CN108642166B - 利用梨花粉单细胞进行基因组单倍型组装的方法 - Google Patents

利用梨花粉单细胞进行基因组单倍型组装的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了利用梨花粉单细胞进行基因组单倍型组装的方法，利用体外花粉生长的特性结合酶法去除细胞壁制备单个无细胞壁的花粉原生质体，利用动物单细胞扩增技术对单倍型的单个花粉细胞进行全基因组扩增并测序。利用测序所获得的单倍型花粉基因组信息，采用‘12位二进制码’对38,304条人工染色体进行编号的方式建立每条人工染色体与‘砀山酥梨’两个亲本之间的联系。最后结合大部分BAC在锚定参考基因组中的定位情况，分别对砀山酥梨34条单倍型的染色体进行了独立的单倍型组装。这种方法有助于后续果树植物基因组的研究，为后续的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源。

Description

利用梨花粉单细胞进行基因组单倍型组装的方法
技术领域
本发明属于植物基因组领域，涉及梨花粉单细胞的全基因组扩增，即利用单个花粉细胞的全基因组信息进行单倍体分型，具体涉及从花粉单细胞中制备花粉原生质体并利用动物单细胞扩增试剂盒进行全基因组扩增，最后通过12个花粉单细胞的测序结果对梨基因组38,304条人工染色体(BAC，artificial chromosome)进行单倍型分型。这种方法的结合适用于植物单倍型基因组的组装，也适用于动物单倍型基因组的组装，同时利用我们的方法可以结合人工染色体(BAC)，fosmid，10X genome和单分子测序序列等长读长测序技术让单倍型基因组组装更完美。
背景技术
果树作为经济作物不仅能在农业产业结构调整、农民增收等方面具有重要意义，同时在国内外园林绿化中具有非常重要的地位。然而大多数果树都属于多年生木本植物，其生命周期长，并且由于自交不亲和性机制的存在，其基因组的杂合度较高，这导致了果树植物的遗传背景复杂且不清晰，也限制了果树分子生物学和基因组学的深入研究。
随着近年基因组测序技术的快速发展，不断有果树基因组被测序完成，目前至少有20种果树基因组草图已经绘制完成，这不仅为后续的果树基因组结构和功能研究提供了强大的信息平台，同时对于探究果树的进化起源、功能基因性状定位具有非常重要的指导意义。然而，由于杂合度高以及大量重复序列的存在，许多果树物种的基因组组装仍停留在草图阶段，很难实现真正意义上的全基因组组装与染色体锚定，其中主要原因是受限于二代测序读长短以及碱基偏性。因此，为从技术上解决基因组测序问题，基于二代测序技术建立起来的，例如BAC，fosmid，等长读长测序技术；被称为第三代测序技术的单分子测序技术以及一些辅助基因组组装的Hi-seq等测序技术被不断的应用，同时生物信息技术的不断更新也加速了果树基因组的组装质量的提升，但单倍型基因组的组装依旧是个难题。
本专利首先利用花粉单细胞原生质体制备技术以及单细胞扩增技术从单个花粉细胞中获得‘砀山酥梨’基因组中的单倍体信息，随后通过花粉单倍体信息对梨基因组人工染色体序列进行单倍体分型，最后分别组装出两套单倍型梨基因组，并纠正了参考基因组中的嵌合组装问题，这为梨后续的生物学研究提供了强大的平台。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对单个花粉进行单细胞基因组扩增的方法。
本发明的另一目的在于提供一种利用花粉单细胞单倍体特性对人工染色体进行单倍型分型的方法。
本发明的又一目的是为了解决复杂基因组组装，提供一种高效而便利的方法。
本发明的另一目的是提供一种加速梨等高度杂合植物的单倍型基因组组装的方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种对单个花粉进行单细胞基因组扩增的方法，包括以下步骤：
(a)培养花粉并制备花粉原生质体：向花粉培养基中加入少量花粉进行花粉培养；然后向花粉培养基中添加细胞裂解液并进行培养破除花粉的细胞壁，采用毛细玻璃吸管获取已经破除细胞壁的单个花粉原生质体细胞；
(b)扩增及纯化花粉单细胞基因组：将已经破除细胞壁的单个花粉原生质体细胞放入由单细胞全基因组扩增试剂盒提供的细胞裂解液中，采用单细胞全基因组扩增试剂盒进行扩增，然后将扩增产物进行纯化。
