CN118147278A - 一种适于西瓜kasp分型的dna快速提取方法 - Google Patents

一种适于西瓜kasp分型的dna快速提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN118147278A
CN118147278A CN202410372512.4A CN202410372512A CN118147278A CN 118147278 A CN118147278 A CN 118147278A CN 202410372512 A CN202410372512 A CN 202410372512A CN 118147278 A CN118147278 A CN 118147278A
Authority
CN
China
Prior art keywords
extraction method
watermelon
method suitable
convex
kasp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410372512.4A
Other languages
English (en)
Inventor
方小雪
刘洁
靳志恒
张铖锋
刘卉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ningbo Weimeng Seed Co ltd
Original Assignee
Ningbo Weimeng Seed Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ningbo Weimeng Seed Co ltd filed Critical Ningbo Weimeng Seed Co ltd
Priority to CN202410372512.4A priority Critical patent/CN118147278A/zh
Publication of CN118147278A publication Critical patent/CN118147278A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法，包括：S1：取西瓜叶片置于8连管中，并将12个8连管放入1.6ml的96孔深孔板中；S2：向8连管中加入等量的TPS裂解液，并向每个管中加入一粒钢珠，密封后进行震荡破碎处理；S3：将8连管进行干燥处理，随后离心；S4：冷却至室温后，打开8连管，并将其从96孔深孔板中取出，依次吸取每个8连管的上清液至凸面96孔PCR板；S5：在凸面96孔PCR板中加入预冷的异丙醇，密封凸面96孔PCR板并混匀进行离心，弃上清液；S6：在凸面96孔PCR板中加入乙醇，密封处理后混匀后进行离心，弃上清液，晾干后加入适量ddH2O溶解，完成提取。本发明提供了一种快速、经济、安全、有效的适于西瓜KASP分型的DNA提取方法。

Description

一种适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法。
背景技术
西瓜(Citrullus lanatus)是重要的园艺经济作物，我国是世界第一西瓜生产和消费大国。随着生物技术的快速发展，西瓜育种已从传统的杂交育种逐渐转向杂交育种与分子辅助选择相结合的育种方式，采用分子标记辅助选择可以在苗期进行精准选择，减轻田间选育的工作量，提高选育的准确性和效率，大幅缩短育种周期。
在分子辅助育种中，需要在特定时间内快速高效的完成DNA提取与基因分型工作，因此DNA提取是分子标记辅助选择育种的关键基础。目前常用的DNA提取方法有CTAB法、碱裂解法、磁珠法、试剂盒法等。CTAB法虽然所得DNA质量较高，但需使用氯仿有毒试剂，且步骤较多，耗时长；碱裂解法是利用NaOH溶液裂解细胞释放DNA，步骤简便，耗时短，但DNA溶液的PH不稳定，DNA质量较差；磁珠法是目前提取质量与通量都比较高的DNA提取方法，但所需试剂价格较高，不适于较少标记的大批量的商业化分子标记辅助选择育种；试剂盒法虽然提取DNA质量高，但成本较高，不适于大量样品的商业育种。
目前，分子标记辅助育种主要是利用基于PCR技术的各类分子标记来进行基因分型，包括Indel、SSR、CAPS、dCAPS和KASP等分子标记，其中KASP分子标记在PCR之后无需进行电泳或者酶切，直接利用仪器读取荧光信号即可快速完成基因分型，具有分型准确、成本低、检测通量高等特点，是目前开展高通量基因分型主要的标记之一，但为确保分型效果，KASP-PCR反应体系要求模板DNA浓度相对一致。因此，探索快速、经济、安全、有效的适于西瓜KASP分型的DNA提取方法在推动西瓜育种具有十分重要的意义。
