CN108456747A

CN108456747A - 一种鉴别猪圆环病毒的多重pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN108456747A
Application number: CN201810455907.5A
Authority: CN
Inventors: 杨克礼; 田永祥; 段正赢; 郭锐; 周丹娜; 袁芳艳; 刘泽文; 刘威; 高婷
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-05-14
Filing date: 2018-05-14
Publication date: 2018-08-28

Abstract

本发明公开了一种鉴别猪圆环病毒(PCV)的多重PCR试剂盒。该试剂盒包括如下3对快速区分PCV1、PCV2和PCV3基因型的多重PCR检测引物：PCV1‑F和PCV1‑R，PCV2‑F和PCV2‑R，PCV3‑F和PCV3‑R。该试剂盒可用于检测猪圆环病毒并区分不同的基因型。本发明具有快速、简便、特异性强、敏感性高的特点，并且可同时进行大批量的样品检测，只需一次扩增反应即能鉴别样品是否属于PCV1、PCV2或PCV3感染，亦或是其中两者或三者的共同感染，可为猪圆环病毒的疫情监测、流行病学调查及综合防控提供技术支持，具有良好的应用前景。

Description

一种鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种鉴别检测猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)的多重PCR检测试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)在分类学上属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，是目前已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径14-17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因组大小约为1.76kb。2016年以前，在全球范围内仅发现猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)有PCV1和PCV2两个基因型。PCV1是猪肾细胞PK-15污染物，但不产生细胞病变效应，对猪无致病性。PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原，与猪皮炎与肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍、增生性坏死性肺炎和肠炎等疫病密切相关。

2016年，美国首次报道发现了一种新型的猪圆环病毒——猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3，PCV3)，随后波兰、韩国、意大利、西班牙、巴西和中国等国家均报道有PCV3的发生与流行。2016年以来，我国华中、华东、华南地区的十余个省份陆续报道该病的流行。PCV3可引起猪的皮炎、肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，给全世界的生猪养殖造成了极大的经济损失。PCV3感染后，猪的临床表现与PCV2引起的症状极其相像。鉴于目前PCV2、PCV3快速的传播流行以及较高的致病性，再加上PCV1具有一定的潜在致病性，给世界养猪业造成了严重的经济损失，因此各国政府对猪圆环病毒的防控工作高度重视，而建立可鉴别猪圆环病毒不同基因型的快速诊断方法可为其综合防控技术研究提供坚实的技术支持。

通过检索国内外现有技术，已报到的猪圆环病毒检测方法主要适用于PCV1和PCV2，方法有PCR方法、ELISA抗体检测、荧光定量PCR方法、环介导等温扩增快速检测方法等。目前，对PCV3的研究相对较少，原有的对猪圆环病毒(PCV1和PCV2)的检测分型方法已经难以满足实际需求。因此，建立一种能够快速区分PCV1、PCV2和PCV3型的多重PCR诊断方法和专用试剂盒，可以实现在疫病发生早期快速、准确的鉴别诊断疫病的类型，从而为疫病的防控提供技术支持，也可为我国生猪产业健康发展保驾护航。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种鉴别PCV的多重PCR检测试剂盒，该试剂盒只需一次扩增反应就可同时检测出样本中是否含有PCV，以及是哪一种基因型PCV的感染，亦或是其中二者或三者的共同感染。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：一种鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒，该试剂盒包括如下3对快速区分PCV1、PCV2和PCV3基因型的多重PCR检测引物：

PCV1-F：5’-GAAAGTGAGCGGGAAGAT-3’，如SEQ ID NO：1所示；

PCV1-R：5’-CTGATTGCTGGTAATCAA-3’，如SEQ ID NO：2所示；

PCV2-F：5’-CACATCGAGAAAGCGAAAGGAAC-3’，如SEQ ID NO：3所示；

PCV2-R：5’-TGCGGGCCAAAAAAGGTACAGTT-3’，如SEQ ID NO：4所示；

PCV3-F：5’-AGCAGTGCTCCCCATTGA-3’，如SEQ ID NO：5所示；

PCV3-R：5’-TGGGCCCGACCAAATCCGG-3’，如SEQ ID NO：6所示。

进一步优选地，如上所述鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒，该试剂盒还包括猪圆环病毒DNA提取试剂和PCR扩增试剂。

