CN110373501A - 一种基于免疫磁球的猪流行性腹泻病毒快速检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于免疫磁球的猪流行性腹泻病毒快速检测试剂盒，属于生物领域，该试剂盒包括有：免疫磁球，洗涤液，无菌无核酶水，标准阳性对照样品，检测引物，Real time RT‑PCR反应液；其中的免疫磁球表面具有PEDV膜蛋白特异性多克隆抗体。本发明利用表面（羧基化）修饰的磁球和抗PEDV膜蛋白M特异性兔源多克隆抗体制备了免疫磁球，能够特异性结合粪便、组织等多种样品中的PEDV病原，以免疫磁球‑病原复合物直接作为模板，进行Real time RT‑PCR检测，简化了实验操作步骤并节省了检测时间。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种适用于猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染临床样品的快速检测试剂盒。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(poreine epidemic diarrhea virus，PEDV ) 是引起猪流行性腹泻（PED）的病原。PEDV属于尼多病毒目(Nidovirales)，冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavirus)。PED是一种高度接触性肠道传染病，可通过粪便及污染饮水、饲料和环境迅速散播，病猪的主要特征为病猪腹泻、呕吐和脱水，不同年龄阶段的猪均可感染发病，对哺乳仔猪具有高致死率。目前的流行病学研究表明，PEDV已经遍及全球，亚洲的爆发频率不断增加，尤其是在养猪业较为发达的中国，给养猪业带来巨大损失。对临床上患PED猪样品中病毒的准确、快速检测，是PEDV有效防控以及PEDV流行病学研究的必要环节。
引起猪腹泻的病原较多，并且临床症状和病理变化相似，实验室检测是鉴别 PEDV与其他病原可靠途径。目前，常用的病原学实验室检测方法包括免疫电镜观察、免疫组织化学、免疫荧光试验（IF）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、环介导的恒温扩增技术（LAMP）及聚合酶链反应（RT-PCR）等，这些方法能够准确的诊断出PEDV，但操作复杂、耗时较长，对低病毒含量样本容易漏诊。胶体金免疫层技术相对于 RT-PCR 和 ELISA具有快速检测的特点，但准确性较低。实时定量PCR（Real time RT-PCR）方法，具有灵敏、快速和无需进行核酸电泳操作等优点，近年来得到广泛应用。然而，该方法仍然无法克服样品前处理以及核酸提取等复杂操作过程，对低病原含量样品扔存在漏检的风险。因此，建立操作简单，快速，准确性高，能有效检测低病原含量样本的检测方法是PEDV检测方法研发的致力方向。
免疫磁球在病原检测和分离等多种领域得到应用。在病原分离和检测的应用中，首先利用抗体或亲和因子包被磁球获得免疫磁球，然后结合磁球在磁场作用下可定向运动的特性以及抗原、抗体（亲和因子）特异性结合的特性，实现目的抗原的特异性富集和分离，最终实现病原的高效、快速检测。免疫磁球的应用有效简化了病原检测操作流程，能高效富集和分离病原，提高低病原含量样本检测率。同时，鉴于免疫磁球富集病原的单一性，可获得纯净的磁球-病原复合物，从而可省去基因提取等复杂操作，实现病原一步法检测，提高检测效率。
发明内容
本发明提供一种适用于低PEDV含量的活体猪排泄物样品一步检测的试剂盒。
本发明技术方案如下：一种基于免疫磁球的猪流行性腹泻病毒快速检测试剂盒，该试剂盒包括有：免疫磁球，洗涤液，无菌无核酶水，标准阳性对照样品，检测引物，Realtime RT-PCR反应液；其中的免疫磁球表面具有PEDV膜蛋白特异性多克隆抗体，该试剂盒的检测引物，是PEDV核酸特异性引物，核苷酸序列为：
进一步的，所述洗涤液，是由无菌DEPC水配制的pH 7.4的PBS缓冲液，用于洗涤与样品孵育后的磁球。
进一步的，所述无菌无核酶水，是DEPC处理后的去离子水，用于重悬洗涤后的磁球和配制Real time RT-PCR工作液。