目前的研究中西瓜DNA提取方法主要是CTAB法、碱裂解法、磁珠法、试剂盒法等。CTAB法虽然所得DNA质量较高，但需使用氯仿有毒试剂，且步骤较多，耗时长；碱裂解法是利用NaOH溶液裂解细胞释放DNA，步骤简便，耗时短，但DNA溶液的PH不稳定，DNA质量较差，不适于进行KASP基因分型；磁珠法是目前提取质量与通量都比较高的DNA提取方，但成本也较高，不适于较少标记的大批量的商业化分子标记辅助选择育种。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一种适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法，以解决现有技术步骤较多、耗时长、不稳定、提取质量差、成本高的问题。
为解决上述问题，本发明提供了一种适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法，包括以下步骤：
S1：取西瓜叶片置于8连管中，并将12个8连管放入96孔深孔板中；
S2：向所述步骤S1操作后的所述8连管中加入等量的TPS裂解液，并向每个管钢珠一粒，密封后进行震荡破碎处理；
S3：将所述步骤S2处理后的所述8连管放入干燥箱中进行沸水浴或恒温干燥处理，随后离心；
S4：冷却至室温后，打开所述步骤S3处理后的8连管，并将所述8连管从所述96孔深孔板中取出，依次吸取每个所述8连管的上清液至凸面96孔PCR板；
S5：在所述步骤S4处理后的所述凸面96孔PCR板中进一步加入预冷的异丙醇，密封所述凸面96孔PCR板后进行离心处理，弃上清液；
S6：在所述步骤S5处理后的所述凸面96孔PCR板中加入乙醇溶液，随后进行离心处理，晾干后加入适量ddH2O溶解，完成适于西瓜KASP分型的DNA的提取。
作为优选的方案，所述步骤S1中，所述西瓜叶片通过打孔器切下后置入所述8连管。
作为优选的方案，所述步骤S2中，所述TPS裂解液组成为每100ml TPS裂解液含有10ml 1M Tris-HCl(PH＝8.0),2ml 0.5M EDTA(PH＝8.0),KCl 7.45g，加入ddH2O定容至100ml。
作为优选的方案，所述步骤S2中，所述震荡破碎处理的条件为：通过高通量组织研磨仪以40-60Hz震荡破碎20-60s。
作为优选的方案，所述步骤S2中，所述钢珠为经无水乙醇清洗并烘干的3mm钢珠。
作为优选的方案，所述步骤S2以及所述步骤S5中，所述密封的条件为：通过硅胶盖密封。
作为优选的方案，所述步骤S3中，所述沸水浴时间为3min；
作为优选的方案，所述步骤S2干燥处理的温度为65℃，时间为30min。
作为优选的方案，所述步骤S3、所述步骤S5以及所述步骤S6中，所述离心的条件为：以4000rpm离心10min。
作为优选的方案，所述步骤S4也可用使用96通道移液工作站进行上清吸取。
作为优选的方案，所述步骤S6中，所述乙醇溶液的浓度为75％。
与现有技术相比较，本发明提供的西瓜DNA提取方法具有如下优点：
1)本发明的提取方法以打孔器取定量的西瓜叶片为材料，所提DNA浓度相对一致，无需对每个样品逐一进行浓度均一化，符合KASP分型的需求；
2)本发明的提取方法以8连管和96深孔板为耗材，相比于其他离心管通量更高、试剂消耗量更低；相比于用96孔深孔板提取DNA，8连管可以在每个管壁标注样品名称，方便取样与核对，减少取样出错，而且在吸取上清液时可以将8连管从深孔板取出，可以清晰看到上清液的位置，有效减少杂质吸入，利于高质量DNA提取；
3)本发明与现有技术中采用CTAB法相比，无需使用有毒的氯仿有机试剂，具有步骤较少、低毒、低成本的优点；与现有技术中采用较碱裂解法比较，具有所得DNA质量稳定，KASP分型效果好的优点；较磁珠法具有成本低、门槛低的优点；
并且本发明所得DNA置于96孔PCR板，可以直接利用高通量移液工作站进行KASP-PCR体系构建，无需再次转移模板，适于高通量自动化的分子标记辅助选择。
附图说明
图1为碱煮法提取定量西瓜叶片DNA的检测结果图；
图2为用2ml离心管以CTAB法提取不定量西瓜叶片的DNA检测结果图；
图3为本发明一种适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法提取法提取DNA检测结果图；