再进一步优选地，如上所述鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒，该试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

再进一步优选地，如上所述鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒，其中所述的阳性对照品为含PCV1、PCV2和PCV3这三种猪圆环病毒基因群组的阳性质粒混合品。阳性质粒混合品的构建方式如下：

(1)PCV基因组DNA的提取：按病毒DNA/RNA小量提取试剂盒(Viral DNA/RNAMiniprep Kit，Axygen Scientific,USA)说明书进行操作提取猪圆环病毒基因组DNA。以提取的猪圆环病毒基因组DNA为模板；以前述三对引物作为引物分别进行扩增，反应条件为95℃预变性5min；94℃变性40s,56℃退火40s，72℃延伸50s，共35个循环；72℃再延伸10min；PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；

(2)PCR产物的克隆及序列分析：PCR产物用Axygen(爱思进)公司的凝胶回收试剂盒回收，与pMD18-T克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养10-12h；经蓝白斑筛选后，用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，将序列测定为阳性的质粒分别命名为pMD-PCV1、pMD-PCV2和pMD-PCV3。

再进一步优选地，如上所述鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒，其中所述的阴性对照品为DEPC H₂O。

另外，本发明仅需一次PCR扩增即可鉴别出三种基因型的猪圆环病毒，临床应用操作便捷，实用性强，经济实惠，适合于养殖场和专业实验室对PCV病毒株的快速鉴定，同时可为PCV的疫情监测、流行病学调查及综合防控提供强有力的技术支持。因此，本发明还提供上述多重PCR检测试剂盒在一次PCR扩增实现三种基因型猪圆环病毒检测中的应用。

最后，本发明还提供上述鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒的使用方法，该方法包括病毒核酸提取、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳步骤，对琼脂糖凝胶电泳结果分析：当扩增产物片段为310bp，则样本中的病毒为PCV1型；当扩增片段大小为505bp，则样本中的病毒为PCV2；当扩增片段大小为1021bp，则样本中的病毒为PCV3；当扩增片段大小为上述三种片段中的两种或者三种，则样本中的病毒为PCV1、PCV2和PCV3中两种或三种的混合感染。

进一步优选地，如上所述鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒的使用方法，其中的PCR扩增步骤中PCR扩增体系为50.0μL PCR反应体系，包括：10×PCR Buffer缓冲液5.0μL、2.5mM dNTPs 4.0μL、终浓度各为40pmol/μL的3对引物分别1.0μL、5U/μL Ex-Taq DNA聚合酶1.0μL、模板DNA 3.0μL，补加DEPC水至50.0μL。

再进一步优选地，如上所述鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒的使用方法，其中的PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸50s，共30-35个循环；最后72℃延伸10min。

与现有技术相比，本发明涉及的多重PCR检测试剂盒具有如下进步性和优点：

(1)本发明利用三对引物一次性鉴别猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)，减少了鉴定不同基因型猪圆环病毒的检测成本和检测时间；且只需一次PCR反应即可鉴别出三种PCV病毒，解决了临床诊断难以区分PCV1、PCV2和PCV3单独感染或共同感染的问题。

(2)本发明具有特异性强、可重复性好等优势，仅对猪圆环病毒(PCV)的DNA产生特异性的扩增反应，对猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、轮状病毒(RV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的核酸等均无扩增反应。

(3)本发明的专用试剂盒具有较强的敏感性，对猪圆环病毒(PCV)可检测出的DNA样品的最低浓度为10ng/μL。

(4)本发明的专用试剂盒经济实惠，仅需一次PCR扩增即可鉴别出三种基因型的猪圆环病毒，对于需要分别检测三种基因型的猪圆环病毒的样本来说，成本降低了约2/3。

(5)本发明为我国PCV的临床检测提供了新手段，该试剂盒临床应用操作便捷，实用性强，可用于生产实际中PCV的疫情监控、鉴别诊断以及疫病的净化，也可用于于专业实验室对PCV病毒株的快速鉴定，可为提升我国PCV的综合防控水平提供技术支撑。

