CN101220390B

CN101220390B - 一种快速提取植物样本dna的方法

Info

Publication number: CN101220390B
Application number: CN2007100603085A
Authority: CN
Inventors: 王永; 兰青阔; 程奕; 张丽华; 朱珠; 赵新
Original assignee: Central Laboratory of Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Central Laboratory of Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2007-12-18
Filing date: 2007-12-18
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2027-12-18
Also published as: CN101220390A

Abstract

本发明公开了一种改进的快速用于提取植物样本DNA的方法，它是将待测植物样品在液氮中研磨至粉末，然后加入一定量的CTAB提取缓冲液，经处理，取上清液放于离心管中，加入上清液1/10倍体积的3mol/L乙酸钠溶液和0.8倍体积的异丙醇，混合均匀，离心5-10min，弃上清；向沉淀中加入10％Chelex-100溶液，离心，取上清即为样品DNA，可直接用于PCR扩增。本发明采用的DNA提取方法，60分钟就可以完成样本DNA提取的全过程。所提取的DNA质量标准满足了后续PCR扩增的要求，更适合于生产、科研过程中快速提取样品DNA的目的。

Description

一种快速提取植物样本DNA的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及模板DNA的制备方法。更具体的说是一种采用改进的快速用于提取植物样本DNA的方法。

背景技术

分子生物学技术已经渗透到生物学、医学、植物学、遗传学和动物学等各个方面。DNA提取的质量和产量是直接影响PCR扩增的关键步骤，自1985年PCR技术问世以来，这一技术已被应用到生命科学的各信息领域，因其敏感性高、特异性强、操作简便、所需时间短等优点已被广泛用于多种检测领域。PCR检测技术的第一步就是模板DNA的制备，即样本中DNA的提取，这直接影响着PCR反应的结果。长期以来，样本中DNA的提取和纯化一直是耗时、繁琐的过程，严重减慢了检测速度。因此，许多学者一直在探索各种样本DNA的快速提取方法。

当今科学技术的飞速发展使很多方法及试剂商品化，大大缩短了提取DNA的时间，但是相应的使价格成倍的增长。因此，从具体的实验要求，样本的大小、实验室的条件和经济等方面考虑，寻找简便、成本较低的方法很有必要。提取DNA的方法主要有传统法、螯合树脂法、玻璃粉法、磁珠法、免疫亲和法等。每种方法都有其自身的优缺点，总结如下：

(1)传统法通过CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)或SDS(十二烷基硫酸钠)裂解细胞，酚/氯仿等有机溶剂抽提蛋白，适用于大多数标本DNA提取、纯化，获得DNA纯度高，含量多。但比较费时，需要5小时甚至更多，流程繁琐，同时样品需要用4-5个EP管，容易造成混淆和污染，操作复杂，要通过裂解细胞、去蛋白、沉淀DNA等过程，方法不易掌握及推广，而且操作过程中使用了大量有机溶剂，有损实验人员健康。

(2)玻璃粉法靠玻璃粉吸附提取DNA，适用于土壤标本，提取方法简便，可用于土壤中细菌DNA的提取，但不能彻底除去PCR抑制剂。

(3)磁珠法靠磁珠吸附、磁场分离提取DNA，适用于冰冻、陈旧组织，简单、快速整个过程仅需不到2小时，利用磁场分离可以得到较纯的DNA，但产量比传统方法获得的少，成本较高。

(4)免疫亲和法通过抗原抗体反应来提取DNA，适用于样本含量很少的标本，获得DNA纯度高，含量多。缺点是设备要求比较高，而且抗DNA单克隆抗体制备是关键的一步。

(5)螯合树脂法使用Chelex-100树脂来提取DNA，据报道该方法目前用于细菌、血液及部分病毒核酸提取，操作简单、快速、且成本不高。同时避免使用酚氯仿等有机试剂，对操作人员没有损害。

Chelex-100是一种不溶于、酸、碱溶液、有机溶剂的高分子化合物，由苯乙烯和苯乙二烯组成。在pH值为4-14的环境中可保持其自身的稳定性。其外型呈白色颗粒状，无味，由苯乙烯和二乙烯基苯的聚合形成高聚物骨架，官能基成对的二乙酸亚胺离子连接在骨架上。