图4为利用不同基因型的DNA样本进行PCR扩增并电泳检测提取DNA的结果图；
图5为扩增产物的荧光检测结果图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法，包括以下步骤：
S1：取西瓜叶片置于8连管中，并将12个8连管放入1.6ml的96孔深孔板中；
S2：向所述步骤S1操作后的所述8连管中加入等量的TPS裂解液，并向每个管钢珠一粒，密封后进行震荡破碎处理；
S3：将所述步骤S2处理后的所述8连管放入干燥箱中进行干燥处理，随后离心；
S4：打开所述步骤S3处理后的8连管，并将所述8连管从所述96孔深孔板中取出，依次吸取每个所述8连管的上清液至凸面96孔PCR板；
S5：在所述步骤S4处理后的所述凸面96孔PCR板中进一步加入预冷的异丙醇，密封所述凸面96孔PCR板后进行离心处理，弃上清液；
S6：在所述步骤S5处理后的所述凸面96孔PCR板中加入乙醇溶液，随后进行离心处理，晾干后加入适量ddH2O溶解，完成适于西瓜KASP分型的DNA的提取。
优选的，所述步骤S1中，所述西瓜叶片通过打孔器切下后置入所述8连管。
作为优选的方案，所述步骤S2中，所述TPS裂解液组成为每100ml TPS裂解液含有10ml 1M Tris-HCl(PH＝8.0),2ml 0.5M EDTA(PH＝8.0),KCl 7.45g，加入ddH2O定容至100ml。
作为优选的方案，所述步骤S2中，所述震荡破碎处理的条件为：通过高通量组织研磨仪以40-60Hz震荡破碎20-60s。
作为优选的方案，所述步骤S2中，所述钢珠为经无水乙醇清洗并烘干的3mm钢珠。
优选的，所述步骤S2以及所述步骤S5中，所述密封的条件为：通过硅胶盖密封。
优选的，所述步骤S3中，所述沸水浴时间为3min；
优选的，所述步骤S2干燥处理的温度为65℃，时间为30min。
优选的，所述步骤S3、所述步骤S5以及所述步骤S6中，所述离心的条件为：以4000rpm离心10min。
优选的，所述步骤S4也可用使用96通道移液工作站进行上清吸取。
优选的，所述步骤S6中，所述乙醇溶液的浓度为75％。
以下结合实际的数据以及实验方法对本发明上述技术方案进行展开的描述：
实施例
以下实施例通过本发明所述DNA快速提取方法提取西瓜DNA：
本发明所述的适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法，包括如下步骤：
S1：在西瓜幼苗子叶展平期，用打孔器取直径6mm的圆形西瓜叶片置于1.2ml的8连管中，并将12个8连管放入1.6ml的96孔深孔板中；
S2：使用8道分液仪向每个管中加入200ul TPS裂解液，用钢珠分样器向每个管中加入钢珠一粒，盖上硅胶盖，利用高通量组织研磨仪以40-60Hz震荡破碎20-60s；
S3：将上述离心管进行沸水浴3min或置于65℃恒温干燥箱中30min，冷却至室温后以4000rpm离心10min；
S4：冷却至室温后，缓慢打开硅胶垫，将8连管从深孔板中拿出，用8道移液器依次吸取上清液100ul至凸面96孔PCR板；
S5：用8道分液仪向上步骤中凸面96孔PCR板中加入100ul预冷的异丙醇，盖上硅胶盖，混匀后4000rpm离心10min，弃上清；
S6：加入100ul 75％的乙醇，混匀后4000rpm离心10min，弃上清，置于通风橱中晾干后，加入适量ddH2O溶解后即可用于KASP-PCR体系构建等实验。
通过超微量分光光度计NanoDrop 8000对DNA质量及浓度进行检测。
图1为碱煮法提取定量西瓜叶片DNA的检测结果，其OD260/280低于1.5，表明DNA中蛋白质杂质较多，浓度较为一致；图2为用2ml离心管以CTAB法提取不定量西瓜叶片的DNA检测结果，其OD260/280介于1.81-2.03，所含蛋白杂质较少，但浓度差异较大，不利于KASP分型；C为本发明提取法提取DNA检测结果，其OD260/280介于2.0-2.1之间，DNA中蛋白杂质较低，浓度一致性较好，利于KASP分型；本发明提取DNA浓度均一性较好，且质量与CTAB相近，均优于碱煮法。同时利用不同基因型的DNA样本进行PCR扩增并电泳检测提取DNA有无污染，如图2所示泳道单带与双带相间，未发生单带变双带情况，说明无污染。
