CN105671207A

CN105671207A - 猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法

Info

Publication number: CN105671207A
Application number: CN201610181702.3A
Authority: CN
Inventors: 刘惠莉; 熊年年; 陶洁; 张春玲; 李本强
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-03-28
Filing date: 2016-03-28
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2036-03-28
Also published as: CN105671207B

Abstract

猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法，该方法首先分别针对病毒BVDV的N^pro基因、TGEV的N基因、PEDV的M基因、PRoV的VP6基因序列设计、合成相应的上下游引物、探针，所有下游引物5’端进行生物素标记，所有探针5’端进行氨基(NH₂(CH₂)₁₂修饰；选用不同颜色编码的微球分别偶联BVDV、TGEV、PEDV、PRoV的探针，将得到的四种偶联到微球的探针进行混合；再将生物素化的扩增产物与偶联到微球上的探针混合物杂交，得到的杂交产物进行液相芯片检测，根据MFI值判定检测结果，该方法可同时检测猪病毒性腹泻四种病原，特异性好，重复稳定性好，灵敏度高。

Description

猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法

技术领域

本发明属于病毒学技术领域，具体涉及猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法，更具体涉及一种能够同时检测猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法。

背景技术

猪病毒性腹泻疾病是由多种病毒引起的以腹泻、呕吐及脱水为主要临床症状的高度接触性腹泻疾病。猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRoV)以及猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是引起该病的主要病原，各年龄猪均可感染，病死率高达100％。

近年来，猪病毒性腹泻疾病的发病死亡率逐渐上升，而且由单一病原的感染发展为多病原的混合感染，给临床诊断带来困难，延误诊断时机，给养猪业带来了经济损失。目前，诊断该类病原的实验室常规检测方法有病毒的分离鉴定、ELISA、实时荧光定量PCR技术等，但这些方法存在实验周期长、操作繁琐、或者仅限单一病毒、或者2-3个病毒检测，没有同时检测以上四种病毒的技术。

液相芯片技术也称微球体悬浮芯片技术，是20世纪90年代中期发展起来的一种以用荧光染色方法编码直径只有5.6μm的微球或6.5μm的磁性微球为核心的检测技术。相对于其他实验室检测技术，液相芯片技术具有通量高、灵敏度高、特异性强、应用范围广以及操作简便等无法比拟的优势。该项技术整合了应用流体学、微球编码、激光技术以及高速数字信号处理等先进技术，在特制的聚苯乙烯小球或磁性小球上包被核酸探针及抗原抗体等分子，在液相反应体系中可以同时检测多种成分，成为新型基因和蛋白组学中的研究工具，已经通过FDA认证，可直接用于临床诊断。

液相芯片技术在核酸检测中主要有三种检测模式：直接DNA杂交、竞争性DNA杂交、酶反应beads杂交。直接DNA杂交是主流技术，其优点是操作简便且成本低。该项技术原理是以PCR来标记靶DNA，然后使其与偶联在磁珠上的互补探针进行直接杂交，最后加入荧光报告分子SA-PE(链酶亲和素-藻红蛋白)，用Luminex200系统检测，对所得平均中位荧光值(MFI)进行分析。在直接杂交之前，PCR产物需要进行生物素标记。生物素标记一般有两种方法：第一种是对引物进行标记，另一种是对扩增产物进行标记。研究者通常选用第一种方法，操作方便，而且一般对下游引物进行5’端生物素化，然后对保守性较好的300bp左右的DNA进行扩增，这样靶DNA反义链就标记上了生物素。

发明内容

本发明的目的在于提供猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法，首先设计合成针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRoV)以及猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的特异性探针及引物对，建立能够同时检测PEDV、TGEV、PRoV以及BVDV的检测方法，为临床样品检测提供一种新的检测方法，同时也为类似病毒的高通量检测提供借鉴。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

本发明利用液相基因芯片中的DNA直接杂交法原理，建立一种可以同时检测PEDV、TGEV、PRoV及BVDV的检测方法。首先分别设计四种病毒的特异性探针及引物对，然后分别进行PCR扩增，将PCR产物与成功偶联在微球上的探针进行直接杂交，最后加入荧光报告分子(SA-PE)，用Luminex200液相芯片分析检测仪进行测定，对所得MFI值进行分析。并通过对杂交温度、杂交时间以及上、下游引物的比例优化筛选，最后得出一个较为完整的检测体系。