Walsh最初用Chelex-100作为金属离子鳌合剂来提取人类DNA，利用人类细胞在含有5％Chelex-100悬液中煮沸时可使细胞膜破裂释放出DNA，同时与二价金属离子鳌合，从而避免样品中存在的金属离子在高温和低离子强度条件下作为催化剂使DNA降解。一步完成提取过程，同时获得纯度较高的DNA。X.deLamballerie等用Chelex-100螯合柱从培养和临床标本中快速提取细菌及病毒DNA用于PCR反应。对150例临床标本提取DNA进行PCR检测分枝杆菌，结果表明用此方法比碱裂解后，传统的蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法可获得更多的(5例)阳性样本。5例标本中有3例培养为阳性。目前Chelex-100法在法医鉴定中也广泛应用，现已经逐渐扩展到其他学科，如肿瘤学的研究。用此法提取的DNA操作简便，并可以减少提取过程中DNA的损失，常用于从十分微量的样品中(如毛发，血液、精斑和上皮脱落细胞中等)中提取足量的DNA。植物细胞与动物和微生物细胞相比具有细胞壁，所以核酸不易释放出来。本发明将CTAB裂解细胞壁的功能和chelex-100结合，提高了植物样本DNA提取效率。

发明内容

本发明的目的在于克服传统样本DNA提取步骤多、复杂、费事等缺点，公开一种采用改进的快速用于提取植物样本DNA的方法。本发明的DNA提取方法具有简单、易行、污染小、快速、节约样品和耗材的优点。

本发明的技术方案如下：

一种采用改进的快速用于提取植物样本DNA的方法，其特征在于它按如下步骤进行：

(1)取待测植物样本100mg于研钵中加入液氮研磨至粉末，放入灭菌离心管内；

(2)加入600-800μL十六烷基三甲基溴化铵提取缓冲液，蜗旋混匀，置于65℃水浴锅中恒温水浴30-50min，12000r/min，离心5-10min；

(3)取上清液分别放于另一离心管中，并加入所得上清液体积的1/10倍体积的3mol/L乙酸钠溶液和0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀，然后在转数12000-15000r/min，离心5-10min，弃上清；

(4)向沉淀中加入100-200μL，5％-10％Chelex-100溶液，并使沉淀充分溶解在溶液中，12000-15000r/min，离心10-15min，取上清，保存，用于PCR扩增。

本发明所述的待测样本为植物样品包括转基因植物样品。本发明所述的待测样本也可为植物新鲜组织、愈伤组织、干性粉末及简单加工产品(例如面粉、大豆粉)。

本发明所述的离心速度为12000r/min；离心时间5-10min。优选的离心速度为12000r/min；离心5-10min；加上10％Chelex-100溶液，加入的量为200μL。

为了能更加清楚的说明本发明的提取方法，下面以转基因作物大豆为样本实例，对本发明的提取方法与传统的CTAB法分别加以比较对照说明。

一、材料和方法

(1)样品：转基因大豆，本实验室保存。

(2)主要仪器：高速冷冻离心机，凝胶电泳设备，PCR扩增仪，恒温水浴锅。

(3)主要试剂：

PCR引物由上海生工公司合成，引物序列见表1。

Taq酶和dNTP等试剂购自Promega公司。

Chelex-100购自sigma公司。

10％Chelex-100溶液：称量10g Chelex-100，加入90mL去离子水，121℃灭菌，用时混匀。

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液：1000mL水中溶解CTAB20g，Tris 12.11g，NaCl 81.82g，Na2EDTA 7.44g，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)20g，高压灭菌；

3mol/L乙酸钠溶液，100mL水中溶解40.8g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，高压灭菌。其他试剂购自上海生工。

表1转基因大豆内源基因和外源基因的引物序列

检测基因	引物序列	扩增片断长度	基因性质
				LectinCaMV35SNosCp4-epsps	正：5’-gcc ctc tac tcc acc ccc atc c-3’反：5’-gcc cat ctg caa gcc ttt ttg tg-3’正：5’-gct cct aca aat gcc atc a-3’反：5’-gat agt ggg att gtg cgt ca-3’正：5’-gaa tcc tgt tcc cgg tct tg-3’反：5’-tta tcc tag ttt gcg cgc ta-3’正：5’-cct tca tgt tcg gcg gtc tcg-3’反：5’-gcg tca tga tcgggc tcg a tg-3’	118bp195bp180bp498bp	内源基因外源基因外源基因外源基因

二、转基因大豆DNA的两种提取方法的比较

1、CTAB法提取DNA

(1)取转基因大豆约100mg，放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎。液氮反复加入3～4次，磨碎成粉末为止。

(2)加入1.5mL预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样(依试样不同，可适当增加缓冲液的用量)，65℃保育60min，期间不停颠倒混匀；

(3)约12000r/min离心10min。转移上清至一新离心管，加入1倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分混合。约12000r/min离心15min。转移上清至一新离心管中；