步骤(a)中所述花粉培养基的配方为：1.60mM硼酸，1.40mM硫酸镁，0.2mM硝酸钙，292mM蔗糖，25mM MES(Methanesulfonic acid hydrate)，pH 6.0～6.5；
步骤(a)中所述细胞裂解液的配方为：35～40％山梨醇，0.4％(w/v)离析酶R-10，1.0％(w/v)纤维素酶。
所述花粉培养的条件为：花粉培养基中加入少量花粉后轻微震荡，使花粉与培养基充分接触，置于28℃摇床，130～210转/分钟，避光培养40～60分钟。
所述细胞裂解液的添加量为：细胞裂解液与花粉培养基的体积比为3:1；向花粉培养基中添加细胞裂解液进行培养的条件为：用移液抢缓慢混匀后于30℃摇床40～100转/分钟，避光培养5～20分钟。
采用毛细玻璃吸管获取已经破除细胞壁的单个花粉原生质体细胞的过程为：将火焰拉针仪参数设置为加热温度550℃，拉伸速率10，延迟1次，压力值500，拉出尖端孔径大约16微米毛细玻璃吸管；将毛细玻璃吸管安装到显微操纵器上，在显微镜下寻找已经破除细胞壁的花粉原生质体细胞，所选取的花粉原生质体细胞活力好且花粉粒已经接近扁平状态以保证花粉内遗传物质溶出。
步骤(b)中采用单细胞全基因组扩增试剂盒进行扩增的条件为30℃反应8小时，65分钟灭活10分钟；
步骤(b)中将扩增产物进行纯化的步骤为：
(1)在每个单细胞全基因组扩增结束后的反应液中分别加入100～150微升AmpureXP珠子；
(2)涡旋或者用移液枪反复进行抽打使溶液充分混匀；
(3)室温放置使DNA与珠子充分结合；
(4)将所有混合液体移入EP管中并用磁性分离设备将珠子吸附在管壁上，直至溶液变得完全澄清并且保证溶液中没有悬浮的小珠子；
(5)当样品全部被吸附到珠子旁边的EP管壁上后，吸出上清液；
(6)保持珠子稳定结合在EP管壁上，分别在每个样本中加入500微升80％的乙醇溶液,然后将乙醇溶液吸出用以除去反应液中的杂质，此步骤重复一次；
(7)确保EP管内没有任何乙醇残留并室温放置3～5分钟，直至Ampure XP珠子变成半干状态；
(8)加入超纯水，将EP管从磁性分离设备上移除，并使Ampure XP珠子与超纯水充分混合；
(9)将EP管继续放置在磁性分离设备上使磁珠吸附在管壁上，静止后收集洗脱溶液得到纯化的扩增产物。
一种利用花粉单细胞单倍体特性对人工染色体进行单倍型分型的方法，对单个花粉进行单细胞全基因组扩增并测序，采用‘12位二进制码’利用花粉单细胞全基因组测序数据对人工染色体进行单倍型分型。
作为一种优选技术方案，所述的花粉为梨花粉，利用12个梨花粉单细胞全基因组测序数据对梨38304条BAC数据进行单倍型分型的过程为：
第一，每个BAC通过使用SOAPDenovo软件进行独立组装，参数K＝27；
第二，使用bwa将12个单细胞的测序数据比对到每个组装好的BAC序列上，基于SNP位点，通过GATK进行SNP calling；梨的基因组共有17对染色体，因此通过比对信息能够将比对到参考基因组中染色体水平的BAC分成17个组；
第三，通过统计比对到参考基因组上的BAC的12位二进制位标签将这部分BAC分别归类到两个倍型中，利用12个单细胞的SNP情况将每一个BAC分配到2个倍型中，使用一组12位的二进制标签去代表12个单细胞与BAC之间的关系，通过统计所有12位二进制标签的出现频率以及他们之间的距离关系就能将不同类型的BAC分配到对应的单倍型染色体中，而在参考基因组中没有确定位置关系的BAC序列也能够通过12位二进制标签被分配到相应的单倍型染色体中。
本发明公开了植物花粉单细胞扩增以及如何利用单细胞扩增后单倍型基因组信息进行植物单倍型基因组的分型和组装。具体的：利用体外花粉生长的特性结合酶法去除细胞壁制备单个无细胞壁的花粉原生质体，利用动物单细胞扩增技术对单倍型的单个花粉细胞进行全基因组扩增并测序。利用测序所获得的单倍型花粉基因组信息，采用‘12位二进制码’对38,304条人工染色体进行编号的方式建立每条人工染色体与‘砀山酥梨’两个亲本之间的联系。最后结合大部分BAC在锚定参考基因组中的定位情况，分别对砀山酥梨34条单倍型的染色体进行了独立的单倍型组装。这种方法有助于后续果树植物基因组的研究，为后续的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源。
本发明所述的室温为25±5℃。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