一种用于同时检测四种猪病毒性腹泻病原的液相基因芯片的引物对和探针，包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRoV)以及猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的上、下游引物和探针，所有下游引物5’端进行生物素(Biotin)标记，所有的探针5’端进行氨基(NH₂(CH₂)₁₂修饰，具体序列如表1所示。

表1

本发明所述四种猪病毒性腹泻病原的液相芯片检测方法，其包括如下步骤：

1)以提取待测样品中的RNA作为模板，反转录得到cDNA；

2)分别利用病毒BVDV的N^pro基因、TGEV的N基因、PEDV的M基因、PRoV的VP6基因序列设计、合成相应的上下游引物、探针，各病毒上下游引物、特异性探针的具体序列如表1所示；

3)微球与探针进行偶联

选用不同颜色编码的微球分别偶联病毒BVDV的探针BN-Probe、病毒TGEV的探针TGEV-Probe、病毒PEDV的探针PM1-Probe、病毒PRoV的探针PVP6-Probe，将得到的四种偶联到微球的探针进行混合，备用；

4)杂交

以步骤1)得到的cDNA为模板，利用步骤2)合成的上下游引物分别进行PCR扩增，得到生物素化的扩增产物；

将所述生物素化的扩增产物与步骤3)中偶联到微球上的探针混合物进行杂交反应；

5)检测

对步骤4)得到的杂交产物进行液相芯片检测，根据平均中位荧光强度值(MFI)判定检测结果：

若待测样品相应病毒的MFI与阴性对照的MFI的比值≥3，则待测样品判定为该病毒阳性；

若2≤待测样品相应病毒的MFI与阴性对照MFI的比值＜3，则待测样品判定为该病毒疑似阳性；

若待测样品相应病毒的MFI与阴性对照MFI的比值＜2，则待测样品判定为该病毒阴性。

进一步，所述微球是直径为6.5μM的磁性微球。

步骤4)中，所述PCR扩增的扩增体系中上、下游引物的质量比为1：1～8。

再，步骤4)中，所述PCR扩增的扩增体系中上、下游引物的浓度≥5μM。

步骤4)中，所述PCR扩增的扩增反应程序中退火温度为50～56℃。

优选的，步骤4)中，所述杂交反应的杂交温度为50～53℃，杂交时间为20～35min。

更优选的，步骤4)中，所述杂交反应的杂交温度为50℃，杂交时间为35min。

优选的，本发明所述微球是直径为6.5μM的磁性微球。

本发明的有益效果：

本发明成功建立了能同时检测猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法，且该方法特异性好，重复稳定性好，灵敏度比现有多重PCR检测方法至少提高10倍。临床样品检测与现有PCR方法阳性符合率为100％，可以大规模应用于临床样品检测。

说明书附图

图1为本发明实施例2中扩增产物的PCR电泳图，其中，泳道1、2代表BVDV(+)、(-)，泳道3、4代表PEDV(+)、(-)，泳道5、6代表PRoV(+)、(-)，泳道7、8代表TGEV(+)、(-)。

图2为本发明实施例4中44#微球偶联BVDV的探针BN-Probe与互补探针杂交后液相芯片检测结果。

图3为本发明实施例4中25#微球偶联PEDV的探针PM1-Probe与互补探针杂交后液相芯片检测结果。

图4为本发明实施例4中20#微球偶联PRoV的探针PVP6-Probe与互补探针杂交后液相芯片检测结果。

图5为本发明实施例4中15#微球偶联TGEV的探针TGEV-Probe与互补探针杂交后液相芯片检测结果。

图6为本发明实施例6的液相芯片检测结果。

图7为本发明实施例7特异性实验时的液相芯片检测结果。

图8为本发明实施例7灵敏度实验时的液相芯片检测结果。

图9为病毒PEDV的PCR检测结果，其中，M：DL2000DNA相对分子质量标准；1-8分别代表质粒倍比稀释1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7；9代表阴性。

图10为病毒PRoV的PCR检测结果，其中，M：DL2000DNA相对分子质量标准；1-8分别代表质粒倍比稀释1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7；9代表阴性。