进一步的，所述标准阳性对照样品，是热灭活的PEDV细胞传代毒，作为检测参照。
进一步的，所述Real time RT-PCR反应液，是2×储存液，包括反转录酶，DNA聚合酶，dNTPs，Tris-HCl，KCl，MgCl2和SYBR Green荧光染料。
进一步的，所述免疫磁球制备过程如下：用EDC和NHS活化带有羧基表面的Fe2O3磁珠，加入5倍质量浓度的抗M蛋白IgG抗体，通过氨基和羧基的羧和反应，将IgG抗体连到磁球表面，用牛血清白蛋白封闭后收集磁球，重悬于PBS中备用
常规RT-PCR方法检测临床样品需要抽提待检测样品的核酸，存在耗时、费用高，易污染，并且容易漏检低病原含量样品的不足，不利于PEDV的高效、快速和准确检测。
本发明是用于猪流行性腹泻病毒(PEDV)一步法快速检测PEDV的实时反转录聚合酶链反应（Real time RT-PCR）试剂盒，包括能够捕获并富集猪流行性腹泻病毒的免疫磁球。
首先，通过重组的PEDV 膜（M）蛋白免疫兔（新西兰大白兔），纯化IgG，获得高滴度抗M蛋白多克隆IgG抗体，将获得的多克隆IgG抗体与含有羧基表面的纳米磁球通过羧基与氨基的缩合反应偶联，获得功能性免疫磁球；然后，利用免疫磁球的PEDV捕获和富集功能，结合Real time RT-PCR方法快速、灵敏的特征，建立了PEDV快速检测试剂盒。
与常规方法相比，本发明所述试剂盒无需核酸提取操作，有效避免了大量样品同时提取基因时的交叉污染，缩短了样品检测时间，提高了检测敏感性，并适用于活体猪排泄物内PEDV的检测。通过PEDV分离毒株有限稀释后检测结果表明，该方法适合于低病原含量样品检测。田间样品检测结果证实，本发明所述试剂盒可快速、准确的检测粪便、组织样品中存在的PEDV，适合用于疑似PEDV感染临床样品的快速检测。
本发明试剂盒的结果判定，当标准阳性对照样品Ct值小于35时，检测操作成立；无模板对照Ct值大于35检测试验成立；当样品Ct值小于等于35时为PEDV病原阳性，表明PEDV感染；当样品Ct值大于35时为PEDV病原阴性，未有PEDV感染。
本发明利用表面（羧基化）修饰的磁球和抗PEDV膜蛋白M特异性兔源多克隆抗体制备了免疫磁球，能够特异性结合粪便、组织等多种样品中的PEDV病原，以免疫磁球-病原复合物直接作为模板，进行Real time RT-PCR检测，简化了实验操作步骤并节省了检测时间。与常规Real time RT-PCR方法比较发现，基于免疫磁球的Real time RT-PCR方法的检测敏感性提高了10倍。对临床样品检测证实，基于免疫磁球的Real time RT-PCR方法的阳性率70.3%（45/64）高于常规方法65.6%（42/64）。
附图说明
图1是PEDV,M蛋白的表达纯化对比图；
图2是ELISA方法检测M蛋白免疫兔后不同时间抗体产生情况图及抗体的纯化结果图；
图3是免疫磁球的PEDV结合和富集活性分析图；
图4是特异性和敏感性分析图。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例中的Real time RT-PCR反应液，是2×储存液，包括反转录酶（RNA依赖的DNA聚合酶），DNA聚合酶，dNTPs (dATP, dCTP, dTTP, dGTP)，Tris-HCl，KCl，MgCl2和SYBRGreen荧光染料。
本发明试剂盒使用操作流程，组织匀浆样品或粪便样品加入到含有10 μg免疫磁球的2 mL离心管中，37 °C，120 rpm，摇动30 min；用磁力架收集磁球，为确保对低病毒含量样品检测的准确性，可重复加入样品，到达病原富集作用。
实施例1. 免疫磁球的制备和PEDV结合活性分析
1.1. PEDV膜（M）蛋白的表达与纯化
图1中：1，M蛋白纯化；2，含有pcDNA3.1-M重组质粒的293T细胞裂解液；3，Western blot验证M蛋白的表达；4，空白对照；M，蛋白分子量标准。
参照GenBank登录的PEDV基因序列，合成M蛋白编码基因，并在3`端引入组氨酸标签，并克隆到pcDNA3.1载体。将含有M基因质粒转染293T细胞，通过Western blot验证M蛋白表达，结果出现了预期大小（30kDa）的条带。利用His标签蛋白亲和层析树脂，纯化表达的目的蛋白，得到与预期大小相符的目的蛋白（图1），并用透析法更换溶解缓冲液为磷酸盐缓冲液（PBS，pH 8.0），用紫外分光光度计测定终浓度，分装，- 20 °C冻存备用。
