CN109897916A

CN109897916A - 3种猪圆环病毒通用型pcr检测引物和检测方法

Info

Publication number: CN109897916A
Application number: CN201910221714.8A
Authority: CN
Inventors: 陈如敬; 陈秋勇; 吴学敏; 王晨燕; 周伦江; 严山; 车勇良; 王隆柏; 魏宏; 刘玉涛
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2019-06-18

Abstract

本发明提供3种猪圆环病毒通用型PCR检测引物和检测方法，属于动物病毒学领域。该通用型引物上游引物P1：5’‑AGCGAGTATTGCARKAAAGA‑3’，下游引物P2：5’‑CCATKRTAACCATCCCACCA‑3’。该引物组（P1和P2）对3种猪圆环病毒PCV1、PCV2和PCV3的扩增大小分别为344bp、344bp和347bp。本发明方法不仅能同时检测三种猪圆环病毒PCV1、PCV2和PCV3，还具有重复性好、特异性强、敏感性高的特点。

Description

3种猪圆环病毒通用型PCR检测引物和检测方法

技术领域

本发明提供3种猪圆环病毒通用型PCR检测引物和检测方法，属于动物病毒学领域。

背景技术

猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）是迄今发现的最小的动物病毒之一，当前猪圆环病毒有3种：PCV1、PCV2和PCV3。PCV1为非致病性的病毒；PCV2为致病性的病毒；PCV3的有无致病力好需要更进一步深入明确。研究发现，PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS），皮炎与肾病综合征(PNDS)的主要病原。对PCV1和PCV2的基因组进行分析发现，PCV1基因组全长1759bp，PCV2全长1768bp（或1767 bp）。ORF1是PCV1和PCV2最大的开放阅读框（ORF），位于病毒基因组的5’端，编码病毒的复制蛋白（Rep），分子量大小为37KDa，与病毒的复制转录有关。

2016年，美国堪萨斯州立大学科研人员利用宏基因组测序技术，从患有皮炎肾病综合征（PDNS）和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新型猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 3，PCV3）。流行病学调查发现PCV3感染多见于具有PDNS和繁殖障碍症状猪群，目前已于美国多个州猪群内普遍流行。随后，我国多个省市猪群中也检测出PCV3。近来，波兰和韩国相继报道存在PCV3感染猪群。作为一种新发现病原体，PCV3对猪致病性及在猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）中作用以及现有商品化PCV2疫苗对其免疫效力等有待进一步研究。和PCV1、PCV2一样，PCV3病毒颗粒直径为17-20nm，核酸类型为单股DNA病毒，基因组长度为2000bp，包含有与复制相关的复制蛋白rep和与抗原相关的抗原蛋白cap。

当前，已见有PCV1和PCV2鉴别诊断的研究报道，也见有PCV2和PCV3鉴别诊断的报道，但当前尚未见一组可同时对3种猪圆环病毒类型（PCV1、PCV2和PCV3）的方法报道。一般而言，对三种或以上的病原进行同时PCR扩增均为困难，尤其三种核苷酸同源性低于80%，且基因组长度不同的病原进行检测，需要分别设计引物，再进行分别扩增。但上述建立的方法均是基于鉴别诊断而设计的，只能扩增出各自相应的病毒条带，没有通用型的PCR检测方法，本发明可填补上述研究空白。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术中的不足，提供了一种特异性强、敏感性高的三种猪圆环病毒通用型PCR检测引物及其检测方法。

为实现上述目的，采用以下技术方案:

3种猪圆环病毒通用型PCR检测引物，所述引物组其核苷酸序列如下所示：

上游引物P1：5’-AGCGAGTATTGCARKAAAGA -3’

下游引物P2：5’-CCATKRTAACCATCCCACCA -3’。

用于非诊断目的的3种猪圆环病毒的PCR检测方法，包含以下步骤：

（1）、从疑似临床样品中提取基因组DNA；

（2）、以提取的DNA为模板，用所述的引物P1和P2进行PCR扩增；

（3）、该组引物对PCV1、PCV2和PCV3均可有效扩增。

所述的引物在制备3种猪圆环病毒通用型PCR检测试剂盒上的应用。

本发明的优点在于：

本发明根据PCV1、PCV2、PCV3的基因组，进行核苷酸同源性比较分析，设计了通用型引物，并利用该引物建立PCR方法，最终实现了PCV1、PCV2、PCV3三种病毒的快速检测。采用该引物及优化的PCR方法，不仅能够同时检测PCV1、PCV2、PCV3三种病毒，而且还具有重复性好、特异性强、敏感性高的特点。

附图说明

图1 3种猪圆环病毒基因组核苷酸比较。

图2 上游引物设计区域。

图3下游引物设计区域。

图4 PCR扩增电泳图，其中M：DL2000分子量标准；1：PCV1；2：PCV2；3：PCV3；4：PPV；5：PRV；6：V-PRV；7：PRRSV；8：PEDV。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、毒株：

猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）、猪细小病毒（PPV）、经典猪伪狂犬病毒（PRV）、变异型猪伪狂犬病毒（V-PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和保存。

2、主要试剂

病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit购自北京全式金生物技术有限公司；PCR扩增试剂盒Quick Taq HS DyeMix购自TOYOBO公司；其他常规化学试剂、耗材、引物合成和序列测定均为生工生物工程（上海）股份有限公司产品。

3、核苷酸序列分析

选择PCV1代表株（PK株，GenBank登陆号DG650650；BJ-1株，GenBank登陆号FJ475129），PCV2代表株（JZ-9株，GenBank登陆号MH059556；PCV-45株，GenBank登陆号KC514989），和PCV3代表株（PCV3-CN2018LN-2株，GenBank登陆号MH277116；PCV3-CN2018LN-3株，GenBank登陆号MH277117）为例，选择DNAStar生物学软件进行核苷酸同源性比较，结果可见（图1）：PCV1和PCV3的基因组核苷酸同源性低于50%（47.3%左右）；PCV1和PCV2的基因组核苷酸在77.7%-77.8%之间；PCV2和PCV3的基因组核苷酸同源性低于50%（47.4%左右）。

4、引物设计

基于3的分析结果，寻找3种猪圆环病毒（PCV1、PCV2和PCV3）的保守区来设计通用型引物，该引物就可以同时对3种猪圆环病毒（PCV1、PCV2和PCV3）进行扩增，其中引物P1和P2序列为：

上游引物P1：5’-AGCGAGTATTGCARKAAAGA -3’

下游引物P2：5’-CCATKRTAACCATCCCACCA -3’。

但是该引物组（P1和P2）对3种猪圆环病毒（PCV1、PCV2和PCV3）的扩增大小分别为344bp、344bp和347bp。

其中上游引物P1的设计区域见图2，该区域可对3种猪圆环病毒（PCV1、PCV2和PCV3），RK表示修饰引物，其中R=A/G，K=G/T。

其中下游引物P2的设计区域见图3，该区域可对3种猪圆环病毒（PCV1、PCV2和PCV3），RK表示修饰引物，其中Y=C/T，M=A/C。

5、PCR方法的建立

5.1 核酸DNA的提取

以试剂盒说明书进行，提取猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）、猪细小病毒（PPV）、经典猪伪狂犬病毒（PRV）、变异型猪伪狂犬病毒（V-PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）的基因组核酸DNA。

5.2 PCR条件优化

以提取PCV1、PCV2和PCV3的基因组DNA，分别作为模板。用所设计的特异性PCR引物P1和P2进行常规PCR扩增，并对退火温度（50-60）℃进行优化。按照Quick Taq HS DyeMix扩增试剂盒推荐的50 μL配置PCR反应液：Quick Taq HS DyeMix 25μL、上/下游引物（10 μM each）各1 μL、模板1μL、水补足至50 μL。经过优化后，56 ℃位最佳退火温度，此时PCV1、PCV2和PCV3均可有效扩增。优化后的最佳反应条件为：94 ℃ 2min预变性；94 ℃ 40 s、56 ℃ 30s、72 ℃ 30 s，共30个循环，72 ℃ 总延伸7min。

5.3 特异性实验

以优化后条件对猪群常见传染病，如猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）、猪细小病毒（PPV）、经典猪伪狂犬病毒（PRV）、变异型猪伪狂犬病毒（V-PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）进行扩增，判断本研究的特异性。结果可见（图4），仅PCV1、PCV2和PCV3出现阳性特异性扩增条带，而PPV、PRV、V-PRV、PRRSV、PEDV均未见条带扩增。

6、临床应用

应用本方法对临床送检49份猪PMWS病料进行检测，将病料按照常规方法研磨处理后，利用核酸提取试剂盒提取病毒的基因组DNA，利用优化后的方法进行PCR检测，结果检测到27份核酸阳性，阳性率为55.10%。对这个27份检测阳性样品进行TA克隆测序，结果其中有PCV1阳性3株、PCV2阳性15株，PCV3阳性9株。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农科院畜牧兽医研究所

<120> 3种猪圆环病毒通用型PCR检测引物和检测方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcgagtatt gcarkaaaga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccatkrtaac catcccacca 20

Claims

1.3种猪圆环病毒通用型PCR检测引物，其特征在于：所述引物组其核苷酸序列如下所示：

上游引物P1：5’-AGCGAGTATTGCARKAAAGA -3’

下游引物P2：5’-CCATKRTAACCATCCCACCA -3’。

2.如权利要求1所述的引物用于非诊断目的的3种猪圆环病毒的PCR检测方法，其特征在于，包含以下步骤：

（1）、从疑似临床样品中提取基因组DNA；

（2）、以提取的DNA为模板，用权利要求1所述的引物P1和P2进行PCR扩增；

（3）、该组引物对PCV1、PCV2和PCV3均可有效扩增。

3.如权利要求1所述的引物在制备3种猪圆环病毒通用型PCR检测试剂盒上的应用。