图11为病毒BVDV的PCR检测结果，其中，M：DL2000DNA相对分子质量标准；1-8分别代表质粒倍比稀释1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7；9代表阴性。

图12为病毒TGEV的PCR检测结果，其中，M：DL2000DNA相对分子质量标准；1-7分别代表质粒倍比稀释1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6；8代表阴性。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。

主要材料与试剂

仪器：ABI梯度PCR仪，凝胶成像分析系统(BIO-RAD)，低温台式高速离心机(BECKMAN)，涡旋震荡器(Vision)，液相芯片检测仪(Luminex200，Luminex公司)。

毒株：猪腹泻三联苗(用于制备猪轮状病毒(PRoV)阳性质粒)，商品化疫苗由公司购买，猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均由上海农业科学院畜牧所保存，猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)由扬州大学赠送。

主要生化试剂：EDC粉末购自Pierce公司，MES、TMAC、Sarkosyl以及Tween20均购自Sigma公司，SA-PE购自Invitrogen，15#、20#、25#、44#磁性羧基微球、鞘液均购自Luminex公司。所有PCR相关试剂购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒均购自TIANGEN公司。

主要试剂的配制

(1)0.1MMES偶联缓冲液：0.488gMES粉末，用20mLddH₂O充分溶解，调pH至4.5，定容至25mL，0.22μm滤器过滤，4℃保存备用。

(2)0.02％Tween20清洗缓冲液I：Tween2020μL，加入60mLddH₂O充分混匀，终定容100mL。0.22μm滤器过滤，室温保存备用。

(3)0.1％SDS清洗缓冲液II：1mL10％SDS加入80mLddH₂O充分混匀，定容至100mL，0.22μm滤器过滤，室温保存备用。

(4)1xTE(pH8.0)：100xTEBuffer1mL加入80mLddH₂0混匀，定容至100mL，0.22μm滤器过滤，室温保存备用。

(5)20％Sarkosyl：Sarkosyl5g加入20mLddH₂0溶解，定容至25mL，0.22μm滤器过滤，室温保存备用。

(6)1.5XTMAC杂交缓冲液：5MTMAC90mL，20％Sarkosyl752μl，MTris-HCl(pH8.0)7.5mL，0.5MEDTA(pH8.0)1.2mL，ddH₂O548μl，上述溶液充分混匀，定容至100mL，室温保存备用。

(7)1XTMAC杂交缓冲液：1.5XTMAC杂交缓冲液16.7mL加入ddH208.3mL混勾，定容至25mL，室温保存备用。

本实施例所用的其他试剂如无特殊说明，均为常规试剂。

实施例1引物及探针的设计与合成

选取具有代表性的GENBANK上保守性PEDV的M基因(GenBank登录号为AF353511.1)、TGEV的N基因(GenBanK登录号为EU074218)、PRoV的VP6基因(GenBanK登录号为FJ617209.1)和猪源BVDV的N^pro基因序列(GenBanK登录号为HQ258810.1)进行在线分析后，用DNASTAR软件分析并设计这些基因的特异性引物、探针及互补探针链。所有的探针5’端进行氨基(NH₂(CH₂)₁₂)修饰，所有互补探针链及下游引物5’端进行生物素(Biotin)标记，合成后进行试验筛选，经过筛选后的各病毒引物和探针序列如表2所示。本发明的探针及引物设计主要注意以下几点：

引物设计原则：1)一般引物长度为18-25碱基，上下游引物的长度差别不超过5个；2)引物自身最好不要由连续4个碱基互补，引物之间最好也不要超过连续4个碱基的互补；3)引物GC％含量在40-60％之间，且上下游引物GC％含量差别不大；4)尽量避免出现发夹结构及引物二聚体的出现，且能量值不超过4.5kcal/mol；5)上下游引物的Tm值相差不超过5℃；6)为了使液相芯片的杂交效率高，扩增的目的片段尽量在100-300bp之间；7)下游引物5’端进行生物素(Biotin)标记，目的是与链酶亲和素化的藻红蛋白(SA-PE)进行结合，且带生物素标记的单链扩增片段必须与偶联微球的捕获探针互补。

