CN106350607B - 一种检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途。该试剂盒包括一对引物和一条特异性荧光探针，所述引物的序列如SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明的试剂盒能够特异性检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株，可定性和定量，并具有较高的抗溶血、防污染、灵敏度，广泛性强，重复性优，可精准评估和诊断母猪猪流行性腹泻病毒带毒排毒、仔猪感染情况，还可开展猪流行性腹泻疫苗的效果评估，具有十分广泛的应用价值。同时该试剂盒检测过程简便，需要仪器设备简单，检测时间短；结果相对可靠，不易污染；技术操作要求低，可以在基层大量推广；可以相对容易质量控制，易于标准化。

Description

一种检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株的Taqman实时 荧光PCR试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)可以引起猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)，一种高度接触性肠道传染病，主要临床症状是引起哺乳仔猪腹泻、呕吐、脱水、高发病率和高死亡率，其它日龄猪群主要表现为一过性腹泻，死亡率低。PEDV属于冠状病毒科冠状病毒亚科α冠状病毒属，病毒形态略呈球形，在粪便中则呈多形性。PEDV粒子与其他冠状病毒属的病毒粒子十分相似，有囊膜，囊膜上具有花瓣状纤突，由核心像四周发散，其间距较大且排列规则，呈皇冠状。PEDV基因组为不分节段的单股正链RNA。病毒基因组长为28,000-33,000nt。截止目前为止，所有的PEDV毒株均属于同一个血清型。
PEDV与传染性胃肠炎临床症状相似，无法区别，PEDV对细胞系适应性差，分离难度很大，细胞培养不易出现细胞病变，很难分离和培养。
现有技术检测PEDV的方法包括血清学诊断方法和分子生物学方法，血清学诊断方法包括以下方法：(1)免疫荧光法：试验研究表明，直接免疫荧光法检测病料中的PEDV是一种快速可靠的特异性诊断方法。崔现兰等建立的PEDV免疫荧光诊断方法发现，免疫荧光的检出率是91.4％，而间接免疫荧光为89％。林志雄等运用已适应病毒生长的易感细胞Vero等细胞增殖的PEDV建立的直接免疫荧光法与哈兽研所建立的荧光抗体方法进行同步实验，比较分析后发现这两种方法均有较高的准确性和良好的特异性，并且不和TGEV等其他病原体发生交叉反应。然而该方法因为样品采集的限制，不能很好的运用于早期的疾病确诊。(2)微量血清中和试验：微量血清中和试验是利用病毒与特异性抗体结合，从而检测鉴定样品中是否含有特定病毒。林志雄等人运用该原理，使用PK-15细胞作为指示细胞，用已适应易感细胞生长的PEDV，建立了PEDV微量中和试验，其结果可靠，具有良好的敏感性和特异性，可用于PEDV的流行病学调查，但PEDV对细胞的适应性较差，难分离和培养。(3)酶联免疫吸附试验(ELISA)：ELISA法是一种应用十分广泛的免疫学检测手段。其中ELISA法最大的优点就是能够直接从粪便等样品中检测出PEDV抗原，甚至可以应用于患病猪早期的诊断。但目前商品化的PEDV抗体的ELISA试剂盒尚无广泛的应用，主要是因为未选取最适合的基因片段和最佳的表达方法。(4)间接血凝试验(IHA)：用细胞培养的猪流行腹泻病毒致敏红细胞，建立了IHA诊断猪流行腹泻病法，并用IFAT法进行了比较，检测了病愈后20天以上的93份猪血清，两者的阳性检出率分别为50.43％和89.25％，IFAT法比IHA法更敏感。(5)胶体金抗体检测技术：张利勃将葡萄球菌蛋白A(SPA)，以指示媒体，以PEDV M蛋白抗原和抗SPA包自制的抗血清包被在硝酸纤维素膜(NCM)用作测试线和控制线，从而制备检测猪流行性腹泻病毒血清抗体的快速诊断测试条，参考ELISA法和诊断试纸的结果，两者的符合率为在96％。说明该检测技术高效，经济方便，适合基层防疫检疫人员检测PEDV，但其敏感性低，外界干扰较大，易存在漏检等。
而分子生物学方法一般用做病原检测，包括以下方法：(1)聚合酶链式反应检测技术(PCR)：现采用是PCR方法来检测PEDV为实验室诊断方法首选。曾珑针对PEDV和TGEV的基因片段设计了两对特异性引物，建立了双重RT-PCR检测方法，可同时鉴别诊断PEDV与TGEV，该方法灵敏度高，特异性好，重复性好。然而常规RT-PCR存在着一些不足，容易出现假阳性或者假阴性，为最后结果的判断带来影响。PCR技术大大提高PEDV诊断的敏感性和特异性，但是与实时荧光定量PCR相比，PCR方法灵敏性相对不足，操作过程中也相对易污染。(2)实时荧光定量PCR技术：1995年美国Perkin Elmer公司研制出新的实时荧光定量PCR(qPCR)从而一举解决了常规PCR的诸多不足之外，使技术得到更新和发展从而广泛地应用于临床以及其它相关核酸的研究。近几年发展起来的实时荧光定量PCR将PCR与荧光检测方法相结合，具有结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点。