(1)目前无法实现对梨花粉单细胞进行全基因组的扩增，限制了梨单细胞基因组学的研究。
(2)对于一些杂合度高，含大量重复序列的物种，很难实现单倍型基因组的组装，并且由于无法准确分型，在基因组组装过程中往往会导致嵌合组装，冗余组装等一系列问题，这也限制了后续的生物学研究。
附图说明
图1为本发明中梨花粉的萌发以及花粉管的活力。
其中，a：梨花粉培养1个小时后的花粉管生长情况；b：梨花粉培养2个小时后的花粉管生长情况。
图2为本发明中采用酶法进行的梨花粉原生质制备。
其中，a：结合梨花粉管的生长特性利用生物酶对花粉管细胞壁降解后原生质体的制备情况；b：利用玻璃毛细管获取单个梨花粉原生质体。
图3为本发明中根据梨叶片DNA作为模板进行PCR扩增测试。
图4为本发明中利用测试成功的引物对每个花粉单细胞扩增产物完整性进行PCR验证。
图5为本发明中建立的梨花粉和人工染色体之间的流程示意图。
其中，a：通过12位二进制码建立12个梨花粉单细胞与BAC之间的关系。用‘1’代表一致，用‘0’代表不一致或者缺失，接着每个BAC会被标记上一个12位二进制码；最后通过统计所有碱基的12位二进制码为每条BAC分配到一条特异的12位二进制码；b：不同单倍型BAC会被标记上不同的12位二进制码；c：确定部分能够比对到参考基因组染色体上的BAC的染色体定位信息：d：结合BAC定位以及12位二进制码对BAC进行单倍型分型。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1梨花粉原生质体的制备
花粉培养基配方：1.60mM硼酸，1.40mM硫酸镁，0.2mM硝酸钙，292mM蔗糖，25mM MES(Methanesulfonic acid hydrate)，PH 6.0～6.5。
细胞裂解液配方：35～40％(g/100ml)山梨醇，0.4％(w/v，g/100ml)离析酶R-10，1.0％(w/v，g/100ml)纤维素酶。
实验步骤：1、培养基中加入少量梨花粉，轻微震荡，使花粉与培养基充分接触，置于28℃摇床，130～210转/分钟，避光培养40～60分钟，完成培养后于显微镜下观察花粉水合情况(图1)。2、按照3:1的比例(细胞裂解液：花粉培养基)往培养基中添加细胞裂解液，随后移液抢缓慢混匀后于30℃摇床40～100转/分钟，避光培养5～20分钟，培养结束后于显微镜下观察，确定原生质体制备情况。3、将火焰拉针仪参数设置为：加热温度550℃，拉伸速率10，延迟1次，压力值500，拉出尖端孔径大约16微米毛细玻璃吸管。4、将毛细管安装到显微操纵器上，在显微镜下寻找已经破除细胞壁的花粉原生质体细胞(注：选取原生质体一定要挑活力最好的并且花粉粒已经接近扁平状态的，以保证花粉内遗传物质的溶出)，获取并放入由Sygni TruePrimeTM单细胞全基因组扩增试剂(Sygnis,Heidelberg,Germany)提供的10微升细胞裂解液中，用移液抢进行快速轻微抽打，使原生质体与细胞裂解液充分混匀(注意：避免产生气泡)(图2)。
实施例2梨花粉单细胞的扩增以及纯化
根据Sygni TruePrimeTM单细胞全基因组扩增试剂盒的使用说明步骤依次加入中和液、反应缓冲溶液以及扩增酶，30℃反应8小时，65分钟灭活10分钟。
为了高效的纯化单细胞扩增产物，本试验采用Aliquot AMPure XP珠子(Bechman,California,America)进行分离纯化。步骤如下：
1、在每个单细胞扩增结束后的反应液中分别加入100～150微升Ampure XP珠子。
2、涡旋或者用移液枪反复进行抽打混匀至少十次使溶液充分混匀。
3、室温放置至少10分钟,使DNA与珠子充分结合。
4、将所有混合液体移入1.5mLEP管中并用磁性分离设备将珠子吸附在管壁上，直至溶液变得完全澄清并且保证溶液中没有悬浮的小珠子，此过程至少5分钟。
5、当样品全部被吸附到磁珠旁边的EP管壁上后，吸出上清液。
6、保持珠子稳定结合在EP管壁上，分别在每个样本中加入500微升80％(v/v)的乙醇溶液，30秒后继续将乙醇溶液吸出用以除去单细胞反应液中的杂质，此步骤重复一次。
7、确保离心管内没有任何乙醇残留并室温放置3到5分钟，直至Ampure XP珠子变成半干状态。
8、加入40微升超纯水，将离心管从磁性分离设备上移除，并使Ampure XP珠子与超纯水充分混合。
9、将EP管继续放置在磁性分离设备上使磁珠吸附在管壁上，静止1分钟后收集洗脱溶液。
实施例3梨花粉单细胞的扩增以及纯化