(4)加入1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混合。约12000r/min离心15min。转移上清至一新离心管中；

(5)加入2倍体积CTAB沉淀缓冲液，室温静置保育60min；12000r/min离心15min，弃上清；加入350μL氯化钠溶液溶解沉淀；12000r/min离心10min，转移上清至一新离心管。

(6)加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min。12000r/min离心15min。弃上清。加入500μL70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12000r/min离心10min。弃上清。

(7)干燥DNA沉淀，加100μL水或TE缓冲液溶解DNA。

2、本发明方法提取DNA：

(1)取转基因大豆约100mg于研钵中加入液氮研磨至粉末，放入灭菌离心管内。

(2)加入800μL CTAB DNA提取缓冲液，涡旋混匀，置于65℃水浴锅中恒温水浴40min，12000r/min，离心5min。

(3)取上清液于一新离心管中，加入所得上清液的体积的1/10倍体积的3mol/L乙酸钠溶液和0.8倍体积的异丙醇，12000r/min，离心5min，弃上清。

(4)沉淀中加入200μL10％Chelex-100，并使沉淀充分溶解在溶液中，12000r/min，离心10min，取上清，保存，用于PCR扩增。

二、两种方法提取DNA的PCR扩增检测试验：

1、PCR反应体系组成：

10×PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)2.5μL，dNTP溶液(各为10mmol/μL)0.5μL，正反引物(10pmol/μL)各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，模板5μL，水补足反应体系，使总体积为25μL。

2、PCR反应程序：

循环参数为94℃预变性5min，再按94℃变性40s、55℃复性40s、72℃延伸40s，40个循环，最后72℃延伸5min。

3、产物鉴定：扩增产物加入EB的2.0％琼脂糖凝胶上电泳，

电泳条件，电压：100V；时间：40分钟。

紫外灯下观察，用DL2000做分子量标记。

4、PCR的扩增结果：

对两种方法提取的DNA，分别进行大豆内源基因lectin，外源基因CaMV35S、nos和Cp4-epsps PCR的扩增，凝胶电泳结果见附图。结果显示，两种方法提取的DNA内源和外源基因的扩增结果是基本一致的。

本发明与现有技术相比所具有的积极效果在于：

(1)传统的核酸模板提取方法操作步骤多、复杂、费事。需要经过裂解细胞、去除蛋白、DNA沉淀等多个步骤。而且由于需要在多个离心管之间相互转移标本，增加了对标本间交叉污染的可能性。另外所用的酚氯仿等有机溶剂对人体有害。而本发明的改进的DNA提取方法过程简单，整个提取过程在两个离心管中进行。避免使用有毒有机试剂，所使用的提取溶液无毒无害，对人体和环境都不会造成危害。

(2)本方法最大的优点在于其过程快速。与常规的提取过程需要5小时左右相比。采用本法，60分钟就可以完成样本DNA提取的全过程。

(3)采用本发明的快速提取样本DNA的方法所得到的DNA经凝胶电泳实验、PCR检测实验，证实与传统方法得到的DNA基本一致，完全可以采用此方法替代复杂、费事的传统CTAB法。从而大大的节省了时间，可广泛应用于实时监控生产、科研进程或临床化验等过程。

附图说明

图1为两种方法提取的DNA凝胶电泳结果图。

其中M表示：DL2000；1是：改良Chelex-100法；2表示：CTAB法。

图2为CaMV35S、NOS、Cp4-epsps和lectin的PCR扩增结果。

其中M表示：DL2000；1，3，5，7表示：CaMV35S、NOS、Cp4-epsps和lectin的扩增产物(CTAB法)；2，4，6，8表示：CaMV35S、NOS、Cp4-epsps和lectin的扩增产物(本发明方法)。

图3为油菜的内源基因hmg扩增结果。

其中M为DL2000MARKER，1为空白对照；2，3为本发明方法提取DNA的扩增产物。

图4为玉米的内源基因zSSIIb扩增结果。

其中M DL2000MARKER，1空白对照；2，3本发明方法提取DNA的扩增产物。

图5为大豆内源lectin扩增结果。其中M为DL2000MARKER，1为空白对照；2，3为本发明方法提取DNA的扩增产物。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

