CN105695628B

CN105695628B - 一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的hrm检测引物及方法

Info

Publication number: CN105695628B
Application number: CN201610126868.5A
Authority: CN
Inventors: 马静云; 郭鹏举; 朱余军; 伍绮文
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2016-03-07
Filing date: 2016-03-07
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2036-03-07
Also published as: CN105695628A

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物及方法，该引物序列如SEQ ID NO：1~2所示，其特异性好，该引物对FMDV和SVV进行PCR扩增，然后通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据两者的熔解曲线不同来鉴别FMDV和SVV；利用所述引物进行PCR扩增后即可鉴别两种基因型，全部操作过程只需3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性探针，荧光饱和染料廉价易得；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

Description

一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物及方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，更具体地，涉及一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物及方法。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，FMDV）引起的急性、热性、高度接触性传染的动物疫病，侵染对象包括猪、牛、羊等主要畜种及其他偶蹄动物。发病猪的特征症状是发热，口鼻、蹄部和母猪乳头发生水泡，突然发生急性跛行，死亡剖检时可见虎斑心和出血性胃肠炎病变。口蹄疫传染性强，发病率高，国际动物卫生组织（OIE）将该病列为A类传染病之首；塞内加谷病毒（Seneca Valley virus SVV）是单股正链RNA病毒，是小核糖核酸病毒科Senecavirus病毒属的典型代表。其最初被认为是PER.C6细胞培养物中的污染物，随后在美国和加拿大的猪群中被分离， 2007年在美国一屠宰场的猪群中出现水疱性疾病临床症状，约80%的猪出现跛足，PCR检测猪口蹄疫、猪水疱病、水疱性口炎和水疱性疹均为阴性，而SVV却为阳性，从而被认为是原发性水疱性疾病。近期猪塞内加谷病毒（SVV）在巴西猪群中的感染与爆发，证明了猪塞内加谷病毒很有可能是猪的原发性水疱性疾病病原之一。2015年我国及巴西出现了几次SVV感染猪群并出现严重的临床发病及死亡症状，造成严重的经济损失。由于该病与口蹄疫的临床症状及解剖症状极为相似，在临床和组织病理学上很难区分，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技术，传统的检测方法费时费力，操作方法繁琐，不利于疾病的及时诊断治疗，造成重大的经济损失。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述检测引物的检测试剂盒。

本发明的第三个目的是提供上述检测引物或检测试剂盒的应用。

本发明的第四个目的是提供一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物，该引物为P1和P2，序列如SEQ ID NO：1~2所示。

P1：ACTTTTCTGAAAGATGAAAT（SEQ ID NO：1）。

P2：TTGTCDGCTGGAGTCAT（SEQ ID NO：2）。

本发明通过分析FMDV和SVV基因组，设计得到一对既能扩增FMDV又能扩增SVV的引物，利用该引物对FMDV和SVV进行PCR扩增，然后通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据两者的熔解曲线不同来鉴别FMDV和SVV。

本发明还提供一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测试剂盒，含有引物P1和P2；优选地，所述引物的浓度为0.5μM。

优选地，所述试剂盒还含有PCR反应缓冲液、荧光染料；更优选地，所述荧光染料为LC Green染料。

本发明还提供一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测方法，从待测样品中提取病毒基因组DNA作为模板DNA，利用权利要求1所述引物对对模板DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行HRM分析，根据HRM曲线鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒。

当所述基因组DNA为RNA时，其PCR扩增的反应体系为：模板DNA 1 µL，2×1-StepBuffer 12.5µL，PrimeScript 1-step Enzyme Mix 0.5µL，P1 1µL，P2 1µL，LC Green染料1µL，用双蒸水补足20µL；PCR的反应程序为：（i）50℃ 30 min；（ii）94℃预变性15min；（iii）94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，步骤（iii）循环35次；（iiii）72℃终延伸10min；80℃到93℃以0.3℃/s的熔解速率进行HRM分析。

当所述基因组DNA为cDNA时，其PCR扩增的反应体系为：模板DNA 2 µL，Premix Ex-Taq 10 µL，P1 1µL，P2 1µL，LC Green染料 1µL，用双蒸水补足20µL；PCR的反应程序为：（i）94℃预变性5min；（ii）94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，步骤（ii）循环35次；（iii）72℃终延伸10min；80℃到93℃以0.3℃/s的熔解速率进行HRM分析。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物，该引物特异性好，该引物对FMDV和SVV进行PCR扩增，然后通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据两者的熔解曲线不同来鉴别FMDV和SVV；利用所述引物进行PCR扩增后即可鉴别两种基因型，全部操作过程只需3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性探针，荧光饱和染料廉价易得；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