探针设计原则：1)探针特异性高，且液相芯片的探针长度最好在18-24bp左右；2)GC％含量在40-60％之间，避免同一碱基连续重复超过4个，否则容易出现非特异性杂交反应；3)探针内部不应出现互补序列区域，否则极易形成探针自身内部发夹结构，影响杂交；4)各探针的Tm值保持一致，最好保持在5℃以内；5)关键一点是探针与其他已知的各个基因序列进行同源比较，与非靶基因的序列同源性不能超过70％，或不能出现8个以上的相同碱基序列；6)探针必须有一定的空间与目的片段杂交，所以在5’端进行氨基修饰(NH₂(CH₂)₁₂)，目的是与羧基化的荧光微球进行结合；7)同时针对相应探针设计反向互补探针，且5’端进行生物素标记，用于探针偶联效率验证。

表2

实施例2阳性质粒的制备

病毒RNA提取：采用Trizol裂解法提取待测样品的RNA，操作步骤如下：(1)吸取各细胞毒250μl加入3倍体积的Trizol裂解液，涡旋震荡仪混匀，冰上静置10min；(2)加入200μl的三氯甲烷，涡旋震荡仪混匀，冰上静置10min；(3)12000Xg，4℃离心15min；(4)取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，冰上静置至少10min，重复步骤(3)；(5)弃上清，加入1ml75％的无水乙醇，颠倒混匀，重复步骤(3)，弃液，风机吹干，加入20μlDEPC水，-80℃保存备用。

反转录制备cDNA：10ulRNA，2ulprimemix，0.5ulM-MLVRT,0.5ulRRI,5xReverseTranscriptaseM-MLVBuffer4ul，2.5mMdNTP2ul,ddH2O1ul。42℃1h,75℃15min，4，∞。

PCR扩增体系：10xPCRBuffer2.5μl，2.5mMdNTP1.5μl，ExTaq酶0.5μl，上/下引物(10μM)各0.5μl，cDNA2μl，ddH2O17.5μl,共25ul。。

优化的反应程序：94℃，4min；(94℃，35s；53℃，35s；72℃，35s)，30个循环；72℃，8min；4℃，∞。

核酸电泳：1.2％琼脂糖凝胶电泳，扩增产物的PCR电泳结果如图1所示。

胶回收：利用天根胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收纯化。

连接：pMD18T载体1μl，SolutionI10μl，9μl胶回收产物，16℃，时间>4h。

转化：将连接产物转化于感受态TOP10中，涂布于氨苄平板上，37℃培养。

摇菌：挑选单个菌落摇菌，然后进行菌液PCR，将出现疑似目的条带所对应的菌液送公司测序。

阳性质粒的提取：质粒提取使用的是天根快速提取质粒试剂盒，步骤按照说明书进行操作，-20℃保存。

如图1可知，各病毒能够扩增出各自的条带，且与目的条带BVDV372bp、PEDV332bp、PRoV167bp、TGEV98bp大小相符，结果表明：本发明设计的上下游引物能够特异性的扩增出目的片段。

实施例3微球偶联探针

44#微球偶联BVDV的探针BN-Probe；25#微球偶联PEDV的探针PM1-Probe；20#微球偶联PRoV的探针PVP6-Probe；15#微球偶联TGEV的探针TGEV-Probe，偶联步骤如下：

(1)分别将44#微球、25#微球、20#微球、15#微球(Luminex公司)从4度冰箱取出放置恢复至室温，涡旋震荡20s，超声20s；取出100μl微球与1.5ml进口离心管中；