以市场销售的油菜籽为样本，采用本发明方法快速提取DNA。制备方法如下：

(1)取油菜籽约100mg于研钵中加入少量液氮迅速磨碎。液氮反复加入3～4次研磨至粉末，放入灭菌离心管内。

(2)加入800μL CTAB DNA提取缓冲液，蜗旋混匀，置于65℃水域锅中恒温水浴0.5h，12000r/min离心5min。

(3)取上清液于灭菌离心管中，并加入上清液1/10倍体积的3mol/L乙酸钠溶液和0.8倍体积的异丙醇，12000r/min，离心5min，弃上清。

(4)沉淀中加入100μL10％Chelex-100，并使沉淀充分溶解在溶液中，12000r/min，离心10min，取上清，保存，用于PCR扩增。

PCR检验：

1、对油菜编码高移动簇蛋白I/Y(high mobile group protein I/Y)基因进行扩增，引物序列为：

hmg-F：5′-TCCTTCCGTTTCCTCGCC-3′；

hmg-R：5′-TTCCACGCCCTCTCCGCT-3′；

预期扩增片段大小为206bp。

2、反应体系：

试剂

体积

无菌水10×PCR缓冲液(含镁离子)dNTPs混合溶液10μmol/L上游引物10μmol/L下游引物5U/μL Taq酶DNA模板总体积

11.5μL2.5μL0.5μL0.5μL0.5μL0.5μL5.0μL25μL

3、反应程序：

94℃变性5min；进行35次循环扩增反应(94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸40s；72℃延伸7min。

4、产物鉴定：扩增产物加入EB的2.0％琼脂糖凝胶上电泳，

电泳条件：电压100V；时间：40分钟。紫外灯下观察，用DL2000做分子量标记。

5、结果：油菜籽的hmg扩增结果见图3。其中，M为DL2000MARKER，1为空白对照；2，3为本发明方法提取DNA的扩增产物。

实施例2

以本院农场的玉米籽粒为样本，采用本发明方法快速提取DNA。

(1)取玉米约100mg于研钵中，加入液氮研磨至粉末，放入灭菌离心管内；

(2)加入800μL十六烷基三甲基溴化铵提取缓冲液，蜗旋混匀，置于65℃水浴锅中恒温水浴40分钟，15000r/min离心8min；

(3)取上清液于离心管中，并加入上清液体积的1/10倍体积的3mol/L乙酸钠溶液和0.8倍体积的异丙醇，混合均匀，15000r/min离心8min，弃上清；

(4)向沉淀中加入200μL 10％Chelex-100溶液，并使沉淀充分溶解在溶液中，12000r/min，离心10min，取上清，检验DNA，保存，用于PCR扩增。

PCR检验：

1、引物序列

对编码玉米淀粉合酶异构体的zSTSII-2基因进行扩增

zSSIIb-F：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′；

zSSIIb-R：5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′；

预期扩增片段大小为88bp。

2、反应程序

95℃变性5min；进行35次循环扩增反应(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长)；72℃延伸7min。

3、反应体系

试剂

体积

15.5μL2.5μL0.5μL0.5μL0.5μL0.5μL5.0μL25μL

4、产物鉴定：扩增产物加入EB的2.0％琼脂糖凝胶上电泳，

5结果：玉米的zSSIIb扩增结果见图4。其中M为DL2000MARKER，1为空白对照；2，3为本发明方法提取DNA的扩增产物。

实施例3

以本室收集的大豆愈伤组织为样本，采用本发明方法快速提取DNA。

(1)取样品约100mg于研钵中加入液氮研磨至粉末，放入灭菌离心管内；

(2)加入600μL十六烷基三甲基溴化铵提取缓冲液，蜗旋混匀，置于65℃水浴锅中恒温水浴40分钟，12000r/min，离心10min；

(3)取上清液放于离心管中，并加入1/10倍体积的3mol/L乙酸钠溶液和0.8倍体积的异丙醇，混合均匀，12000r/min，离心10min，弃上清；

(4)向沉淀中加入100μL，10％Chelex-100溶液，并使沉淀充分溶解在溶液中，15000r/min，离心10min，取上清，保存，用于PCR扩增。

1、PCR反应体系组成：

2、循环参数为94℃预变性5min，再按94℃变性40s、55℃复性40s、72℃延伸40s，40个循环，最后72℃延伸5min。

3、产物鉴定：扩增产物加入EB的2.0％琼脂糖凝胶上电泳，

4、PCR的扩增结果：

对大豆内源基因lectin内源进行扩增，凝胶电泳结果见图5。其中M为DL2000MARKER，1为空白对照；2，3为本发明方法提取DNA的扩增产物。

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。

Claims

1.一种采用改进的快速用于提取植物样本DNA的方法，其特征在于它按如下步骤进行：

(4)向沉淀中加入100-200μL，5％-10％Chelex-100溶液，并使沉淀充分溶解在溶液中，12000-15000r/min，离心10-15min，取上清，保存，用于PCR扩增；其中所述的待测植物样本为转基因大豆。