但是上述血清学检测技术存在以下缺点：(1)对猪群中存在的免疫耐受，野毒和免疫区别等现象评估较难，相对不能更加有效、直观和高精准反映猪群的抗体水平。(2)血样采集过程相对比较费时、复杂。原因在于：①血清学检测方法是抗原和抗体反应，仅检测1次无法准确判断猪群的感染状况和排毒状况；②血清学检测抗体，检测的抗体水平高低无法定量检测分析，血清学仅能评价机体体液免疫产生的水平；③血清学评估猪群健康度、对无症状带毒和免疫耐受的猪群评估存在技术上的瓶颈；④血清学需要采集前腔静脉血，血样采集相对费力、费时、且需要特殊设备辅助，多人协助。
而分子诊断普通PCR方法也存在以下缺点：(1)需要复杂的仪器设备：核酸提取仪器、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统和分析软件。(2)操作复杂操作时间长：需要提取核酸、PCR试剂配置、PCR反应、电泳、凝集成像、分析结果等，做一次病原检测需要近一天时间。(3)结果相对不可靠：操作过程极易形成气溶胶，导致环境污染，即使是国内权威的实验室检测结果都存在假阳性结果。(4)技术操作要求高：很难在基层推广，猪场配备了设备但是没有人和时间使用。(5)对溶血样品抗干扰能力差，影响扩增效果，(6)灵敏度相对较低与荧光PCR相比，且无法定量。
猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质。采用从仔猪脐带血中检测PEDV来评价母猪猪流行腹泻的带毒排毒情况，仔猪在胚胎时是否已感染流行性腹泻病毒，可定量分析和开展腹泻的疾病预警，更加科学、直接有效。在规模化猪场出现疑似猪流行性腹泻的疫情后，目前通常诊断方法是送检患病猪的病料，包括患猪肠道淋巴结、肠道内容物和新鲜粪便，利用普通PCR方法进行检测，根据检测结果，结合该猪场其他情况给出诊断报告并制定疫病防控计划。但是由于脐带血样品采集和运输过程中极易溶血，而溶血对PCR扩增影响极大，且目前临床所用PCR方法引物、探针的敏感性和特异性不一致，常规实验室环境污染严重，直接影响检测结果，进而影响PEDV的疾病防控。
虽然qPCR可以克服以上问题，但由于qPCR敏感度高，核酸提取过程易形成气溶胶，极易出现假阳性，另外由于PEDV属于RNA病毒极易发生变异，血样品中存在溶血，而溶血严重影响qPCR的检测效果，如何筛选更加敏感和特异的引物和探针以及扩增技术，从而解决以上问题，是本发明研究的重点。
另外在实际生产中，快速精准检测脐带血中的猪流行性腹泻病毒野毒株难度相对很大，PEDV野毒株对细胞的适应性较低，无产生明显细胞的病变，病毒分离难度大，而且猪流行性腹泻病毒临床症状与猪传染性胃肠炎(TGEV)病毒一样，不易区分，对于疾病的诊断和防控，需要建立一种快速鉴别诊断脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株的方法，不仅可以克服脐带血溶血的干扰，而且可以对母猪PEDV疫苗株的安全评价，母猪PEDV带毒排毒及仔猪在胚胎感染情况的快速准确诊断，PEDV疾病预警和防控及时制定防控计划，具有十分重要的临床意义。因此，亟待建立一种可以精准检测猪脐带血猪流行性腹泻病毒野毒株的方法。
发明内容
本发明的目的在于提出一种检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途。该试剂盒具有抗溶血、防污染、灵敏度高、特异性好、重复性优、检测结果快速客观准确等优点，能精准的评估和诊断母猪猪流行性腹泻病毒带毒和排毒状况，同时可以诊断仔猪PEDV感染的情况和风险，另外，也可以评估母猪猪流行性腹泻疫苗的免疫效果，侧面反映母猪的健康状况水平，有益于对群体猪流行性腹泻疫苗评估、诊断和疾病的早期预警评判，进一步有助于猪场做好该疾病的预警、防控工作。
基于上述目的，本发明提供的一种检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：
上游扩增引物：5’-GCGTAGTTGAGATTGTTG-3’，其为SEQ ID NO:1序列；
下游扩增引物：5’-CCACGATTCTGTGAATTAC-3’，其为SEQ ID NO:2序列；
特异性荧光探针：FAM-5’-ACCTGTTGTTGCCATTARCCACG-3’-TARMAN，其为SEQ IDNO:3序列，其中，R为A或G，FAM为荧光报告基因，TARMAN为荧光淬灭基因。
合理的引物设计和荧光探针设计是成功应用实时荧光PCR技术的关键。引物和探针的特异性对反应有很大影响，如果引物和探针特异性不高，可能在扩增构成中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。
