CN109097499A

CN109097499A - 一种用于检测pedv-tgev核酸的双重荧光定量rt-pcr检测试剂盒

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Publication number: CN109097499A
Application number: CN201811091219.1A
Authority: CN
Inventors: 王晓杜; 宋厚辉; 吴瑗; 周莹珊; 邵春艳; 章先; 程昌勇; 姜胜; 孙静; 周彬; 宋泉江
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2018-09-19
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2018-12-28

Abstract

本发明涉及检验检疫领域，旨在提供一种用于检测PEDV‑TGEV核酸的双重荧光定量RT‑PCR检测试剂盒。(1)反转录和荧光定量RT‑PCR扩增混合液：该混合液包含反转录和荧光定量扩增引物以及探针，其序列如SEQ ID NO：1～6所示；其中，反转录引物为12碱基随机引物；(2)阴性对照；(3)阳性对照，包含猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的阳性对照质粒。与现有方法比较，本发明具有高通量、节省费用、特异性好、灵敏度高的优点。

Description

一种用于检测PEDV-TGEV核酸的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

技术领域

本发明提供了一种用于同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)核酸的双重荧光定量RT-PCR鉴别检测试剂盒，可实现同时检测2种引起猪病毒性腹泻症候群的病原，属于检验检疫领域。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)是目前危害我国养猪场中哺乳和断奶仔猪腹泻的最重要的病原，其发病率和死亡率都较高，且发病和传播迅速，比较难以控制，给养猪业带来重大损失。一旦感染该病，仔猪常表现出水样腹泻、常脱水直至死亡。猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒都属于冠状病毒科成员，临床上呈单独感染或者混合感染，由于PEDV和TGEV引起的临床症状、病理变化十分相似，在临床上的鉴别诊断较困难，因此应用实验室的检测方法快速准确区分由哪种病原感染，对于防控病毒性腹泻疾病具有重要的意义。由于该发病迅速，及时的诊断是防控该病有效手段，目前尚没有一种方法可以一次性对引起猪病毒性腹泻的2种病原体进行鉴别诊断。因此建立一种能精准、快速、高效区分不同病原的检测方法，对于猪病毒性腹泻的预防和控制至关重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种用于检测 PEDV-TGEV核酸的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种用于检测PEDV-TGEV核酸的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒中包括：

(1)反转录和荧光定量RT-PCR扩增混合液：

该混合液包含反转录和荧光定量扩增引物以及探针，其序列如SEQ ID NO：1～6所示(见表1)；其中，反转录引物为12碱基随机引物；

(2)阴性对照；

(3)阳性对照，包含猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV) 的阳性对照质粒。

本发明中，所述序列SEQ ID NO：1-2是猪流行性腹泻病毒扩增引物；所述序列SEQID NO：4-5是猪传染性胃肠炎病毒扩增引物；所述序列SEQ ID NO：5是猪流行性腹泻病毒带荧光标记的探针；所述序列SEQ ID NO：6是猪传染性胃肠炎病毒带荧光标记的探针。

本发明中，阳性对照来自病毒核酸RNA经反转录后，其特异基因片段与质粒连接所得的重组质粒混合物；其中特异基因分别为猪流行性腹泻病毒(PEDV)的n基因、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的n基因；其中，猪流行性腹泻病毒(PEDV)的n基因序列如SEQ ID NO：7所示，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的n基因序列如SEQ ID NO： 8所示。

本发明进一步提供了利用前述试剂盒实现检测PEDV-TGEV核酸的双重荧光定量RT-PCR检测的方法，包括以下步骤：

(1)磁珠法提取样品DNA/RNA；

用磁珠DNA/RNA共提取试剂盒和全自动核酸提取仪同时提取样品中的RNA，得到200μL样品；

(2)双重荧光定量RT-PCR扩增

a)取预混冻干液，其中已按如下要求配制22μL反应体系：2.5μL RT-PCR 5×buffer； 2.5μL dNTPs mix；0.5μL Reverse enzymes mix；2.5μL 5×Q-solution；5.2μL引物混合液，其中包括PEDV/TGEV的上下游引物各1.15μL(10μM)，PEDV的探针0.2μL、 TGEV的探针0.4μL；rTaq酶1μL(5U)；2.5μL 10×PCR buffer；5.3μL H₂O补足， -20℃冻干，储存于2-8℃。

