CN109762943A - 用于鉴别猪圆环病毒1、2、3型的引物组及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于鉴别猪圆环病毒1、2、3型的引物组及其应用，所述引物组序列如SEQ ID NO.1‑4所示。本发明基于猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的基因组结构特点，选择猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的基因组特异性保守区作为上游引物设计区域，在分别根据3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的基因组的差异区分别设计针对下游引物。本发明所述引物，条件优化简单、方便快速，结果观察方便，组装的试剂盒可用于猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的快速鉴别诊断。

Description

用于鉴别猪圆环病毒1、2、3型的引物组及其应用

技术领域

本发明属于动物传染学领域，具体涉及用于鉴别猪圆环病毒1、2、3型的引物组及其应用。

背景技术

猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）是迄今发现的最小的动物病毒之一，当前猪圆环病毒有3种：PCV1、PCV2和PCV3。PCV1为非致病性的病毒；PCV2为致病性的病毒；PCV3的有无致病力需要更进一步深入明确。研究发现，PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS），皮炎与肾病综合征(PNDS)的主要病原。

对PCV1和PCV2的基因组进行分析发现，PCV1基因组全长1759bp，PCV2全长1768 bp（或1767 bp）。ORF1是PCV1和PCV2最大的开放阅读框（ORF），位于病毒基因组的5’端，编码病毒的复制蛋白（Rep），分子量大小为37KDa，与病毒的复制转录有关。

2016年，美国堪萨斯州立大学科研人员利用宏基因组测序技术，从患有皮炎肾病综合征（PDNS）和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新型猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 3，PCV3）。作为一种新发现病原体，PCV3对猪致病性及在猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）中作用以及现有商品化PCV2疫苗对其免疫效力等有待进一步研究。和PCV1、PCV2一样，PCV3病毒颗粒直径为17-20nm，核酸类型为单股DNA病毒，基因组长度为2000bp，包含有与复制相关的复制蛋白Rep和与抗原相关的抗原蛋白Cap。

一般而言，对三种或以上的病原进行同时PCR扩增较为困难，尤其三种核苷酸同源性低于80%，且基因组长度不同的病原进行检测，需要分别设计引物，再进行分别扩增。即一般需要设计6条引物，才可以对猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）进行扩增。但是6条引物在条件优化上均为繁琐复杂，且引物越多可能导致的潜在交叉可能性越大，较难达到相关研究目的。本发明最大的优点是基于猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的基因组结构特点，选择猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的基因组特异性保守区作为上游引物设计区域，在分别根据3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的基因组的差异区分别设计针对下游引物：P2引物设计区域为针对PCV1保守，但和PCV2和PCV3差异大；P3引物设计区域为针对PCV2保守，但和PCV1和PCV3差异大；P4引物设计区域为针对PCV3保守，但和PCV1和PCV2差异大。基于本原理设计的引物，条件优化简单、方便快速，结果观察方便，组装的试剂盒可用于猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的快速鉴别诊断。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术中的不足，提供了一种方便快速，结果观察方便的猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）鉴别PCR检测引物。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

用于鉴别PCV1、PCV2和PCV3的引物组，所述引物组其核苷酸序列如下所示：

引物P1：5’- TATTTTGGATGAYTTTTATGG-3’；

引物P2：5’- GCACACCCCGCCTTCAGAAA-3’；

引物P3：5’- CCAAACCTGTTCTTGATTCCACTA -3’；

引物P4：5’- AGTGCAAATAAAATCAATAGTT-3’。

所述的引物组用于检测PCV1、PCV2和PCV3的方法，包含以下步骤：

（1）从疑似临床样品中提取基因组DNA；

（2）以提取的DNA为模板，用所述的引物组PCR扩增；

（3）该组引物对PCV1、PCV2和PCV3均可有效扩增，其中PCV1为964bp，PCV2为563bp，PCV3为287bp。

所述的引物组在制备鉴别PCV1、PCV2和PCV33种猪圆环病毒PCR检测试剂盒上的应用。

本发明的优点在于：

本发明是基于猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的基因组结构特点，选择猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的基因组特异性保守区作为上游引物设计区域，在分别根据3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的基因组的差异区分别设计针对下游引物：P2引物设计区域为针对PCV1保守，但和PCV2和PCV3差异大；P3引物设计区域为针对PCV2保守，但和PCV1和PCV3差异大；P4引物设计区域为针对PCV3保守，但和PCV1和PCV2差异大。基于本原理设计的引物，条件优化简单、方便快速，结果观察方便，组装的试剂盒可用于猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的快速鉴别诊断。