(2)12000xg离心2min取出离心管放入磁力架上，小心去除上清，用50μlMES重悬微球，涡旋震荡混匀，使微球完全分散；

(3)向44#微球中加入10μm的探针BN-Probe2μl；

向25#微球中加入10μm的探针PM1-Probe2μl；

向20#微球中加入10μm的探针PVP6-Probe2μl；

向15#微球中加入10μm的探针TGEV-Probe2μl；

(4)制备新鲜的EDC溶液，向事先称量好的10mgEDC粉末中加入无菌去离子水1ml，震荡混匀至完全融解，快速取出2.5μlEDC溶液加入至微球中，涡旋混匀；

(5)室温黑暗条件下孵育30min；

(6)重复(4)和(5)两步；

(7)向微球中加入1ml0.02％Tween-20，稍微混匀，12000xg离心2min，放入磁力架弃上清；

(8)加入1ml0.1％SDS重悬沉淀，12000xg离心2min，放入磁力架弃上清；加入100μlTEBuffer重悬沉淀。4℃黑暗条件下储存备用。

实施例4偶联效率的验证

用表2中标记了生物素的互补探针与偶联到微球上的探针进行杂交，用于确定偶联探针的效率。

具体步骤如下：

(1)将互补探针稀释至10fmol/μl；

(2)将取出上述偶联探针的微球，震荡混匀，用1.5XTMAC杂交液将微球稀释至75个/μl(每孔加入33μl微球工作液，约2500个微球)；

(3)用10％BSA-TEBuffer将微球工作液室温封闭2h，用1xTMAC杂交液清洗2遍，用1.5xTMAC重悬微球；

(4)每个PCR管中加入33μl微球工作液；

(5)如表3所示，加入TEBuffer及互补探针的量如下表，并做复孔；

(6)将PCR管放入PCR仪器中杂交，95℃5min，53℃20min；

(7)配置SA-PE：用1xTMAC将SA-PE稀释成2.5μg/ml；

(8)将PCR一种的杂交液转移至1.5ml离心管中，12000xg离心2min，放入磁力架中弃去上清，加入50μlSA-PE，53℃孵育10min；

(9)在预先调整到杂交温度的Luminex200液相芯片检测仪上分析50μl样品。根据中位荧光强度值(MFI)判断偶联效率。

44#微球偶联BVDV的探针BN-Probe、25#微球偶联PEDV的探针PM1-Probe、20#微球偶联PRoV的探针PVP6-Probe、15#微球偶联TGEV的探针TGEV-Probe与互补探针杂交后液相芯片检测结果分别如图2-5所示。由图2-5可知，各探针的MFI值随着互补探针浓度的增加而增加，并能达到一定的平台期，表明各探针偶联成功。

表3

实施例5液相芯片杂交的建立和优化

以实施例2制备的阳性质粒为模板进行PCR扩增反应，将PCR产物与实施例3偶联好的探针进行杂交检测，同时设立空白对照及阴性对照。

PCR扩增体系：10xPCRBuffer2.5μl，2.5mMdNTP1.5μl，rTaq酶0.5μl，上/下游引物(5～20μM)各0.5μl，各病毒质粒10倍稀释1μl，ddH₂O18.5μl,共25ul。

杂交具体步骤如下：

(1)涡旋震荡偶联探针的微球，用10％BSA-TEBuffer封闭2h，用1xTMAC清洗，重悬；

(2)向每个PCR反应管中加入稀释好的微球工作液33μl；

(3)向空白对照中加入17ulTEbuffer，其他反应管中加入15μlTEBuffer及相应的生物素化的PCR扩增产物2μl，混匀；

(4)PCR仪中，95℃变性5min，50～53℃杂交20～35min；

(5)配制SA-PE，终浓度为2.5μg/ml；

(6)将PCR仪中的杂交液转移至1.5ml离心管中，12000xg离心2min，放入磁力架中弃去上清，加入50μlSA-PE，53℃孵育10min；

(7)在预先调整到杂交温度的Luminex200液相芯片检测仪上分析50μl样品。

5.1PCR条件优化

将PCR的产物分别进行杂交，其他条件不变，根据液相芯片检测的MFI值确定上、下游引物质量的比值，操作步骤如下：

PCR反应体系：10xPCRBuffer2.5μl，2.5mMdNTP1.5μl，rTaq酶0.5μl，上游引物(10μM)0.5μl，下游引物(10μM)各0.5μl、1μl、2μl、4μl按各病毒质粒10倍稀释1μl，分别补水至25μl。相对应的阴性用水作为模板进行PCR。

反应体系如实施例5，液相芯片杂交步骤也同实施例5。

液相芯片检测结果参见表4：由表4可知，各病毒上、下游引物质量比为1：1～8范围内，MFI阳性值/MFI阴性值都远大于3，表明在上、下游引物的质量比在该范围内，均可用于本发明的后续检测中，但从MFI值及生物素标记成本来说，上、下游引物的质量比为1:2时，已满足试验所需，故可作为最佳反应条件用于本发明检测中。