附图说明

图1为猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒标准样品HRM标准化熔解曲线。

图2为猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒标准样品HRM峰型化熔解曲线。

图3为猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒临床样品HRM标准化熔解曲线。

图4为猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒临床样品HRM峰型化熔解曲线。

图5为猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒PCR-HRM引物特异性凝胶电泳图。

图6为对比例1所述猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒峰型化熔解曲线。

图7为对比例2所述猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒峰型化熔解曲线。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。

实施例1 PCR引物设计

根据猪口蹄疫病毒和猪塞内加谷病毒基因序列设计出扩增猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒部分基因序列的引物对P1和P2，其碱基序列如下所示。

P1：ACTTTTCTGAAAGATGAAAT（SEQ ID NO：1）；

P2：TTGTCDGCTGGAGTCAT（SEQ ID NO：2）。

实施例2 标准样品的制备及其PCR-HRM分析

（1）病毒RNA的提取：

用天根的核酸自动抽取仪分别提取病料样品中的猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒RNA。病料样品可以是水泡液、水泡皮等易于获得且对动物体无严重伤害的样品；也可以是心脏、气管等组织样品。

（2）质粒的制备

分别取经过测序确定为猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的RNA作为模板，分别以P1和P2为引物（0.5μM）进行RT-PCR扩增，其扩增反应体系为：

模板 1 µL

2×1-Step Buffer 12.5µL

PrimeScript 1-step Enzyme Mix 0.5µL

引物P1 1µL

引物P2 1µL

LC green染料 1µL

ddH₂O 3µL

总体积 20µL。

RT-PCR扩增的反应程序为：（i）50℃ 30 min；（ii）94℃预变性15min；（iii）94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s；（iiii）72℃终延伸10min，其中，步骤（iii）循环35次；80℃到93℃以0.3℃/s的熔解速率进行HRM分析。

将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化。

用TaKaRa公司的试剂盒将纯化后的cDNA连接至pMD-19T载体中，载体连接反应体系如下（10μl）：

反应条件：16℃，4h以上。

将连接产物转化至DH5a感受态细胞，挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，送测序。

（3）质粒的PCR-HRM操作步骤

分别以上述获得的猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的两种阳性质粒为DNA模板，分别进行PCR- HRM扩增反应和分析；PCR-HRM反应体系为：

质粒模板 2 µL

Premix Ex-Taq 10 µL

引物P1 1µL

引物P2 1µL

LC Green染料 1µL

ddH₂O 5µL

总体积 20µL。

PCR-HRM扩增反应程序：（i）95℃预变性5min；（ii）95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s；（iii）72℃终延伸10min；其中，步骤（ii）循环35次；80℃到93℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。

（4）质粒的PCR-HRM结果分析

PCR扩增产物用Rotor-Gene Q分析仪进行分析。猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的质粒HRM（高分辨率熔解曲线，High Resolution Melting curve）结果如图1、图2所示。

从图1所示的标准化熔解曲线图上可看出，猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒质粒的熔解曲线相互分开，表明所设计引物适合用于HRM分析。

从图2 所示的峰型化熔解曲线图上可看出，两种质粒熔解曲线形状也不同，猪口蹄疫病毒质粒的峰型化熔解曲线图只有一个峰，而猪塞内加谷病毒质粒峰型化熔解曲线图有两个峰，从而可以明显的区分。

实施例3 临床样品PCR-HRM分析

（1）从临床样本中提取病毒RNA：方法同上述实施例2中 RNA提取方法；（2）以提取的病毒RNA为模板，进行RT-PCR扩增，其扩增反应体系为：

模板 1 µL

2×1-Step Buffer 12.5µL

PrimeScript 1-step Enzyme Mix 0.5µL

引物P1 1µL

引物P2 1µL

LC green染料 1µL

ddH₂O 3µL

总体积 20µL。

RT-PCR扩增的反应程序为：（i）50℃ 30 min；（ii）94℃预变性15min；（iii）94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s；（iiii）72℃终延伸10min，其中，步骤（iii）循环35次；80℃到93℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。