附图说明

图1 3种猪圆环病毒基因组核苷酸比较。

图2引物P1设计区域。

图3引物P2设计区域。

图4引物P3设计区域。

图5引物P4设计区域。

图6 PCR产物凝胶电泳鉴定。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、毒株：

猪圆环病毒1型（PCV1）和猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）、猪细小病毒（PPV）、经典猪伪狂犬病毒（PRV）、变异型猪伪狂犬病毒（V-PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和保存。

2、主要试剂

EasyPure Viral DNA/RNA Kit购自北京全式金生物技术有限公司；PCR扩增试剂盒（Quick Taq HS DyeMix）购自TOYOBO公司。

3、核苷酸序列分析

选择PCV1代表株（PK株，GenBank登陆号DG650650；BJ-1株，GenBank登陆号FJ475129）PCV2代表株（JZ-9株，GenBank登陆号MH059556；PCV-45株，GenBank登陆号KC514989）和PCV3代表株（PCV3-CN2018LN-2株，GenBank登陆号MH277116；PCV3-CN2018LN-3株，GenBank登陆号MH277117）为例，选择DNAStar生物学软件进行核苷酸同源性比较，结果可见（图1）：PCV1和PCV3的基因组核苷酸同源性低于50%（47.3%左右）；PCV1和PCV2的基因组核苷酸在77.7%-77.8%之间；PCV2和PCV3的基因组核苷酸同源性低于50%（47.4%左右）。

4、引物设计

4.1 上游引物设计

基于核苷酸分析比对的分析结果，寻找猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的保守区来设计上游引物，设计的引物P1序列为：

引物P1：5’- TATTTTGGATGAYTTTTATGG-3’；

引物P1的设计区域见图2，该区域可对3种猪圆环病毒（PCV1、PCV2和PCV3），Y表示修饰引物。

4.2 下游引物设计

4.2.1 PCV1下游引物设计

基于核苷酸分析比对的分析结果，寻找猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的差异区来设计针对PCV1下游引物P2，序列为：

引物P2：5’- GCACACCCCGCCTTCAGAAA -3’；

引物P2的设计区域见图3（下游引物位反向互补区域），P2引物设计区域为针对PCV1保守，但和PCV2、PCV3差异大。

4.2.2 PCV2下游引物设计

基于核苷酸分析比对的分析结果，寻找猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的差异区来设计针对PCV2下游引物P3，序列为：

引物P3：5’- CCAAACCTGTTCTTGATTCCACTA -3’；

引物P3的设计区域见图4（下游引物位反向互补区域），P3引物设计区域为针对PCV2保守，但和PCV1、PCV3差异大。

4.2.3 PCV3下游引物设计

基于核苷酸分析比对的分析结果，寻找猪圆环病毒3种基因型（PCV1、PCV2和PCV3）的差异区来设计针对PCV3下游引物P4，序列为：

引物P4：5’- AGTGCAAATAAAATCAATAGTT -3’；

引物P4的设计区域见图5（下游引物位反向互补区域），P4引物设计区域为针对PCV3保守，但和PCV1、PCV2差异大。

5、PCR方法的建立

5.1 核酸DNA的提取

以试剂盒说明书进行，提取猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）、猪细小病毒（PPV）、经典猪伪狂犬病毒（PRV）、变异型猪伪狂犬病毒（V-PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）的基因组核酸DNA。

5.2 PCR条件优化

以提取PCV1、PCV2和PCV3的基因组DNA，分别作为模板。用所设计的特异性PCR引物P1和P2进行常规PCR扩增，并对退火温度（50-60）℃进行优化。按照Quick Taq HS DyeMix扩增试剂盒推荐的50 μL配置PCR反应液：Quick Taq HS DyeMix 25μL、上/下游引物（10 μM each）各1 μL、模板1μL、水补足至50 μL。经过优化后，55 ℃位最佳退火温度，此时PCV1（引物使用P1和P2）、PCV2（引物使用P1和P3）和PCV3（引物使用P1和P4）均可有效扩增。优化后的最佳反应条件为：94 ℃ 2min预变性；94 ℃ 40 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共30个循环，72 ℃总延伸10min。