利用本发明的引物和探针建立的实时荧光PCR方法能鉴别猪脐带血中的猪流行性腹泻病毒疫苗株和野毒株。采用实时荧光PCR方法鉴别猪脐带血中的猪流行性腹泻病毒疫苗株和野毒株，关键是需要针对两者所存在的序列差异片段，设计得到特异性的引物和探针。
PEDV野毒株对细胞的适应性较低，无产生明显细胞的病变，病毒分离难度大；PEDV临床症状与TGEV病毒一样，不易区分，对于疾病的诊断和防控，需要建立一种快速鉴别诊断PEDV的方法。但是PEDV病毒属于冠状病毒科，属于单股正链RNA病毒，近些年来PEDV病毒已发生变异，所以设计检测范围更广泛、特异性更强的引物和探针难度很大。发明人经研究发现，不同PEDV野毒株的N基因同源性很高，均在95％以上，而其他冠状病毒的同源性则差异较大。故选择在N基因设计引物和探针，考虑毒株的差异广泛性设计兼并碱基扩增，增大该检测方法的广泛性和特异性，根据NCBI已公布的所有的PEDV基因序列，设计2对引物和探针进行实验和对比。根据扩增结果最终筛选得到本发明的引物和探针，该引物和探针的广泛性和特异性强，用于扩增PEDV N基因，检测结果并能特异性区分PEDV与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。
本发明引物和探针设计在PEDV N基因上，参考NCBI已公布的猪流行性腹泻病毒的N基因设计引物和探针，该引物和探针含有兼并碱基，因此该引物和探针的广泛性和特异性强，用于扩增N基因，检测结果能特异性检测PEDV，并能够特异性区分PEDV与TGEV、RV等病毒。
另外，结合猪胎盘的生理结构，猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质，即使母源抗体(如IgG，12nm)都不能通过此胎盘屏障，所以成熟的PEDV粒子很难直接穿越胎盘屏障感染胎儿，也是一道天然的保护屏障。
总之，采用从仔猪脐带血中检测PEDV-N基因，解决来评价母猪猪流行性腹泻野毒带毒和排毒状况，仔猪在母体内感染状况和反馈母猪的健康状况，评价母猪PEDV疫苗的免疫效果等，是一种更加科学、直接和有效的诊断猪流行性腹泻疾病、评估猪流行性腹泻疫苗保护力水平和疾病预警方面的方法之一，在规模化猪场的猪流行性腹泻病毒病防控过程中起到更加可靠的技术支撑。
在本发明中，优选的，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为3:3:4。
在本发明中，优选的，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针在所述试剂盒中的终浓度均为0.3～0.5μM。
在本发明中，优选的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、2×荧光定量Mixture。
在本发明中，优选的，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O；所述阳性对照为含有猪流行性腹泻病毒N基因序列的克隆质粒pEASY-T1-PEDV-N，克隆质粒pEASY-T1-PEDV-N的终浓度为1.0×105copies/μl～1.0×107copies/μl。
在本发明中，优选的，所述猪流行性腹泻病毒N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在本发明中，优选的，所述克隆质粒采用以下方法制备得到：利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列扩增猪流行性腹泻病毒N基因序列，猪流行性腹泻病毒N基因序列酶切后与pEASY-T1载体连接，筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-T1-PEDV-N。
进一步的，本发明还提供了所述的检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)使用所述的实时荧光PCR试剂盒进行PCR扩增时，实时荧光PCR反应体系以20μL计为：
0.3μM的SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物：0.6μL；
0.3μM的SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物：0.6μL；
0.2μM的SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针：0.8μL；
2×荧光定量Mixture：10μL；
RNA模板：2μL；
ddH2O：补足至20μL；
PCR的反应条件为：95℃预变性1min；94℃变性15Sec，60℃退火20Sec，62℃延伸2sec，收集荧光，共45个循环；然后25℃延伸10sec，最后4℃保护，结束反应；
(2)结果分析：