b)加入25μL灭菌H₂O回溶冻干颗粒，加入3μL待检样品RNA或者阴性对照或阳性对照；

c)每次检测时设置2管阳性和两管阴性对照，检测管放入荧光定量PCR仪中；

反应条件：42℃30min；95℃15s，60℃1min，40个循环，60℃为荧光信号采集温度，荧光信号分别在FAM和HEX通道进行采集；

(3)结果描述及判定

a)质控标准：

PEDV和TGEV阳性对照Ct值分别都＜32，且有典型扩增曲线；阴性对照无Ct值，且无典型扩增曲线；

如阴性对照和阳性条件不同时满足以上条件，此次试验视为无效；

b)结果判断：

扩增结果按下述方式进行判断：

阳性：在FAM通道Ct值小于38且有典型扩增曲线，表示样本中存在猪流行性腹泻病毒的核酸；在HEX通道Ct值小于38且有典型扩增曲线，表示样本中存在猪传染性胃肠炎病毒的核酸；

阴性：无特异性扩增条带或者无Ct值，表明样品中猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒。

与现有方法比较，本发明具有以下优势和效果：

1)高通量。一个反应能同时检测2种病原，利用全自动核酸分析仪，每次可同时检测96个样品，为病原体的鉴别诊断和应急诊断提供高通量检测技术。

2)节省费用。通常一个样品采用荧光定量方法检测2种疾病病原核酸，费用通常为200×2＝400元，而本试剂盒由于在一管中进行反应，费用大约200元左右。

3)特异性好。通过序列比对和blast分析，加强探针设计，确保探针只与目标基因相结合。

4)操作简便，耐贮存和便于运输。本发明所得到的试剂盒采用冻干技术，生产的产品在一个检测管内，操作方便，可室温保存，长期储存置于2-8℃。

附图说明

图1PEDV和TGEV阳性对照重组质粒构建PCR验证；

图中，M为DL2000DNA Marker；A.1为PCR阴性对照，2为PEDV-N；B.1为阴性对照，2为TEGV-N。

图2猪流行腹泻病毒为模板的特异性验证图；

在2对引物和探针的混合体系里，仅加入PEDV模板RNA的检测结果。

图3PEDV/TGEV/RV三联疫苗为模板的特异性验证图。

在2对引物和探针的混合体系里，仅加入PEDV/TGEV/RV三联疫苗RNA的检测结果。

具体实施方式

Taq man探针荧光定量技术相比SYBGreenI染料法具有更高的特异性和灵敏性，主要是利用探针的特异结合，其基本原理是：在PCR扩增过程中，利用Taq酶的5’-3’外切核酸酶活性，荧光探针与目的片段杂交后，在延伸复制时，Taq酶移动到探针结合位置时，其外切酶活性切割探针的5’端的发光基团，释放荧光，被荧光定量PCR仪检测，而探针不与目的片段结合时，探针3’端的淬灭基团与发光基团相互作用，不出现荧光信号。因此，PCR反应过程中，被释放的荧光基团数量与PCR产物是一对一的关系。本发明利用两种不同的发光基团，分别构建于两种疾病的不同探针上，希望能同时能检测两种病原体。

本发明构建了基于Taq man探针荧光定量技术的同时检测2种猪病毒性腹疾病的病原的检测方法，为该类症状的疾病提供了特异性强、灵敏度高的高通量诊断技术。

本发明通过基于一步法cDNA的合成和PCR扩增，然后按照本发明的操作流程进行Realtime RT-PCR，其引物和探针(序列见表1)被加入同一混合物，只需加入待检样本的RNA，按照反转录、PCR两个主要步骤进行反应即可，简单方便。

表1双重荧光定量RT-PCR方法引物序列(5’-3’)

一种用于检测PEDV-TEGV的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其组分如下：

1)反转录和荧光定量RT-PCR扩增混合冻干：该混合液包含反转录和荧光定量扩增引物以及探针，其中反转录引物为PEDV和TGEV PCR扩增下游引物，荧光定量 RT-PCR的引物和探针其序列表SEQ ID NO：1-6所示(见表1)。冻干混合液中已按如下要求配制22μL反应体系：2.5μL RT-PCR 5×buffer；2.5μL dNTPs mix；0.5 μL Reverse enzymes mix；2.5μL 5×Q-solution；5.2μL引物混合液，其中包括 PEDV/TGEV的上下游引物各1.15μL(10μM)，PEDV的探针0.2μL、TGEV的探针0.4μL；rTaq酶1μL(5U)；2.5μL 10×PCR buffer；5.3μL H₂O补足，-20℃冻干，储存于2-8℃。

2)阴性对照；

3)阳性对照，包含猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性对照质粒。

本发明提供了的同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)病毒核酸的双重荧光定量RT-PCR试剂盒，其操作流程如下：