附图说明

图1：PCV多重PCR优化试验结果，注：M：DL2000 Marker；1：PCV1；2：PCV2；3：PCV3；4：DEPC水；

图2：PCV多重PCR特异性试验结果，注：M：DL2000 Marker；1：PCV1；2：PCV2；3：PCV3；4：猪瘟病毒(CSFV)；5：猪伪狂犬病毒(PRV)；6：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)；7：猪细小病毒(PPV)；8：猪乙型脑炎病毒(JEV)；9：轮状病毒(RV)；10：猪流行性腹泻病毒(PEDV)；11：猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)；

图3：PCV多重PCR敏感性试验结果，注：M：DL2000 Marker；1-10：模板浓度分别为1×10⁷ng/μL、1×10⁶ng/μL、1×10⁵ng/μL、1×10⁴ng/μL、1×10³ng/μL、1×10²ng/μL、1×10¹ng/μL、1×10⁰ng/μL、1×10^-1ng/μL、1×10^-2ng/μL；

图4：PCV多重PCR临床检测电泳图，注：M：DL2000 Marker；1、4：PCV1阳性组织样品；2、5：PCV2阳性组织样品；3、6：PCV3阳性组织样品；7：阴性对照(DEPC H₂O)；

图5：对比例2建立的PCV多重PCR扩增产物电泳图，注：M：DL2000 Marker；1：PCV1；2：PCV2；3：PCV3；4：DEPC水。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图进一步阐述本发明的技术方案和技术效果，但本发明的保护范围不限于如下实施例。

本发明研究过程中用到的病毒毒株包括：猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、轮状病毒(RV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

实施例1：PCV多重PCR方法的建立

1、引物设计

根据GenBank中收录的PCV1、PCV2和PCV3序列，通过比对PCV1、PCV2和PCV3之间的差异，并结合发明人多年来研究猪圆环病毒的经验自行设计三对特异性引物，具体如下：

PCV1-F：5’-GAAAGTGAGCGGGAAGAT-3’，如SEQ ID NO：1所示；

PCV1-R：5’-CTGATTGCTGGTAATCAA-3’，如SEQ ID NO：2所示；

PCV2-F：5’-CACATCGAGAAAGCGAAAGGAAC-3’，如SEQ ID NO：3所示；

PCV2-R：5’-TGCGGGCCAAAAAAGGTACAGTT-3’，如SEQ ID NO：4所示；

PCV3-F：5’-AGCAGTGCTCCCCATTGA-3’，如SEQ ID NO：5所示；

PCV3-R：5’-TGGGCCCGACCAAATCCGG-3’，如SEQ ID NO：6所示。

使用上述三对引物进行PCR扩增，PCV1预计扩增片段大小为310bp，PCV2预计扩增片段大小为505bp，PCV3预计扩增片段大小为1021bp。

2、病毒DNA的提取

分别取猪圆环病毒细胞培养液，反复冻融3次后，12000rpm离心15min，取上清500μL按病毒DNA/RNA小量提取试剂盒(Viral DNA/RNA Miniprep Kit，Axygen Scientific,USA)说明书进行操作，提取的DNA置-20℃保存备用或立即用于PCR扩增。

3、PCR反应体系和反应程序的确定

以PCV的DNA为模板，按如下反应体系进行PCR体系的优化：

10×PCR Buffer缓冲液5.0μL、2.5mM dNTPs 3.0-5.0μL(每0.5μL一个梯度)、三对引物分别1.0μL(终浓度为20-50pmol/μL，每10pmol/μL一个梯度)、5U/μL Ex-Taq DNA聚合酶0.5-1.5μL(每0.5μL一个梯度)、模板DNA 3.0-5.0μL(每1.0μL一个梯度)，补加DEPC水至50.0μL。

对PCR反应程序的退火温度及循环数进行优化，将退火温度设定为52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃，反应条件为95℃预变性5min；94℃变性40s,52-58℃退火40s，72℃延伸50s，共30-35个循环；72℃再延伸10min。

最终确定本发明的PCR反应体系和反应程序为：

具体的反应体系(50μL)为：

反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性40s,56℃退火40s，72℃延伸50s，共35个循环；72℃再延伸10min。

4、PCR扩增

按上述反应体系及反应条件对PCV1、PCV2、PCV3的DNA及阴性对照DEPC水进行PCR扩增。

5、电泳

称取1.2g琼脂糖放入500mL锥形瓶中，加入1×TAE电泳缓冲液100mL，于微波炉中熔解，再加入5μL染色液混匀。在电泳槽模内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待完全凝固后取出置于电泳槽中，将PCR扩增产物9μL混合1μL上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，以100-120V电压于1×TAE电泳缓冲液中电泳，凝胶成像系统观察结果。