利用植物基因组DNA提取试剂盒(TianGen,Beijing,China)，根据试剂盒使用步骤对梨叶片DNA进行提取。根据参考基因组序列设计11条marker引物(表1)，通过叶片DNA进行测试(图3)。测试完成后通过11条marker引物分别对各个单细胞纯化产物的完整性进行PCR验证。PCR程序：94℃10分钟，94℃30秒、61℃退火30秒、72℃延生1分钟(35个循环)，72℃10分钟。
表1为本发明中根据物种基因组信息设计的marker引物
Figure BDA0001666103370000061
实施例4利用梨花粉细胞单内的基因组信息进行梨基因组单倍型分型
利用梨单细胞测序数据对梨38304条BAC数据进行倍型分离：
第一，每个BAC通过使用SOAPDenovo软件进行独立组装，参数K＝27(Luo et al.,2012)。
第二，使用bwa(Li&Durbin,2009)将12个单细胞的测序数据比对到每个组装好的BAC序列上，基于SNP位点，通过GATK进行SNP calling(Van der Auwera et al.,2013)。理论上，每条BAC都是纯合的，单细胞比对到BAC上面不会出现随机的杂合位点，因此为了避免单细胞扩增错误而导致随机SNP位点的干扰，我们将部分随机SNP位点进行了过滤。通过blast(Boratyn et al.,2013)将所有BAC比对到参考基因组的每条染色体上，某条BAC被认为是某个染色体上的条件是其比对到参考基因组中该染色体的同源性高于80％。梨的基因组共有17对染色体，因此通过比对信息我们能够将比对到参考基因组中染色体水平的BAC分成17个组。
第三，通过统计比对到参考基因组上的BAC的12位二进制位标签，并结合我们设计的perl语言脚本程序将这部分BAC分别归类到两个倍型中。我们利用12个单细胞的SNP情况将每一个BAC分配到2个倍型中。在本研究中，我们使用了一组12位的二进制标签去代表12个单细胞与BAC之间的关系，比如：BAC1，BAC2，BAC3以及BAC4都比对到了梨基因组中的1号染色体上，而BAC1，2,3,4的12位二进制标签分别为101011110101，010100001010，111011110101和000100001010，通过比较12位二进制标签可以明显的发现BAC1与BAC2，BAC3与BAC4是分别来自于不同父母本的序列，利用这种方法就能确定BAC1与BAC3是属于同一个单倍型，而BAC2与BAC4是属于另外一个单倍型，这样就能对同源染色体进行区分。最后通过统计所有12位二进制标签的出现频率以及他们之间的距离关系就能将不同类型的BAC分配到对应的单倍型染色体中。而在参考基因组中没有确定位置关系的BAC序列也能够通过12位二进制标签被分配到相应的单倍型染色体中(表2)。
表2 分型后每条染色体上主要12位二进制码分布情况
Figure BDA0001666103370000071
Figure BDA0001666103370000081

Claims (1)

1.一种利用花粉单细胞单倍体特性对人工染色体进行单倍型分型的方法，其特征在于，对单个花粉进行单细胞全基因组扩增并测序，采用‘12位二进制码’利用花粉单细胞全基因组测序数据对人工染色体进行单倍型分型；
所述的花粉为梨花粉，利用12个梨花粉单细胞全基因组测序数据对梨38304条BAC数据进行单倍型分型，进行单倍型分型的过程为：
第一，每个BAC通过使用SOAPDenovo软件进行独立组装，参数K=27；
第二，使用bwa将12个单细胞的测序数据比对到每个组装好的BAC序列上，基于SNP位点，通过GATK进行SNP calling；梨的基因组共有17对染色体，因此通过比对信息能够将比对到参考基因组中染色体水平的BAC分成17个组；
第三，通过统计比对到参考基因组上的BAC的12位二进制位标签将这部分BAC分别归类到两个倍型中，利用12个单细胞的SNP情况将每一个BAC分配到2个倍型中，使用一组12位的二进制标签去代表12个单细胞与BAC之间的关系，通过统计所有12位二进制标签的出现频率以及他们之间的距离关系就能将不同类型的BAC分配到对应的单倍型染色体中，而在参考基因组中没有确定位置关系的BAC序列也能够通过12位二进制标签被分配到相应的单倍型染色体中。
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