根据扩增结果判定：阴性对照扩增无Ct值，阳性对照扩增Ct值≤36时，则结果判定成立；Ct值≤40，则判断为猪流行性腹泻病毒阳性；无Ct值显示，则判断为猪流行性腹泻病毒阴性，猪流行性腹泻病毒疫苗免疫成功。
在PCR反应体系中加入2×荧光定量Mixture，其包括UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等。
在本发明中，优选的，所述RNA模板采用以下方法制备得到：
(1)取50-100mg猪脐带血置1.5ml匀浆器中，加入1ml裂解液充分匀浆，室温静置5min；
所述裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS 0.1-0.2％；③吐温20 1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2％；
(2)加入0.6ml异丙醇和10μL磁珠，振荡15s，静置2min；
(3)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；
(4)加入0.5ml异丙醇，将EP管中液体轻轻混匀，室温静置10min；
(5)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；
(6)加入1ml质量百分比浓度为70％的乙醇溶液，轻轻洗涤沉淀；将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；
(7)晾干，加入适量的DEPC H2O溶解，56℃促溶10～15min；
(8)快速电泳检测RNA完整性。
本发明在核酸提取环节中，使用盐酸胍、SDS、吐温－20，NP－40，异丙醇和质量百分比浓度为70％的乙醇溶液等洗涤，可以有效降低去除溶血的干扰，获得高质量的核酸。
更进一步的，本发明还提供了所述的试剂盒在制备检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒的Taqman实时荧光PCR试剂中的用途。
本发明应用qPCR方法检测猪流行性腹泻的工作原理：由于猪属于上皮绒毛胎盘，母猪和胎儿独立血液循环系统，之间存在血胎盘屏障的缘故，正常的“脐带血”是不含病原体和抗体物质的即无存在任何各种病原的相关的基因片段，因此可通过检测“脐带血”中是否存在猪PEDV来判断带毒不发病母猪的情况，评价母猪的免疫水平及带毒情况，评估仔猪感染猪PEDV情况。具体步骤为：(1)样品采集；(2)样品处理；(3)RNA提取；(4)qPCR：利用本发明设计的特异性引物和探针进行qPCR反应；(5)判定结果。与现有技术相比，本发明的试剂盒具有以下有益效果：
(1)采用本发明设计的引物和探针所建立的实时荧光PCR方法可对仔猪脐带血中的猪流行性腹泻病毒野毒感染情况做诊断，从而可以评价母猪猪流行性腹泻疫苗的保护力，而且可以预测和预警仔猪感染猪流行性腹泻病毒野毒的状况，为疾病防控提供有效的科学依据。
(2)本发明的的实时荧光PCR方法更能直接，有效、综合评价疫苗免疫母猪后的效果，与传统的血清学抗体检测评估相比更具有优势，该法也是血清学抗体评估疫苗效果的有效的补充，是非常好的疫苗评估质量、免疫效果和免疫程序优化的有力工具，可进一步推广和临床应用。
(3)使用本发明的的实时荧光PCR方法进行仔猪脐带血检测，即可鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株和猪流行性腹泻病毒疫苗株，根据鉴别结果制定相应的防控策略，最终达到最终净化该病的目的。
(4)本发明的实时荧光PCR方法具有特异性强、灵敏度高、广泛性强、可重复性好等优点。该方法检测过程中需要仪器设备相对简单，不需要电泳仪、凝胶成像系统及其分析软件；检测过程简便，检测时间短，做一次病原检测仅需要3小时；结果相对可靠，不需要电泳，空气中气溶胶相对较少，不易污染；技术操作要求低，可以在基层大量推广；可以相对容易质量控制，易于标准化。
附图说明
图1为本发明检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株的流程图；
图2为本发明样品中模板RNA的非变性琼脂糖电泳图；其中，M：Marker，泳道1-6：样品中模板RNA；
图3为本发明不同退火温度下猪流行性腹泻病毒N基因的扩增效率图；
图4为本发明阳性对照10倍稀释的梯度标准曲线；
图5为本发明敏感性检测结果图；
图6为本发明特异性检测结果图；
图7为本发明重复性检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1
本发明检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株的流程图如图1所示。具体包括以下步骤：(1)样品采集；(2)样品处理；(3)RNA提取；(4)qPCR：利用本发明设计的特异性引物和探针进行qPCR反应；(5)判定结果。
1.样品采集
(1)脐带血样品采集
a.取干净的青霉素瓶和瓶塞，清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用；
b.当仔猪出生时，将每头母猪分娩的所有仔猪的“脐带血”都挤到一个干净的青霉素瓶中，每头仔猪3-5滴即可，将其“脐带血”挤到青霉素瓶，密封；
注意事项：①必须要采集同窝母猪产的所有的仔猪，避免同窝母猪所产仔猪的个体差异造成漏检；②可以双人操作，也可以单独操作，若仔猪脐带血不便挤出，可以将脐带剪成几段再操作即可；③若母猪分娩出现木乃伊，死胎时，同窝仔猪脐带血重点检测；④弱仔的脐带血可以另外单独再收集一份，重点检测；
c.脐带血收集完后盖好瓶塞，用标签纸或者医用白胶布在青霉素瓶做好标记，注明采集时间、母猪耳号、胎次等信息；
d.将收集的脐带血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷冻保存，送至实验室检测，并附上采集脐带血样品的数量、母猪耳号、需要检测项目的清单。
(2)病料样品(扁桃体、肾脏、肺脏和淋巴结等)
A、剖解取内脏：将患病猪剖解，取出完整的上述内脏，放置在同一个干净塑料袋内。
B、记录：将装有内脏的塑料袋密封，贴标签并记录发病猪的日龄、体重、品种、临床症状等信息。
C、将采集的病料样品集中送至实验室，并附上所记录的信息。
2.样品中模板RNA提取
模板RNA提取按商业试剂盒说明书操作，具体步骤如下：
(1)取50-100mg猪脐带血置1.5ml匀浆器中，加入1ml裂解液充分匀浆，室温静置5min；
裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS，其在裂解液中的质量分数为0.1-0.2％；③吐温20，其在裂解液中的质量分数为1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的质量分数为1-2％；
(2)加入0.6ml异丙醇和10μL磁珠(购自赛默飞公司)，振荡15s，静置2min；
(3)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；
(4)加入0.5ml异丙醇，将EP管中液体轻轻混匀，室温静置10min；
(5)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；
(6)加入1ml质量百分比浓度为70％的乙醇溶液，轻轻洗涤沉淀；将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；
(7)晾干，加入适量的DEPC H2O溶解(56℃促溶10～15min)；
(8)快速电泳检测RNA完整性。
本发明在RNA提取环节中，使用盐酸胍、SDS、吐温－20，NP－40，异丙醇和质量百分比浓度为70％的乙醇溶液等洗涤，可以有效降低去除溶血的干扰，获得高质量的核酸。
依据上述方法提取6份随机脐带血样品总RNA，RNA经非变性琼脂糖电泳后均能形成3条清晰条带，分别为28S、18S与5.8/5S，条带间拖带不明显，不见明显蛋白和DNA污染，表明RNA提取完整，结果见图2。
RNA经核酸蛋白检测仪检测，浓度均能达到0.126μg/μl以上，A260/A280比值均在1.9-2.0之间，表明RNA纯度高、完整性好，具体数据见表1。
表1 RNA质量检测结果
样品编号 体积(μl) 浓度(μg/μl) 总量(μg) A260/A280 质量评价
001 50 0.164 8.2 1.92 合格
002 50 0.151 7.6 1.96 合格
003 50 0.167 8.4 1.99 合格
004 50 0.291 14.6 1.96 合格
005 50 0.226 11.3 1.94 合格
006 50 0.126 6.3 1.93 合格
3.引物和荧光探针的的筛选
采用实时荧光PCR方法检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株，其中引物和探针设计是关键。PEDV临床症状与TGEV病毒一样，不易区分，同时PEDV病毒属于冠状病毒科，属于单股正链RNA病毒，近些年来PEDV病毒已发生变异，所以设计检测范围更广泛、特异性更强的引物和探针难度很大。发明人根据NCBI已公布的所有的PEDV基因序列设计以下引物和探针进行对比，见表2。
表2
Figure BDA0001119827110000111
根据扩增结果进行比较分析，最终选择F1-1、R1-1引物，探针最终确定为P1-3。采用第一组引物和探针序列扩增猪流行性腹泻病毒N基因序列的荧光曲线和敏感性更佳。因此，最终筛选到的特异性引物和特异性荧光探针序列如下：
上游扩增引物：5’-GCGTAGTTGAGATTGTTG-3’(SEQ ID NO:1)；
下游扩增引物：5’-CCACGATTCTGTGAATTAC-3’(SEQ ID NO:2)；
特异性荧光探针：FAM-5’-ACCTGTTGTTGCCATTARCCACG-3’-TARMAN(SEQ ID NO:3)，其中，R为A或G，FAM为荧光报告基因，TARMAN为荧光淬灭基因。
上述引物和特异性荧光探针由华大基因合成并进行标记，用于扩增猪流行性腹泻病毒N基因序列，目的片段为148bp左右，猪流行性腹泻病毒N基因的核苷酸序列如下所示。
GTAGTTGAGATTGTTGAACCTAACACACCTCCTGCTTCACGTACAAATTCGCGTAGCAGGAGTCGTGGCAATGGCAACAACAGGTCCAGATCTCCGAGTAACAACAGAGGCAACAACCAGTCCCGTGGTAATTCACAGAATCGTGGAA(SEQ ID NO:4)。
接着，发明人对F1-1、R1-1引物的扩增效率进行试验，采用不同的退火温度，52℃退火、56℃退火、60℃退火，扩增结果见图3。根据扩增结果，选择60℃退火，该温度下退火，F1-1、R1-1引物的扩增效率最高。
4.阳性对照质粒的构建与制备
(1)按照商业试剂盒操作说明书提取猪流行性腹泻病毒RNA；以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2作为特异性引物扩增猪流行性腹泻病毒N基因序列，反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性15Sec，60℃退火2Sec，62℃延伸20Sec，共45个循环；然后25℃延伸10sec，最后4℃保护，结束反应。PCR产物于2％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；
(2)PCR产物的纯化、克隆及序列分析：PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA GelExcraction Kit胶回收试剂盒回收，然后酶切后与同样酶切的pEASY-T1克隆载体进行连接，连接后转化Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培养基平板上，37℃培养12h-18h。经蓝白斑筛选后，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit 1质粒提取试剂盒提取质粒，然后用引物进行扩增和测序，测序后比对成功的克隆质粒命名pEASY-T1-PEDV-N。
克隆质粒用质粒小提试剂盒进行提纯，获得定量标准质粒。根据蛋白核酸测定仪测定A260和A280值计算质粒浓度，并换算为质粒拷贝数，克隆质粒终浓度为1.0×105copies/μl～1.0×107copies/μl。
5.本发明试剂盒的成分
上游扩增引物：5’-GCGTAGTTGAGATTGTTG-3’(SEQ ID NO:1)；
下游扩增引物：5’-CCACGATTCTGTGAATTAC-3’(SEQ ID NO:2)；
特异性荧光探针：FAM-5’-ACCTGTTGTTGCCATTARCCACG-3’-TARMAN(SEQ ID NO:3)，其中，R为A或G，FAM为荧光报告基因，TARMAN为荧光淬灭基因。
阳性对照：含有猪流行性腹泻病毒N基因序列的克隆质粒pEASY-T1-PEDV-N；
阴性对照：无DNA酶的ddH2O；
2×荧光定量Mixture(含UNG酶系统)。
6.标准曲线的制作
对克隆质粒进行10倍梯度稀释，使其为：108-101copies/μl，每个梯度重复三次进行实时荧光定量PCR。根据扩增结果制作标准曲线。图4为本发明阳性对照10倍稀释的梯度制作标准曲线图，其中该标准曲线的参数如下：斜率：-3.27301，截距：43.57488，相关系数：-0.99758，扩增效率：1.02083。制作标准曲线的相关系数R2大于0.99，斜率位于-3.2－-3.3之间，PCR扩增效率E位于1.0－1.1之间。
7.检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒病毒野毒株
本发明的实时荧光PCR反应体系和实时荧光PCR的反应条件如下：
(1)实时荧光PCR反应体系以20μL计为：
0.3μM的SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物：0.6μL；
0.3μM的SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物：0.6μL；
0.4μM的SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针：0.8μL；
2×荧光定量Mixture(含UNG酶系统)：10μL；
RNA模板：2μL；
ddH2O：补足至20μL。
同时设有阳性对照和阴性对照，阳性对照克隆质粒：2μL，其余组分相同；阴性对照无DNA酶的ddH2O：2μL，其余组分相同。
在PCR反应体系中加入2×荧光定量Mixture，其包括UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等。
(2)实时荧光PCR的反应条件
95℃预变性1min；94℃变性15Sec，60℃退火20Sec，62℃延伸20Sec，收集荧光，共45个循环；然后25℃延伸10Sec，最后4℃保护，结束反应。
8.结果分析：
根据扩增结果判定：每次试验的过程都要加入阳性对照及阴性对照。在阴性对照扩增无Ct值，阳性对照扩增Ct值≤36时，则结果判定成立，即阳性结果出现典型的扩增曲线；并且制作的标准曲线如图4所示，R2大于0.99，斜率位于-3.2－-3.3之间，PCR扩增效率E位于1.0－1.1之间。
若Ct值≤40，则判断为猪流行性腹泻病毒阳性，即仔猪脐带血中感染猪流行性腹泻病毒野毒，表明母猪存在排毒现象，疫苗保护力存在一定不足，建议加强免疫接种或调整免疫程序；若无Ct值显示，则判断为猪流行性腹泻病毒阴性，即仔猪脐带血中没有感染猪流行性腹泻病毒，表明猪流行性腹泻疫苗免疫母猪保护力很好，且仔猪无感染猪流行性腹泻病毒，疫苗免疫效果和免疫程序很到位。若阳性对照Ct值>36或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。
实施例2灵敏度研究
以阳性对照克隆质粒评价本发明的试剂盒的灵敏度，将克隆质粒进行10倍梯度稀释，检测范围为108-101copies/μl。结果表明，该方法的检测范围为108-101copies/μl，在此范围的猪流行性腹泻病毒含量可以得到可靠的结果，即该方法的灵敏度可以检测到10个拷贝的猪流行性腹泻病毒病毒含量的样品。检测结果见图5。
实施例3特异性研究
为了检测本发明试剂盒的特异性，利用本发明的试剂盒检测蓝耳经典株，猪细小病毒，猪轮状病毒，猪传染性胃肠炎病毒，猪圆环病毒，猪伪狂犬病毒，乙型脑炎，猪瘟病毒等8种病毒。
检测结果表明：本发明的试剂盒仅对仔猪脐带血中猪流行性腹泻病毒进行扩增，表明本发明试剂盒能特异性扩增猪流行性腹泻病毒，而不与其它核酸发生交叉反应。检测结果见图6。
实施例4重复性研究
选用阳性对照克隆质粒106、105、104个copies/μl,对每个浓度的样本做3个重复，结果不同核酸浓度的检测Ct值标准差≤0.22和≤0.05，变异系数≤0.16％，具有较好的重复性。检测结果见表3和图7。
表3实时荧光PCR检测猪流行性腹泻病毒的重复性试验
质粒拷贝数(copies/μl) 10<sup>6</sup> 10<sup>5</sup> 10<sup>4</sup>
Ct1 23.98 27.62 31.06
Ct2 24.4 27.58 31.04
Ct3 24.1 27.67 31.13
Ct mean 24.16 27.62 31.08
SD 0.22 0.05 0.05
CV 0.90％ 0.16％ 0.15％
实施例5准确性研究
同时采用本发明的试剂盒以及普通PCR对各10份已知阳性和阴性样品进行检测以及对未知的临床98份仔猪脐带血进行检测，检测结果见表4和表5。
(1)已知阳性和阴性样品各10份的临床验证
表4采用本发明试剂盒以及普通PCR对临床样品进行检测结果的比较
方法 本发明试剂盒 普通PCR
10份阳性样品 10份阳性 10份阳性
10份阴性样品 10份阴性 10份阴性
(2)未知的临床98份脐带血检测结果
表5采用本发明试剂盒以及普通PCR对临床样品进行检测结果的比较
Figure BDA0001119827110000151
从表4和表5中可以看出：本发明实时荧光PCR检测阳性样品与普通PCR检测阳性样品的结果100％符合，但实时荧光PCR检测比普通PCR检测更敏感，且临床症状表现是一致的。
实施例6脐带血评估母猪PEDV疫苗效果
某1000头母猪场，接种商品的流行性腹泻灭活苗，产前接种2次间隔2周，二免2周后，随机采集20份脐带血评估本场PEDV疫苗的效果，采用该试剂盒检测，设立阴阳性对照均成立，但在脐带血中检测到3份PEDV病毒存在，表明该疫苗与母猪作用后不能有效的阻断母猪的垂直传播，同时预示仔猪可能在胚胎时期已感染了PEDV，进一步表明该疫苗保护力存在一定不足，需要重视。
综上可见，本发明设计的一对特异性引物和一条荧光探针以及构成的试剂盒可以快速检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株，并能鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗株和野毒株，同时能与猪传染性胃肠炎病毒区分开来，而且该检测方法简单、快速、特异性好、灵敏度高、可重复性好，检测结果真实可靠。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0001119827110000171

Claims (8)

1.检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒在制备检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂中的用途，其特征在于，所述试剂盒包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：