5.3 引物浓度优化

以提取PCV1、PCV2和PCV3的基因组DNA，定量后混匀后作为模板，引物P1、P2、P3、P4分别按照（1：1：1：1、2：1：1：1、4：1：1：1、8：1：1：1、16：1：1：1、）分别进行优化。优化后的反应体系为Quick Taq HS DyeMix 25μL、引物P1（10 μM） 2 μL、引物P2（10 μM） 0.5 μL、引物P3（10μM） 0.5 μL、引物P4（10 μM） 0.5 μL、模板1μL、水补足至50 μL。

5.4 特异性实验

以优化后条件对猪群常见传染病，如猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）、猪细小病毒（PPV）、经典猪伪狂犬病毒（PRV）、变异型猪伪狂犬病毒（V-PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）进行扩增，判断本研究的特异性。结果可见（图6），仅PCV1（图6第1泳道）、PCV2（图6第2泳道）和PCV3（图6第3泳道）出现阳性特异性扩增条带，而PPV（图6第8泳道）、PRV（图6第9泳道）、V-PRV（图6第10泳道）、PRRSV（图6第11泳道）、PEDV（图6第12泳道）和阴性对照（图6第13泳道）均未见条带扩增。

5.5 结果判定

若出现扩增大小为964bp，判定为PCV1阳性（图6第1泳道）；若出现扩增大小为563bp，判定为PCV2阳性（图6第2泳道）；若出现扩增大小为287bp，判定为PCV3阳性（图6第3泳道）；若出现扩增大小为964bp和563bp，判定为PCV1和PCV2阳性（图6第4泳道）；若出现扩增大小为563bp和287bp，判定为PCV2和PCV3阳性（图6第5泳道）；若出现扩增大小为964bp和287bp，判定为PCV1和PCV3阳性（图6第6泳道）；若出现扩增大小为964bp、563bp和287bp，判定为PCV1、PCV2和PCV3阳性（图6第7泳道）；若未出现相关目的条带，则判定为检测结果阴性。

6、临床应用

应用本方法对临床送检179份猪PMWS病料进行检测，将病料按照常规方法研磨处理后，利用核酸提取试剂盒提取病毒的基因组DNA，利用优化后的方法和条件进行PCR检测。结果可见，PCV1单一阳性2份，阳性率为1.12%；PCV2单一阳性124份，阳性率为52.51%；PCV3单一阳性5份，阳性率为2.79%；PCV1和PCV2单一阳性4份，阳性率为2.23%；PCV1和PCV3单一阳性4份，阳性率为2.23%；PCV2和PCV3单一阳性14份，阳性率为7.82%；PCV1、PCV2和PCV3单一阳性3份，阳性率为1.68%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农科院畜牧兽医研究所

<120> 用于鉴别猪圆环病毒1、2、3型的引物组及其应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tattttggat gayttttatg g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcacaccccg ccttcagaaa 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccaaacctgt tcttgattcc acta 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agtgcaaata aaatcaatag tt 22

Claims (3)

1.用于鉴别PCV1、PCV2和PCV3的引物组，其特征在于：所述引物组其核苷酸序列如下所示：

引物P1：5’- TATTTTGGATGAYTTTTATGG-3’；

引物P2：5’- GCACACCCCGCCTTCAGAAA-3’；

引物P3：5’- CCAAACCTGTTCTTGATTCCACTA -3’；

引物P4：5’- AGTGCAAATAAAATCAATAGTT-3’。

2.如权利要求1所述的引物组用于检测PCV1、PCV2和PCV3的方法，其特征在于，包含以下步骤：

（1）从疑似临床样品中提取基因组DNA；

（2）以提取的DNA为模板，用权利要求1所述的引物组PCR扩增；

（3）该组引物对PCV1、PCV2和PCV3均可有效扩增，其中PCV1为964bp，PCV2为563bp，PCV3为287bp。

3.如权利要求1所述的引物组在制备鉴别PCV1、PCV2和PCV33种猪圆环病毒PCR检测试剂盒上的应用。