1)磁珠法提取样品DNA/RNA；

用TIANGEN公司的磁珠DNA/RNA共提取试剂盒(货号：DP422)，使用天隆NP968 全自动核酸提取仪同时提取样品中的RNA，得到200μL样品。

2)双重荧光定量RT-PCR扩增

打开试剂盒预混冻干液(已经按照如下要求配制22μL反应体系：2.5μL RT-PCR 5×buffer；2.5μL dNTPs mix；0.5μL Reverse enzymes mix；2.5μL 5×Q-solution；5.2 μL引物混合液，PEDV/TGEV的上下游引物各1.15μL(10μM)，PEDV的探针0.2μL、 TGEV的探针0.4μL；rTaq酶1μL(5U)；2.5μL 10×PCR buffer；5.3μL H₂O补足， -20℃冻干，储存于2-8℃。)，加入25μL灭菌H₂O回溶冻干颗粒，加入3μL待检样品RNA或者阴性对照或阳性对照。检测管放入荧光定量PCR仪中，反应条件：42℃ 30min；95℃15s，60℃1min，40个循环，60℃为荧光信号采集温度，荧光信号分别在FAM和HEX通道进行采集。

3)结果描述及判定

a)质控标准：

PEDV和TGEV阳性对照Ct值分别都＜32，且有典型扩增曲线。阴性对照无Ct值，且无典型扩增曲线。

如阴性对照和阳性条件不同时满足以上条件，此次试验视为无效。

b)结果判断：

阳性：在FAM通道Ct值小于38且有典型扩增曲线，表示样本中存在猪流行性腹泻病毒的核酸；在HEX通道Ct值小于38且有典型扩增曲线，表示样本中存在猪传染性胃肠炎病毒的核酸。

表2扩增结果判断方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。

一、试剂盒的使用说明

1试剂盒的组成

储存条件：

整个试剂盒常温保存三个月，2-8℃保存一年，可室温储存和运输。开封后，于2-8℃保存两个月，-20℃可保存半年。为了保证实验效果，应在一年之内使用完毕。

2操作手册

2.1产品用途与说明

本试剂盒基于Taqman探针的实时荧光定量PCR技术，通过一步法进行荧光定量RT-PCR扩增，同时对PEDV和TGEV进行检测，不用于临床诊断，样本可以为猪的小肠组织或者新鲜粪便所提取的RNA或者cDNA。

2.2实验前准备

实验前穿实验服和带一次性手套。处理样品时按照实验室生物安全要求进行样品的前处理。加样时在无循环风的相对独立空间进行，避免核酸污染和非特异性扩增。

2.3磁珠法提取样品DNA/RNA；

用TIANGEN公司的磁珠DNA/RNA共提取试剂盒(货号：DP422)，使用天隆 NP968全自动核酸提取仪同时提取样品中的DNA和RNA，得到200μL样品。

2.4双重荧光定量RT-PCR扩增

试剂盒检测冻干管开盖前，12000转/min离心2分钟，开盖后加入22μL灭菌H₂O 回溶冻干颗粒，加入3μL待检样品RNA或者阴性对照或阳性对照，每次检测时设置 2管阳性和两管阴性对照。检测管放入荧光定量PCR仪中，反应条件：42℃30min； 95℃15s，60℃1min，40个循环，60℃为荧光信号采集温度，荧光信号分别在FAM 和HEX通道进行采集。

2.5结果描述及判定

a)质控标准：

b)结果判断：

扩增结果具体参照表2的内容进行判断。

注意事项：

1)回溶冻干颗粒时，请注意反复吹打，混匀。

2)回溶的混合物，请于1小时内进行Realtime RT-PCR反应。

3)PCR仪注意选用能检测FAM和HEX两个荧光信号的仪器型号，同时设置时注意勾选这两个通道。

二、试剂盒的特异性

1材料

本试验所用到的病毒与细菌见表3。

表3本试验所用到的病毒

注：表3中所述病毒或毒株，均为现有公知技术，本领域技术人员可通过市购方式自行获得。本申请人承诺在本申请提交之日起20年内，向社会公众提供上述病毒或毒株样本。

2方法

2.1分别用猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的两种病原单一探针分别针对常见的猪病病原如猪圆环病毒2b型、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪瘟病毒、猪轮状病毒、猪delta冠状病毒、猪博卡病毒、猪诺如病毒进行Realtime RT-PCR反应，验证探针的特异性。

2.2用2种病原的混合探针分别对表3中的所有病毒进行Realtime RT-PCR反应。

3结果

3.1用设计的任意一组探针进行检测，只能从相应的病毒模板中扩增出相应大小的条带，而对猪猪圆环病毒2b型、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪瘟病毒、猪轮状病毒、猪delta冠状病毒、猪博卡病毒、猪诺如病毒均无扩增信号。说明探针特异性良好。