对扩增产物进行HRM分析，确定病毒的基因型。本实施例检测了15份临床样品，PCR-HRM的结果如图3、图4所示。

从图3、图4所示的15份临床样品标准化和峰型化熔解曲线图上可看出，有9份样品为猪塞内加谷病毒，有6份样品为猪口蹄疫病毒。

实施例4 特异性实验

分别提取其他常见猪病毒RNA，如提取水泡性口炎病毒（Vesivular stomatitisvirus, VSV）和猪水泡病病毒（Swine vesicular disease virus, SVDV）的RNA分别作为RNA模板，以上述实施例3中的RT-PCR方法分别进行RT-PCR反应，将PCR产物进行凝胶电泳分析，并与猪塞内加谷病毒和猪口蹄疫病毒阳性样品PCR产物进行对比分析，电泳结果如图5所示。图5中的M为Marker（DL2000 DNA marker），泳道1-5分别为1：SVV，2：FMDV，3：VSV，4：SVDV，5：阴性对照，凝胶电泳结果显示，猪塞内加谷病毒和猪口蹄疫病毒阳性样品在626bp左右有目的条带，而其它样品均未出现电泳条带，表明所设计的引物特异性高适合用于HRM分析。

实施例5 检测试剂盒的组装

一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测试剂盒，包含以下成分：浓度为0.5μM、体积分别为1μL的引物P1和P2，0.5µL PrimeScript 1-step Enzyme Mix，12.5µL2×1-Step Buffer，1µL LC green染料。

利用所述试剂盒进行检测的PCR-HRM扩增反应程序为：（i）95℃预变性5min；（ii）95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s；（iii）72℃终延伸10min；其中，步骤（ii）；循环35次；80℃到93℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。

对比例1

利用实施例1所述方法设计引物（序列如SEQ ID NO：3~4），并用实施例2所述方法进行PCR-HRM扩增，结果表明：SVV跟FMDV样品的HRM峰型化熔解曲线都只有一个单峰，且Tm值变化不明显，不能区分，见图6。

引物1：ATGACTCCTGCCAAC（SEQ ID NO：3）

引物2：CCATAACTGGTTTGTA（SEQ ID NO：4）

对比例2

利用实施例1所述方法设计引物（序列如SEQ ID NO：5~6），并用实施例2所述方法进行PCR-HRM扩增，结果表明：SVV跟FMDV样品的HRM峰型化熔解曲线都只有一个单峰，且Tm值变化不明显，不能区分，见图7。

引物1：GTACGCGCCGGCAAGACTCGCA（SEQ ID NO：5）

引物2：GTCGCGGCACAACCAGACGG（SEQ ID NO：6）。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物及方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> P1

<400> 1

acttttctga aagatgaaat 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> P2

<400> 2

ttgtcdgctg gagtcat 17

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 对比例1所述引物1

<400> 3

atgactcctg ccaac 15

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 对比例1所述引物2

<400> 4

ccataactgg tttgta 16

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 对比例2所述引物1

<400> 5

gtacgcgccg gcaagactcg ca 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 对比例2所述引物2

<400> 6

gtcgcggcac aaccagacgg 20

Claims

1.一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物，其特征在于，该引物为P1和P2，序列如SEQ ID NO：1~2所示。

2.一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述引物。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为0.5μM。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有PCR反应缓冲液、荧光染料。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为LC Green染料。

6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，使用方法为：从待测样品中提取病毒基因组，利用权利要求1所述引物对模板进行PCR扩增，对扩增产物进行HRM分析，根据HRM曲线鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，当所述模板为RNA时，其PCR扩增的反应体系为：模板 1 µL，2×1-Step Buffer 12.5µL，PrimeScript 1-step Enzyme Mix0.5µL，P1 1µL，P2 1µL，LC Green染料 1µL，用双蒸水补足20µL。

8.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，当所述模板为RNA逆转录的cDNA时，其PCR扩增的反应体系为：模板 2 µL，Premix Ex-Taq 10 µL，P1 1µL，P2 1µL，LC Green染料 1µL，用双蒸水补足20µL。

9.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，其PCR的反应程序为：（i）50℃ 30min；（ii）94℃预变性15min；（iii）94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，步骤（iii）循环35次；（iiii）72℃终延伸10min；80℃到93℃以0.3℃/s的熔解速率进行HRM分析。

10.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，其PCR的反应程序为：（i）94℃预变性5min；（ii）94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，步骤（ii）循环35次；（iii）72℃终延伸10min；80℃到93℃以0.3℃/s的熔解速率进行HRM分析。