表4

5.2杂交反应温度的优化：

在优化好的上下游引物用量比的基础上，根据各病毒的探针的Tm值选择47℃、50℃、53℃、56℃、59℃五个杂交温度，其他条件不变进行杂交，根据液相芯片检测的MFI值确定最佳的杂交温度，具体操作步骤如下：

用上、下游引物用量比为1:2进行PCR反应，所得PCR产物按照实施例5上述的杂交步骤进行液相芯片杂交反应，其中，步骤4)95℃变性5min，杂交温度分别为47℃、50℃、53℃、56℃、59℃，杂交时间为20min。其他步骤不变。

液相芯片检测结果参见表5：由表5可知，温度在47～53℃范围内，MFI阳性值/MFI阴性值远大于3，均能用于本发明检测中。但在杂交温度为50℃时，MFI阳性值最高，故可作为最佳反应条件为本发明实施例的后续实验所用。

表5

5.3杂交时间的优化

在优化好上下游引物质量比及杂交温度的基础上，将时间设定为10min、20min、25min、30min、35min、40min六个温度进行杂交，根据液相芯片检测的MFI值确定最佳的杂交时间，具体操作步骤如下：

用上、下游引物用量比为1:2进行PCR反应，所得PCR产物按照实施例5的杂交步骤进行液相芯片杂交反应，步骤4)95℃变性5min，杂交温度50℃，杂交时间分别为10min、20min、25min、30min、35min、40min。其他步骤不变。

液相芯片检测结果参见表6：由表6可知，杂交时间为20～35min范围内，MFI阳性值/MFI阴性值远大于3，均能用于本发明的后续检测中。但在杂交时间为35min时，MFI阳性值最高，故可作为最佳反应条件为后续实验所用。

表6

实施例6四重液相芯片检测方法的建立

将实施例3中得到的四种偶联到微球的探针进行混合，按每孔33μl计算，用1.5xTMAC杂交缓冲液进行稀释，备用。

选用最佳上、下游引物质量比为1:2进行PCR，其他的PCR扩增体系及反应程序与实施例5相同，并作阴性对照。

杂交步骤：每个PCR管分别加入33μl微球混合液和9μl1xTEBuffer，然后各管分别加入：8μl1xTEBuffer、病毒阴性PCR产物各2ul、PEDV阳性PCR产物2ul+6ul1xTEBuffer、TGEV阳性PCR产物2ul+6ul1xTEBuffer、PRoV阳性PCR产物2ul+6ul1xTEBuffer、BVDV阳性PCR产物2ul+6ul1xTEBuffer、4种病毒阳性PCR产物各2ul。其他步骤同实施例5，杂交温度及杂交时间选用最佳的53℃和35min。同时做复孔。

液相芯片检测结果如图6所示，由图6可知，只加入单一病毒PCR阳性产物的管中，能检测到相应的病毒目标物，且其他病毒探针检测不到目标产物；加入四种病毒阳性PCR产物的管中均能检测到四种病毒目标物，且阴性值小于300，每种病毒的MFI阳性值/MFI阴性值远大于3，符合试验判定标准，说明该方法已成功建立，可用于后续实验检测。

实施例7四重液相芯片检测特异性、灵敏度试验及评价

1、探针特异性实验

在实施例6建立的四重杂交体系中，各管加入33μl微球混合液和9μl1xTEBuffer，各管依次加入8μl1xTEBuffer、病毒阴性PCR产物各2ul、PEDV阳性PCR产物2ul+另3种病毒阴性PCR产物各2ul、TGEV阳性PCR产物2ul+另3种病毒阴性PCR产物各2ul、PRoV阳性PCR产物2ul+另3种病毒阴性PCR产物各2ul、BVDV阳性PCR产物2ul+另3种病毒阴性PCR产物各2ul。其他步骤同实施例5，杂交温度及杂交时间选用最佳的53℃和35min。同时做复孔。

液相芯片检测结果如图7所示：各病毒探针能够特异性的检测出各自相应的病毒，且对其他病原没有杂交反应，MFI阴性值小于300，每种病毒的MFI阳性值/MFI阴性值大于3，符合判定标准，证明这4种探针特异性好，可用于后续实验检测。

2、灵敏度试验

将实施例2制备的各病毒阳性质粒10倍倍比稀释，按照优化好的条件进行PCR，然后2μlPCR产物用于杂交体系检测，步骤如实施例5，液相芯片检测结果如图8所示；余下的PCR产物进行核酸电泳，结果如图9-12所示。

由图8，以及质粒拷贝数计算方法：(6.02×1023拷贝数/mol)×(浓度g/μL)/(MWg/mol)＝copies/μL，其中MW_{(T+目的片段)}＝660×bp数，T＝2692bp，可计算出本发明液相芯片杂交体系灵敏度结果：PEDV、TGEV、PROV及BVDV核酸最低拷贝数分别为79.2copies/μl、58.8copies/μl、721copies/μl、74.1copies/μl。

由图9-图12，以及质粒拷贝数计算方法：(6.02×1023拷贝数/mol)×(浓度g/μL)/(MWg/mol)＝copies/μL，其中MW_{(T+目的片段)}＝660×bp数，T＝2692bp，可计算出单一PCR检测灵敏度结果：最低拷贝数为PEDV：792copies/μl、TGEV：588copies/μl、PRoV：7210copies/μl、BVDV：741copies/μl。

以上数据表明本发明建立的液相芯片方法最低检出限量比单一PCR方法提高了10倍。

实施例8临床样品检测

用本发明所建立的液相芯片检测方法对44份猪腹泻样品进行检测，其中2份样品为PEDV与TGEV阳性，1份样品检出TGEV与BVDV阳性，17份样品为PEDV阳性，3份样品为TGEV阳性，2份样品为BVDV阳性，用PCR方法对阳性样品分别检测，结果符合率为100％。并经测序证实结果正确。

临床样品检测具体步骤如下：

1)将采集的仔猪腹泻粪便样品用PBS稍微稀释后，按照实施例2的RNA提取步骤及反转录cDNA步骤进行操作；

2)按照优化的最佳条件，PCR体系为：10xPCRBuffer2.5μl，2.5mMdNTP1.5μl，rTaq酶0.5μl，各病毒上游引物(10μM)0.5μl，下游引物(10μM)1μl，步骤1)得到的cDNA5μl，补水至25μl，分别进行PCR。阴性用水作为模板进行PCR反应。

3)液相芯片杂交：将所得四种病毒引物分别所扩增的产物，每种病毒样品各取2μl进行混合，加入到事先准备好的装有33μl实施例3中四种偶联到微球上的探针混合液的PCR管中，用1xTEBuffer补足到50ul。

4)PCR仪进行杂交：95℃变性5min；50℃杂交35min。

5)配制SA-PE，终浓度为2.5μg/ml。

6)将PCR仪中的杂交液转移至1.5ml离心管中，12000xg离心2min，放入磁力架中弃去上清，加入50μlSA-PE，53℃孵育10min。

7)在预先调整到杂交温度的Luminex200液相芯片检测仪上分析50μl样品。

8)结果判定：根据平均中位荧光强度值(MFI)判定检测结果。

按照Luminex公司推荐标准，检测每种微球数≥50且背景值MFI小于300，待测样品相应病毒的MFI与阴性对照的MFI比值≥3，判定结果为该病毒阳性；2≤待测样品相应病毒的MFI与阴性对照的MFI比值＜3判定为该病毒疑似阳性，待测样品相应病毒MFI与阴性对照MFI比值＜2判为该病毒阴性。

部分典型样品数据结果如表7所示，例如，样品12：

15#微球偶联探针TGEV-Probe：样品的MFI与阴性对照的MFI比值＝4.4＞3，则为病毒TGEV阳性；

20#微球偶联探针PVP6-Probe：样品的MFI与阴性对照的MFI比值＝样品的MFI与阴性对照的MFI比值＝0.71＜2，则为病毒PRoV阴性；

25#微球偶联探针PM1-Probe：样品的MFI与阴性对照的MFI比值＝样品的MFI与阴性对照的MFI比值＝5.3＞3，则为病毒PEDV阳性；

44#微球偶联探针BN-Probe：样品的MFI与阴性对照的MFI比值＝样品的MFI与阴性对照的MFI比值＝0.27＜2。可见，样品12同时感染病毒TGEV和病毒PEDV。

表7

综上所述：本发明成功建立了能够同时检测PEDV、TGEV、PRoV及BVDV的液相芯片检测技术，临床样品检测与现有单一PCR检测方法阳性符合率为100％，最低检出限量比单一PCR检测的灵敏至少提高了10倍。故本发明能够用于临床样品检测，并且也可以为其他类似病毒的高通量检测提供借鉴。

Claims

1.用于同时检测猪病毒性腹泻四种病原的液相基因芯片的引物对和探针，其特征在于，包括猪流行性腹泻病毒PEDV、猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪轮状病毒PRoV以及猪源牛病毒性腹泻病毒BVDV的上、下游引物和探针，所有下游引物5’端进行生物素标记，所有探针5’端进行氨基NH₂(CH₂)₁₂修饰，具体序列如下：

BVDV：上游引物BN-F:TTACGACATCAACGGAT；

下游引物BN-R:Biotin-TGGTCCCTAGTCGCTCT；

探针BN-Probe:NH₂(CH₂)₁₂-CCGCAATCCACACTAAAGCTA；

TGEV：上游引物TGEV-F3:AACAGGGATCAACAGATT；

下游引物TGEV-R3:Biotin-TAGTAGAAGAACCACCT；

探针TGEV-Probe:NH₂(CH₂)₁₂-CAAACTCGCTATCGCATGG；

PEDV：上游引物PEDV-F:GATACTTTGGCCTCTTGTGT；

下游引物PEDV-R:Biotin-ATTGACTTACCTGTACGC；

探针PM1-Probe:NH₂(CH₂)₁₂-CGCAGGACACATTCTTGGT；

PRoV：上游引物PVP6-F3:ATTTATATTYCATGCTAC；

下游引物PVP6-R3:Biotin-CTGTCCAATTCATYCCT；

探针PVP6-Probe:NH₂(CH₂)₁₂-TTTGTGAATCTGTGCTTG。

2.猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法，其包括如下步骤：

1)以提取待测样品中的RNA作为模板，反转录得到cDNA；

2)分别针对病毒BVDV的N^pro基因、TGEV的N基因、PEDV的M基因、PRoV的VP6基因序列设计、合成相应的如权利要求1所述的上、下游引物，探针；

3)微球与探针进行偶联

选用不同颜色编码的微球分别偶联BVDV的探针BN-Probe、TGEV的探针TGEV-Probe、PEDV的探针PM1-Probe、PRoV的探针PVP6-Probe，将得到的四种偶联到微球的探针进行混合，得到偶联到微球的探针混合物，备用；

4)杂交

以步骤1)得到的cDNA为模板，用步骤2)合成的上、下游引物分别进行PCR扩增，得到生物素化的扩增产物；

将所述生物素化的扩增产物与步骤3)得到的偶联到微球上的探针混合物进行杂交；

5)检测

对步骤4)得到的杂交产物进行液相芯片检测，根据平均中位荧光强度值MFI判定检测结果：

若2≤待测样品相应病毒的MFI与阴性对照的MFI的比值＜3，则待测样品判定为该病毒疑似阳性；

若待测样品相应病毒的MFI与阴性对照的MFI的比值＜2，则待测样品判定为该病毒阴性。

3.根据权利要求2所述的液相芯片检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述微球是直径为6.5μM的磁性微球。

4.根据权利要求2所述的液相芯片检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述PCR扩增的扩增体系中上、下游引物的质量比为1：1～8。

5.根据权利要求2或4所述的液相芯片检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述PCR扩增的扩增体系中上、下游引物的浓度≥5μM。

6.根据权利要求2所述的液相芯片检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述PCR扩增的扩增反应程序中退火温度为50～56℃。

7.根据权利要求2所述的液相芯片检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述杂交反应的杂交温度为50～53℃，杂交时间为20～35min。

8.根据权利要求2或7所述的液相芯片检测方法，其特征在于，骤4)中，所述杂交反应的杂交温度为50℃，杂交时间为35min。