3.2 2种病原的混合探针分别对表3中的所有病毒进行Realtime RT-PCR反应，只能从相应的病毒模板中扩增出相应大小的条带，而对猪圆环病毒2b型、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪瘟病毒、猪轮状病毒、猪delta冠状病毒、猪博卡病毒、猪诺如病毒均无扩增信号。表明所建立的方法特异性良好(结果见图2和图3)。

三、试剂盒的灵敏度

1材料

见表3。

2方法

2.1质粒的构建

将扩增的TGEV-N、PEDV-N基因片段与pZERO-blunt载体连接，转化Escherichiacoli DH5a，提取重组质粒，并进行PCR验证和测序验证。

2.2灵敏度验证

用紫外分光光度计测定重组质粒的吸光值A260和A280，计算出重组质粒的拷贝数，用EASY Dilution试剂将阳性重组质粒稀释到10¹⁰拷贝·μL^－1，再进行10倍梯度稀释，以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹，10⁰拷贝·μL^－1 9个拷贝数梯度作为标准模板，进行MLPA反应。质粒质量浓度(g·L^－1)＝λ(A260)×50(g·L^－1)/1 000×准模板释稀释倍数。拷贝数计算公式：拷贝数(拷贝·μL^－1)＝质粒浓度(g·μL^－1)×阿弗加德罗常数/重组质粒分子量。

3结果

该方法最低可检测到8.28个拷贝的猪流行性腹泻病毒、12.56个拷贝猪传染性胃肠炎病毒。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 一种用于检测PEDV-TGEV核酸的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gcttgcttcg gacccagagg 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

acgaacagcc acattaccac caa 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ctgtgtctag cattttgttt ggaa 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gaaggaattg tccagtttta ggat 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ttggagatgc ggaatttgtc gaa 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

agaagtcacg ttcacacaca a 21

<210> 7

<211> 147

<212> DNA

<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)

<400> 7

gcttgcttcg gacccagagg gggcttcaaa aactttggag atgcggaatt tgtcgaaaaa 60

ggtgttgatg cgtcaggcta tgctcagatc gccagtttag caccaaatgt tgcagcattg 120

ctctttggtg gtaatgtggc tgttcgt 147

<210> 8

<211> 123

<212> DNA

<213> 猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine)

<400> 8

ctgtgtctag cattttgttt ggaagctatt ggacttcaaa ggaagatggc gaccagatag 60

aagtcacgtt cacacacaaa taccacttgc caaaggatga tcctaaaact gaacaattcc 120

ttc 123

Claims

1.一种用于检测PEDV-TGEV核酸的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括：

(1)反转录和荧光定量RT-PCR扩增混合液：

该混合液包含反转录和荧光定量扩增引物以及探针，其序列如SEQ ID NO：1～6所示；其中，反转录引物为12碱基随机引物；

(2)阴性对照；

(3)阳性对照，包含猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的阳性对照质粒。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述序列SEQ ID NO：1-2是猪流行性腹泻病毒扩增引物；所述序列SEQ ID NO：4-5是猪传染性胃肠炎病毒扩增引物；所述序列SEQID NO：5是猪流行性腹泻病毒带荧光标记的探针；所述序列SEQ ID NO：6是猪传染性胃肠炎病毒带荧光标记的探针。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，阳性对照来自病毒核酸RNA经反转录后，其特异基因片段与质粒连接所得的重组质粒混合物；其中特异基因分别为猪流行性腹泻病毒的N基因、猪传染性胃肠炎病毒的N基因；其中，猪流行性腹泻病毒的N基因序列如SEQ IDNO：7所示，猪传染性胃肠炎病毒的n基因序列如SEQ ID NO：8所示。

4.利用权利要求1所述试剂盒实现检测PEDV-TGEV的双重荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)磁珠法提取样品DNA/RNA；

(2)双重荧光定量RT-PCR扩增

a)取预混冻干液，其中已按如下要求配制22μL反应体系：2.5μL RT-PCR 5×buffer，2.5μL dNTPs mix，0.5μL Reverse enzymes mix，2.5μL 5×Q-solution；5.2μL引物混合液，其中包括PEDV/TGEV的上下游引物各1.15μL，PEDV的探针0.2μL、TGEV的探针0.4μL；rTaq酶1μL、2.5μL 10×PCR buffer，5.3μL H₂O补足，-20℃冻干，储存于2-8℃；

(3)结果描述及判定

a)质控标准：

b)结果判断：

扩增结果按下述方式进行判断：