倍稀释；4：23倍稀释；5：24倍稀释;
检测最大稀释倍数为24，检测的最小病毒核酸检出量为31.1ng/μL；
图4为采用本发明的多重PCR方法对PRV进行灵敏性检测的试验结果；
M：dM2000；1：PRV；2：2倍稀释；3：22倍稀释；4：23倍稀释；5：24倍稀释；6：25倍稀释;
检测最大稀释倍数为24，检测的最小病毒核酸检出量为38.625ng/μL；
图5为本发明的多重PCR方法的重复性实验结果；
M：dM2000；1：PEDVLJB-03株；2：PEDVSCSZ-1株；3：水对照；4：TGEVTH-98株；5：TGEVSCZY-1株；6：水对照；7：PRVJL-94株；8：PRVSL-1株；9：水对照；
图6为本发明的PEDV检测引物的特异性试验结果；
M：dM2000；1：猪流行性腹泻病毒；2：猪传染性胃肠炎病毒；3：猪轮状病毒；4：猪瘟病毒；5：伪狂犬病毒；
图7为本发明的TGEV检测引物的特异性试验结果；
M：dM2000；1：猪传染性胃肠炎病毒；2：猪流行性腹泻病毒；3：猪轮状病毒；4：猪瘟病毒；5：伪狂犬病毒；
图8为本发明的PRV检测引物的特异性试验结果。
M：dM2000；1：猪轮状病毒；2：猪流行性腹泻病毒；3：猪传染性胃肠炎病毒；4：猪瘟病毒；5：伪狂犬病毒
具体实施方式
下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围之内。
实施例1
1材料和方法
1.1病毒株
PEDVSCSZ-1株(来自四川华派生物制药责任有限公司猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗)、PEDVLJB-03株(由本实验室分离，保存)，TGEVSCZY-1株(来自四川华派生物制药责任有限公司猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗)、TGEVTH-98株(由本实验室分离，保存)和RVSL-1株(来自四川华派生物制药责任有限公司猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗)、JL94株(由本实验室分离，保存)。
1.2主要试剂
Trizol购自Invitrogen(中国)有限公司；反转录酶MLV，购自Prombga（北京）有限公司；RNA酶抑制剂RRI购自宝生物（大连）有限公司；rTaq酶，购自宝生物（大连）有限公司。
1.3引物设计
分别针对PEDVS基因、TGEVS基因和RVVP6基因的保守区段设计引物，引物均由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。序列见表1。
表1多重PCR引物序列
1.4多重PCR方法建立
以PEDVSCSZ-1株，TGEVSCZY-1株和RVSL-1株的cDNA混合物作为多重PCR的模板，建立多重PCR方法。
1.4.1反转录
首先通过Trizol--哥伦仿共同萃取病毒RNA，以提取的病毒RNA为模板，进行反转录，反应体系为：模板7.5μL，Oligo（DT）1μL，去离子水3.5μL，Buffer4μL，dNTP2μL，RRI1μL，MLV1μL，42℃反应2h，70℃作用15min，获得模板cDNA。
1.4.2PCR反应
将获得cDNA为模板进行扩增，反应体系20μL：模板3μL，Buffer2.5μL，dNTP（2.5mM）2μL，PEDV、TGEV和PRV引物10pmol/mL各0.5μL，TaqPCR聚合酶1μL，去离子水8.5μL。反应条件：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环。
1.4.3琼脂糖凝胶电泳
将PCR反应产物与6倍LoadingBuffer混均后在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，结果如图1所示。当样品中有PEDV存在时，在750bp附近出现特异性条带，当样品中有TGEV存在时，在500bp附近出现特异性条带，当样品中有PRV存在时，在250bp附近出现特异性条带。
1.5本发明多重PCR的灵敏性实验
分别测定PEDV，TGEV和RV的模板浓度后，2倍梯度稀释，测定该多重PCR方法的敏感性。
结果：以本发明建立的多重PCR方法针对PEDVS基因的最小病毒核酸检出量为4.75ng/μL，如图2所示；本发明针对TGEVS基因最小病毒核酸检出量为31.1ng/μL，如图3所示；针对PVVP6基因的最小核酸检出量为38.625ng/μL，如图4所示。
1.6本发明多重PCR的重复性试验：
本研究针对PEDVSCSZ-1株、LJB-03株，TGEVSCZY-1株、TH-98株和RVSL-1株、JL94株进行检测，结果表明本发明建立的检测方法针PEDV、TGEV、PRV不同毒株均有较好的检出效果，结果如图5所示。
1.7本发明多重PCR的特异性实验
以本发明建立的多重PCR检测方法分别单独对PEDV、TGEV、RV进行检测，检测结果只有单一的特异性条带；以本发明建立的多重PCR检测方法对PEDV、TGEV、RV病毒混合溶液进行检测，检测结果为三条特异性条带，如图1所示。
以本发明建立的多重PCR检测方法对猪瘟病毒、伪狂犬病毒进行检测，检测结果均未出现条带，表明该检测方法不与其他猪源病毒发生交叉反应，表明该方法具良好特异性，结果如图6-8所示。
Claims (4)
1.一套用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重PCR引物组，其特征在于：所述引物组由三对引物组成，其中，用于猪流行性腹泻病毒检测的引物序列为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；用于猪传染性胃肠炎病毒检测的引物序列为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示；用于猪轮状病毒检测的引物序列为SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。
2.一种用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的引物组。
3.权利要求1所述的引物组在制备检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒试剂中的应用。
4.权利要求2所述的试剂盒在制备检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒试剂中的应用。
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