6、结果判定

PCV1扩增片段大小为310bp，PCV2扩增片段大小为505bp，PCV3扩增片段大小为1021bp，阴性对照无条带(引物带除外)时，实验结果有效。

7、结果

在上述反应体系及反应条件下获得了最佳的扩增效果。PCV1、PCV2、PCV3均扩增出与预期大小一致的目的条带，而阴性对照DEPC水未扩增出任何目的带(见图1)。

实施例2：PCV多重PCR方法的特异性试验

用实施例1建立的PCV多重PCR方法检测PCV1，PCV2，PCV3和8株其它猪源病毒毒株，包括猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、轮状病毒(RV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)，以验证该方法检测不同样品的特异性。

结果表明，只有PCV1、PCV2和PCV3扩增分别得到310bp、505bp和1021bp片段，其它病毒均无扩增条带产生。实验结果证实，本发明的引物和检测方法具有很高的特异性(图2)。

实施例3：PCV多重PCR方法的敏感性试验

用实施例1建立的PCV多重PCR方法检测不同含量的PCV1，PCV2和PCV3的DNA，以检测该方法的敏感性。

PCV复合PCR扩增检测不同稀释度样品的结果见图3。结果表明该PCV复合PCR的敏感性为10ng/μL。

实施例4：应用PCV多重PCR方法检测临床样品

用实施例1建立的PCV多重PCR方法分别检测PCV1、PCV2及PCV3阳性组织样品各3份，同时重复检测3次，并设DEPC水作为阴性对照，以检测该方法的稳定性。

检测结果见图4。PCV1、PCV2及PCV3阳性组织样品的DNA均扩增出与预期大小一致的目的条带，阴性对照无任何条带产生，说明该鉴别诊断方法稳定性好，可直接应用于临床。

对比例1：使用其它引物建立的PCV PCR方法

1、引物设计

在实施例1建立前，根据GenBank中收录的PCV1、PCV2和PCV3序列，通过比对PCV1、PCV2和PCV3之间的差异，先后设计了其它三对引物，具体如下：

PCV1-F1：5’-GAAAGTGAGCGGGAAGAT-3’；

PCV1-R1：5’-CTGATTGCTGGTAA-3’；

PCV2-F1：5’-GCGGGAAAATGCAGAAGCGTGAT-3’；

PCV2-R1：5’-TCCTCCGATAGAGAGCTTCTACAGC-3’；

PCV3-F1：5’-TTGGGGTGGGGGTATTTATT-3’；

PCV3-R1：5’-ACACAGCCGTTACTTCAC-3’。

使用上述三对引物进行PCR扩增，PCV1预计扩增片段大小为310bp，PCV2预计扩增片段大小为363bp，PCV3预计扩增片段大小为425bp。

2、病毒DNA的提取

3、PCR反应体系和反应程序

以PCV的DNA为模板，按如下反应体系进行PCR体系的筛选：

对PCR反应程序的退火温度及循环数进行优化，将退火温度设定为52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃，反应条件为95℃预变性5min；94℃变性40s,52-58℃退火40s，72℃延伸30s，共30-35个循环；72℃再延伸10min。

4、PCR扩增

5、电泳

6、结果判定

PCV1扩增片段大小为310bp，PCV2扩增片段大小为363bp，PCV3扩增片段大小为425bp，阴性对照无条带(引物带除外)时，实验结果有效。

7、结果

当对比例中，50μL PCR反应体系具体如下时：

PCV1、PCV2和PCV3在各自适合的反应条件下，均可扩增出与各自预期大小一致的目的条带；但因引物PCV1-F1、PCV1-R1的退火温度与引物PCV2-F1、PCV2-R1和PCV3-F1、PCV3-R1的退火温度相差太多，无法获得适合多重PCR反应的反应条件，即利用引物PCV1-F1、PCV1-R1、PCV2-F1、PCV2-R1和PCV3-F1、PCV3-R1未能成功建立鉴别PCV的多重PCR方法。