兔源PEDV M蛋白多克隆抗体的制备与纯化
图2中：A：ELISA方法检测M蛋白免疫兔后不同时间抗体产生情况；B：采集的兔血清IgG抗体的纯化；1，用纯化后SDS-PAGE结果；M，蛋白分子量标准。
用获得的M蛋白，免疫新西兰大白兔，在首次免疫后14 d和35 d分别进行加强免疫。通过ELISA方法检测血清中M蛋白抗体水平，当抗体滴度大于1:100 000时收获兔血清（图2）。采用硫酸铵沉淀法纯化血清中的IgG，获得血清中IgG抗体（图2），并用透析法更换溶解缓冲液为磷酸盐缓冲液（PBS，pH 8.0），用紫外分光光度计测定终浓度，分装，- 20 °C冻存。
免疫磁球制备
用EDC和NHS活化带有羧基表面的Fe2O3磁珠，按质量比1：100，加入纯化的抗M蛋白IgG抗体，置37 °C，120 rpm摇动，孵育2 h，用PBS缓冲液洗5次，收集磁珠，在用质量体积比为0.1%的牛血清白蛋白，置37°C，封闭30 min，收集磁珠，最后加入含体积比为0.01%叠氮钠，20%甘油的PBS缓冲液重悬，4 °C储存备用。
免疫磁球的PEDV结合活性分析
图3中：A：利用透射电镜观察与PEDV孵育后的免疫磁球，箭头标注为病毒样粒子；B：用基于M蛋白的RT-PCR方法检测与PEDV孵育后的免疫磁球，出现大小相符的条带；C：用基于PEDV核蛋白多克隆抗体的Western blot方法检测与PEDV孵育后的免疫磁球，出现大小相符的条带；D：PEDV富集活性分析，1 ~ 10，分别为300 μL ~ 1200 μL的10-7稀释的PEDV细胞毒与免疫磁球孵育后RT-PCR检测结果；M，核酸分子量标准。
将制备好的免疫磁球与Vero细胞上扩繁的PEDV（CV777），37 ℃，120 rpm，摇动孵育30 min；然后用无菌DEPC水配制的pH 7.4的PBS缓冲液洗磁球3次，用磁力架收集磁球，用DEPC处理的去离子水重悬。取部分磁球，合成cDNA，用RT-PCR方法扩增PEDV N基因；部分磁球加入蛋白上样缓冲液，进行SDS-PAGE，并转到PVDF膜，利用抗N蛋白单克隆抗体进行western blot检测；同时取部分磁球通过透射电镜直接观察。RT-PCR检测结果出现与N基因大小相符特异扩增条带，Western blot结果出现于N蛋白大小一致的条带，电镜结果发现磁球附近有大小约为100 nm的病毒颗粒（图3）。这些实验结果表明本研究获得的免疫磁球具有PEDV结合活性。
将PEDV做系列稀释，直到200 μL稀释后病毒液（10-7），用常规RT-PCR不能检测到，分别取这个稀释度样品200 μL ~ 1 000 μL与30 μg的免疫磁球孵育，洗磁球3次；重悬于30μL的DEPC处理的去离子水中；直接以孵育后磁球为模板进行RT-PCR检测。结果当样品中病毒含量低到PCR无法检测到时，利用免疫磁球对病毒进行富集后，能通过RT-PCR检测到，并且随着与免疫磁球孵育的病毒稀释样品量的增加，扩增条带亮度逐渐增强（图3），表明本发明制备的免疫磁球具有PEDV富集功能。
实施例2. PEDV特异性检测引物设计及基于免疫磁球的Real time RT-PCR检测方法建立
2.1. PEDV特异性检测引物的设计
参照GenBank中PEDV M基因序列，设计一对检测引物，本发明采用引物序列如下：上游Mf：5`-CTAACGGTTCTATTCCCGT-3`；下游Mr：5`-CAATTGACCTGAAAGCTAG-3`。
基于免疫磁球的Real time RT-PCR检测方法建立
取10 μg免疫磁球与PEDV细胞毒，37 °C，120 rpm，摇动30 min；用磁力架收集磁球，洗涤液洗磁球3次，并重悬于50 μL无菌无核酶水中；取5 μL的磁球悬液加入到PCR反应管，加入终浓度为200 nmol的Mf引物和终浓度为300 nmol的Mr引物，加入12.5 μL含有反转录酶的2 × Real time RT-PCR反应液，补充无菌无核酶水到终体积为25 μL；同时结合设置无菌模板进行的反应对照，以及提取细胞毒RNA为模板的阳性对照；放入荧光定量PCR仪，运行条件为：50 °C 15 min，95 °C 3 min，95 °C 30 s，56 °C 30 s，72 °C 10 s，重复40个循环。结果基于免疫磁球的Real time RT-PCR Ct值为19.85 ± 0.22（3孔重复的平均值±SD），无模板对照Ct值为39.66 ± 0.25，以RNA为模板的阳性对照Ct值为21.54 ± 0.6。表明基于磁球的Real time RT-PCR方法成功检测到细胞样品中的PEDV。
基于免疫磁球的Real time RT-PCR检测方法特异性分析和敏感性分析
图4中：A：特异性分析，用CSFV，PCV2，PRRSV和PPV评价了基于免疫磁球的Real timeRT-PCR方法的特异性；B：敏感性分析，将PEDV系列稀释，同时用常规Real time RT-PCR检测方法和基于免疫磁球的Real time RT-PCR检测方法进行检测，比较分析该方法的敏感性。
用猪瘟病毒（CSFV）C株细胞毒，圆环病毒2型（PCV2）细胞毒，细小病毒（PPV）细胞毒，猪呼吸与繁殖综合征病毒（PRRSV）细胞毒，PEDV细胞毒，来评价该方法的特异性；用100 ~10-8系列稀释的PEDV细胞毒，来评价该方法的敏感性。特异性分析结果发现，检测CSFV，PCV2，PPV，PRRSV的Ct值均大于35，与无模板对照（NTC）相近，为阴性，而检测PEDV组Ct值小于35位阳性（图4A），表明该方法与这些猪病毒性病原无交叉反应，具有较好的特异性。敏感性分析结果发现，传统Real time RT-PCR方法能够检测10-6稀释的TCID50为106.67/mL的PEDV，而基于免疫磁球的Real time RT-PCR方法则可以检测到10-7稀释的PEDV（图4B），表明基于免疫磁球的Real time RT-PCR方法具有更好的检测敏感性。
《临床样品检测》
利用基于免疫磁球的Real time RT-PCR方法，检测猪场送检，临床表现为严重腹泻的31份仔猪粪便样品、病死仔猪的22份小肠和11份淋巴结组织样品。并同时用传统的Realtime RT-PCR方法进行检测。结果基于免疫磁球的Real time RT-PCR方法检测22份粪便样品、17份小肠样品和6份淋巴结样品为PEDV阳性；而传统Real time RT-PCR方法检测20份样品，17份小肠样品和5份淋巴结样品为PEDV阳性（表1）。表明基于免疫磁球的Real time RT-PCR方法比传统Real time RT-PCR方法具有更高的检出率，适合用于临床样品快速、准确检测。
Claims (6)
1.一种基于免疫磁球的猪流行性腹泻病毒快速检测试剂盒，特征在于该试剂盒包括有：免疫磁球，洗涤液，无菌无核酶水，标准阳性对照样品，检测引物，Real time RT-PCR反应液；其中的免疫磁球表面具有PEDV膜蛋白特异性多克隆抗体，该试剂盒的检测引物，是PEDV核酸特异性引物，核苷酸序列为
。
2.根据权利要求1所述的一种基于免疫磁球的猪流行性腹泻病毒快速检测试剂盒，特征在于：所述洗涤液，是由无菌DEPC水配制的pH 7.4的PBS缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于免疫磁球的猪流行性腹泻病毒快速检测试剂盒，特征在于：所述无菌无核酶水，是DEPC处理后的去离子水。
4.根据权利要求3所述的一种基于免疫磁球的猪流行性腹泻病毒快速检测试剂盒，特征在于：所述标准阳性对照样品，是热灭活的PEDV细胞传代毒。
5.根据权利要求4所述的一种基于免疫磁球的猪流行性腹泻病毒快速检测试剂盒，特征在于：所述Real time RT-PCR反应液，是2×储存液，包括反转录酶，DNA聚合酶，dNTPs，Tris-HCl，KCl，MgCl2和SYBR Green荧光染料。
6.根据权利要求5所述的一种基于免疫磁球的猪流行性腹泻病毒快速检测试剂盒，特征在于：所述免疫磁球制备过程如下：用EDC和NHS活化带有羧基表面的Fe2O3磁珠，加入5倍质量浓度的抗M蛋白IgG抗体，通过氨基和羧基的羧和反应，将IgG抗体连到磁球表面，用牛血清白蛋白封闭后收集磁球，重悬于PBS中备用。
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