本发明DNA提取方法与现有技术中的CTAB法提取的DNA的KASP-PCR基因分型无差异，比碱煮法提取的DNA分型更好，可以保证分子标记辅助选择的有效开展，同时本发明方法步骤简单、试剂种类少、低毒、成本低、提取效率高。本发明DNA提取方法不仅可以用于西瓜叶片的DNA提取，还可以用于其他瓜类植物的DNA提取，例如，发明人使用本发明DNA提取方法提取了黄瓜、丝瓜、蒲瓜叶片DNA并成功进行多个引物的KASP分型。
利用KASP引物对西瓜DNA进行分型
使用本发明对已知基因型的西瓜叶片进行DNA提取，同时使用碱煮法和CTAB法做对照，并进行KASP基因分型，如附图1所示本发明所提取的DNA为模板进行KSAP基因分型。
KASP-PCR的体系为2.5ul KASP master mix，2.5ul模板DNA，0.07ul KASP引物。
KASP-PCR的程序为94℃下预变性15分钟，然后在94℃变性20s；61℃-55℃下退火60s，共10个循环，61℃为第一个循环的退火温度，之后每个循环退火温度降低0.6℃；然后94℃变性20s；55℃退火延伸60s，共28个循环,12℃保温。
对扩增产物进行荧光检测，如附图5A所示，以2ml离心管CTAB法提取的DNA的KASP分型较为分散，说明DNA浓度差异大影响分型的聚类效果。本发明提取DNA的KASP分型效果良好，3种荧光信号的样品聚类清晰，边界明显(图5B)。
通过上述实施例以及与现有技术的比较，也是进一步地证明了，本发明提供的一种适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法解决了现有技术中存在的问题，提供了一种快速、经济、安全、有效的适于西瓜KASP分型的DNA提取方法。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：取西瓜叶片置于8连管中，并将12个8连管放入96孔深孔板中；
S2：向所述步骤S1操作后的所述8连管中加入等量的TPS裂解液，并向每个管中加入一粒钢珠，密封后进行震荡破碎处理；
S3：将所述步骤S2处理后的所述8连管进行沸水浴或放入恒温干燥箱中进行干燥处理，随后离心；
S4：冷却至室温后，打开所述步骤S3处理后的8连管，并将所述8连管从所述96孔深孔板中取出，依次吸取每个所述8连管的上清液至凸面96孔PCR板；
S5：在所述步骤S4处理后的所述凸面96孔PCR板中进一步加入预冷的异丙醇，密封所述凸面96孔PCR板后充分混匀并进行离心处理，弃上清液；
S6：在所述步骤S5处理后的所述凸面96孔PCR板中加入乙醇溶液，密封所述凸面96孔PCR板后充分混匀，随后进行离心处理，晾干后加入适量ddH2O溶解，完成适于西瓜KASP分型的DNA的提取。
2.根据权利要求1所述的适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述西瓜叶片通过打孔器切下后置入所述8连管。
3.根据权利要求1所述的适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述TPS裂解液的组成为每100ml TPS裂解液含有10ml 1M Tris-HCl(PH＝8.0),2ml 0.5M EDTA(PH＝8.0),KCl 7.45g，加入ddH2O定容至100ml。
4.根据权利要求1所述的适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述震荡破碎处理的条件为：通过高通量组织研磨仪以40-60Hz震荡破碎20-60s。
5.根据权利要求1所述的适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述钢珠为经无水乙醇清洗并烘干的3mm钢珠。
6.根据权利要求1所述的适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法，其特征在于：所述步骤S2以及所述步骤S5中，所述密封的条件为：通过硅胶盖密封。
7.根据权利要求1所述的适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述恒温干燥处理的温度为65℃，时间为30min，所述沸水浴时间为3min。
8.根据权利要求1所述的适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法，其特征在于：所述步骤S3、所述步骤S5以及所述步骤S6中，所述离心的条件为：以4000rpm离心5-10min。
9.根据权利要求1所述的适于西瓜KASP分型的DNA快速提取方法，其特征在于：所述步骤S6中，所述乙醇溶液的浓度为75％。