对比例2：使用其它引物建立的PCV多重PCR方法

1、引物设计

在对比例1实施后，根据GenBank中收录的PCV1序列，通过比对PCV1、PCV2及PCV3之间的差异，重新设计了一对引物，具体如下：

PCV1-F：5’-GAAAGTGAGCGGGAAGAT-3’，如SEQ ID NO：1所示；

PCV1-R：5’-CTGATTGCTGGTAATCAA-3’，如SEQ ID NO：2所示；

利用该引物与对比例1中的引物，分别进行PCR扩增：

PCV2-F1：5’-GCGGGAAAATGCAGAAGCGTGAT-3’；

PCV2-R1：5’-TCCTCCGATAGAGAGCTTCTACAGC-3’；

PCV3-F1：5’-TTGGGGTGGGGGTATTTATT-3’；

PCV3-R1：5’-ACACAGCCGTTACTTCAC-3’。

2、病毒DNA的提取

3、PCR反应体系和反应程序

以PCV的DNA为模板，按如下反应体系进行PCR体系的筛选：

4、PCR扩增

5、电泳

6、结果判定

7、结果

最终确定对比例2的PCR反应体系和反应程序为：

具体的反应体系(50μL)为：

反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性40s,55℃退火40s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃再延伸10min。

在上述反应体系和反应条件下，PCV1扩增片段大小为310bp的目的条带，PCV2扩增片段大小为363bp的目的条带，PCV3扩增片段大小为425bp的目的条带，阴性对照未扩增出如何条带(图5)。

由图5可知，本实施例中所建立的PCV多重PCR方法，PCV1、PCV2、PCV3扩增产物大小分别为310bp、363bp和425bp，因目的片段大小差异较小，在电泳图中几乎位于相同位置，不易区分，故该方法不适应用于临床。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaagtgagc gggaagat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgattgctg gtaatcaa 18

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacatcgaga aagcgaaagg aac 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgcgggccaa aaaaggtaca gtt 23

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcagtgctc cccattga 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgggcccgac caaatccgg 19

Claims

1.一种鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下3对快速区分PCV1、PCV2和PCV3基因型的多重PCR检测引物：

PCV1-F：5’-GAAAGTGAGCGGGAAGAT-3’，如SEQ ID NO：1所示；

PCV1-R：5’-CTGATTGCTGGTAATCAA-3’，如SEQ ID NO：2所示；

PCV2-F：5’-CACATCGAGAAAGCGAAAGGAAC-3’，如SEQ ID NO：3所示；

PCV2-R：5’-TGCGGGCCAAAAAAGGTACAGTT-3’，如SEQ ID NO：4所示；

PCV3-F：5’-AGCAGTGCTCCCCATTGA-3’，如SEQ ID NO：5所示；

PCV3-R：5’-TGGGCCCGACCAAATCCGG-3’，如SEQ ID NO：6所示。

2.根据权利要求1所述鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括猪圆环病毒DNA提取试剂和PCR扩增试剂。

3.根据权利要求2所述鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

4.根据权利要求3所述鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品为含PCV1、PCV2和PCV3这三种猪圆环病毒基因群组的阳性质粒混合品。

5.根据权利要求3所述鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照品为DEPC H₂O。

6.一种如权利要求1-5任一项所述多重PCR检测试剂盒在一次PCR扩增实现三种基因型猪圆环病毒检测中的应用。

7.一种如权利要求1-5任一项所述鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，该方法包括病毒核酸提取、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳步骤，对琼脂糖凝胶电泳结果分析：当扩增产物片段为310bp，则样本中的病毒为PCV1型；当扩增片段大小为505bp，则样本中的病毒为PCV2；当扩增片段大小为1021bp，则样本中的病毒为PCV3；当扩增片段大小为上述三种片段中的两种或者三种，则样本中的病毒为PCV1、PCV2和PCV3中两种或三种的混合感染。

8.根据权利要求7所述鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的PCR扩增步骤中PCR扩增体系为50.0μL PCR反应体系，包括：10×PCR Buffer缓冲液5.0μL、2.5mM dNTPs 4.0μL、终浓度各为40pmol/μL的3对引物分别1.0μL、5U/μL Ex-TaqDNA聚合酶1.0μL、模板DNA 3.0μL，补加DEPC水至50.0μL。

9.根据权利要求8所述鉴别猪圆环病毒的多重PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸50s，共30-35个循环；最后72℃延伸10min。