上游扩增引物：5’-GCGTAGTTGAGATTGTTG-3’，其为SEQ ID NO:1序列；
下游扩增引物：5’-CCACGATTCTGTGAATTAC-3’，其为SEQ ID NO:2序列；
特异性荧光探针：FAM-5’-ACCTGTTGTTGCCATTARCCACG-3’-TAMARA，其为SEQ ID NO:3序列，其中，R为A或G，FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因；
该试剂盒的检测结果能鉴别猪脐带血中的猪流行性腹泻病毒疫苗株和野毒株，并能够特异性区分PEDV与TGEV、RV病毒；
猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株的RNA模板采用以下方法制备得到：
(1)取50-100mg猪脐带血置1.5ml匀浆器中，加入1ml裂解液充分匀浆，室温静置5min；
所述裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS0.1-0.2％；③吐温20 1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP401-2％；
(2)加入0.6ml异丙醇和10μL磁珠，振荡15s，静置2min；
(3)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；
(4)加入0.5ml异丙醇，将EP管中液体轻轻混匀，室温静置10min；
(5)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；
(6)加入1ml质量百分比浓度为70％的乙醇溶液，轻轻洗涤沉淀；将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；
(7)晾干，加入适量的DEPC H2O溶解，56℃促溶10～15min；
(8)快速电泳检测RNA完整性。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为3:3:4。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针在所述试剂盒中的终浓度均为0.3～0.5μM。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、2×荧光定量Mixture。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O；所述阳性对照为含有猪流行性腹泻病毒N基因序列的克隆质粒pEASY-T1-PEDV-N，克隆质粒pEASY-T1-PEDV-N的终浓度为1.0×105copies/μl～1.0×107copies/μl。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述克隆质粒采用以下方法制备得到：利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列扩增猪流行性腹泻病毒N基因序列，猪流行性腹泻病毒N基因序列酶切后与pEASY-T1载体连接，筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-T1-PEDV-N。
8.根据权利要求1-7任一项所述的用途，其特征在于，使用方法包括以下步骤：
(1)使用实时荧光PCR试剂盒进行PCR扩增时，实时荧光PCR反应体系以20μL计为：
0.3μM的SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物：0.6μL；
0.3μM的SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物：0.6μL；
0.2μM的SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针：0.8μL；
2×荧光定量Mixture：10μL；
RNA模板：2μL；
ddH2O：补足至20μL；
PCR的反应条件为：95℃预变性1min；94℃变性15Sec，60℃退火20Sec，62℃延伸2sec，收集荧光，共45个循环；然后25℃延伸10sec，最后4℃保护，结束反应；
(2)结果分析：
根据扩增结果判定：阴性对照扩增无Ct值，阳性对照扩增Ct值≤36时，则结果判定成立；Ct值≤40，则判断为猪流行性腹泻病毒阳性；无Ct值显示，则判断为猪流行性腹泻病毒阴性，猪流行性腹泻病毒疫苗免疫成功。
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