CN202410372512.4A 2024-03-29 2024-03-29 一种适于西瓜kasp分型的dna快速提取方法 Pending CN118147278A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410372512.4A CN118147278A (zh) 2024-03-29 2024-03-29 一种适于西瓜kasp分型的dna快速提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410372512.4A CN118147278A (zh) 2024-03-29 2024-03-29 一种适于西瓜kasp分型的dna快速提取方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118147278A true CN118147278A (zh) 2024-06-07

Family

ID=91300581

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410372512.4A Pending CN118147278A (zh) 2024-03-29 2024-03-29 一种适于西瓜kasp分型的dna快速提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118147278A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101717815B (zh) 军团菌快速检测与分型方法
CN101712953B (zh) 用于评价动物肠道微生物群落多样性的dna提取方法
CN113151567B (zh) 用于鉴别花脸香蘑n006#菌株的ssr分子标记及方法
WO2017147946A1 (zh) 微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法
CN110343754A (zh) 一种用于造血干细胞移植供体病原微生物快速检测的方法
CN103320425B (zh) 一种用于大规模、高通量基因分型的贝类dna快速提取方法
CN101709298A (zh) 一种用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤dna提取方法
CN108333159B (zh) 一种检测样品菌种相对含量的方法
CN118147278A (zh) 一种适于西瓜kasp分型的dna快速提取方法
CN110735003A (zh) 细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法
CN101367858B (zh) 一种快速提取和纯化植物病组织中病原菌dna的方法
CN101220390B (zh) 一种快速提取植物样本dna的方法
CN114517238A (zh) 一种用于鉴定金耳zjje001菌种的ssr分子标记及方法
CN108642166B (zh) 利用梨花粉单细胞进行基因组单倍型组装的方法
CN110846434A (zh) 一种鉴别茶树品种的引物、试剂盒及其鉴别方法
CN112501156A (zh) 一种海洋贝类生物沉积物总dna的高效提取方法
CN110592074B (zh) 一种快速的藻类dna提取方法
CN117625740B (zh) 一种从Trizol样品中快速提取适用于高通量测序的DNA的方法
CN109280699A (zh) 一种基于ddRAD方法的新品种鉴定方法
CN111440847B (zh) 一种高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术
CN108060160A (zh) 一种用于fish探针标记的bac-dna的快速制备方法
CN114807121A (zh) 一种柑橘dna快速提取方法
CN112646804A (zh) 一种提取土壤中环境dna的方法
CN113502319A (zh) 一种适用于芯片检测粪便细菌dna提取的裂解液及其制备方法
CN111206072A (zh) 一种适用于pcr扩增的真菌基因组dna的提取方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination