CN106434911A - 一种165基因靶区域富集测序方法 - Google Patents

一种165基因靶区域富集测序方法 Download PDF

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Abstract

根据TCGA、NCCN、FDA等的癌症基因组及药物数据，筛选入组基因165个。其中包含NCCN推荐检测基因、FDA已批准靶药和重要临床期药物相应靶基因、影响靶药用药效果的基因、影响化药敏感性及毒副作用的基因等。本发明通过探针捕获技术一次性富集165个基因的外显子区域，实现多基因多靶点并行深度高通量测序，可同时检测基因的多种变异类型(如点突变，缺失，插入，融合，拷贝数扩增)，在检测的深度和准确度上均优于现有的技术。

Description

一种165基因靶区域富集测序方法
技术领域
本发明涉及基因工程和生物技术检测领域，具体涉及一种用于165基因靶区域富集方法，用于循环肿瘤DNA(ctDNA)多靶点并行深度高通量测序，且同时检查基因的多种变异类型，如突变，缺失，插入，融合，拷贝数扩增，在检测的深度和广度上均优于现有的技术。
背景技术
循环DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中，其主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在。循环DNA作为一种新的肿瘤标志物，将在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面发挥重要作用，尤其对于一些不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤可避免复杂的、具有创伤性的活检。
循环肿瘤DNA(ctDNA)，是指肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，随着基因测序的飞速发展，目前，已能在血液中对其进行检测并计数。ctDNA来自肿瘤细胞的体细胞突变，不同于遗传突变的是其存在于体内每个细胞。因此，ctDNA是一种特征性的肿瘤生物标记物，并且还可以被定性、定量和追踪。与组织活检相比ctDNA检查微创小、无放射性污染、经济、新DNA无防腐剂污染等优点，并允许对治疗反应实时监测。
针对ctDNA的检测有数字PCR、BEAMing技术、标记扩增深度测序(TAM-Seq)、癌症个体化深度测序(CAPP-Seq)，但这些方法是对已知突变的检测，已知突变的信息获得麻烦，并且检测范围有限。除此外还有全基因组测序、全外显子测序，这些方法不需要已知突变信息，但是成本昂贵。
根据TCGA、NCCN、FDA等的癌症基因组及药物数据，筛选入组基因165个。其中包含NCCN推荐检测基因、FDA已批准靶药和重要临床期药物相应靶基因、影响靶药用药效果的基因、影响化药敏感性及毒副作用的基因等。本发明通过探针捕获技术一次性富集165个基因的外显子区域，实现多基因多靶点并行深度高通量测序，可同时检测基因的多种变异类型(如点突变，缺失，插入，融合，拷贝数扩增)，在检测的深度和准确度上均优于现有的技术。
发明内容
165基因靶区域的富集及建库
提取5个不同样本血浆中的游离DNA，将DNA定量后分别溶解在50ul ddH2O中，进行文库构建。
1.准备末端修复所需试剂，10×KAPA End Repair Buffer，KAPA End RepairEnzyme Mix置于冰上溶解，5个样本DNA分别按照以下体系进行末端修复。
将混合液上下吹打混匀后，置于20℃孵育30min。
2.AMPure XP磁珠纯化
2.1.让AMPure XP bead在室温放置至少30min，充分混匀AMPure XP bead悬浮液；
2.2.在1.5ml新管中加入1.7倍体积混匀的AMPure XP beads悬浮液和修复后的5个DNA样品，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；
2.3.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
2.4.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
2.5.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
2.6.重复步骤5；
2.7.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量
3.连接A尾。将上述磁珠分别溶解在50ul A尾连接体系中，体系如下
PCR级ddH2O 42ul
10×KAPA A-Tailing Buffer 5ul
KAPA A-Tailing Enzyme 3ul
将混合液上下吹打混匀后，置于30℃孵育30min。
4.纯化A尾连接产物
4.1向50ul连接产物中加入90ul融解的室温下的PEG/NaCl SPRI溶液，混匀混合物后室温静置15min以结合磁珠
4.2短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
4.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
4.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
4.5.重复步骤4.4；
4.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量
5.样本DNA连接接头
将上述磁珠分别溶解在47ul连接接头的体系中，体系如下
PCR级水 32ul
5×KAPA Ligation Buffer 10ul
KAPA T4DNA Ligase 5ul
将体系混匀后，每个样本中加入3ul含有不同Index的接头。上下吹混数次后，置于20℃孵育15min。
6.纯化接头连接产物
6.1向50ul连接产物中加入50ul融解的室温下的PEG/NaCl SPRI溶液，混匀混合物后室温静置15min以结合磁珠.
6.2短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
6.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
6.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
6.5.重复步骤5；
6.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量
6.7加入22ul ddH2O溶解DNA，混匀后室温5min，充分溶解，置于磁力架上静置2min，吸取22ul上清。
7.捕获前扩增
扩增前将引物用ddH2O溶解，并将Pre-Capture LM-PCR Master Mix置于冰上溶解，配置如下反应体系
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2x) 25ul
Pre LM-PCR Oligos 1&2,5μM* 5ul
文库DNA 20
将上述混合液混匀并置于PCR仪中，执行如下程序
反应结束后得到的即是捕获前PCR样本。
8.纯化捕获前前PCR产物
8.1.在1.5ml新管中加入1.4倍体积混匀的AMPure XP beads悬浮液和5个PCR产物，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；
8.2.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
8.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
8.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
8.5.重复步骤5；
8.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量
8.7.在磁力架上取下离心管加入52ul ddH2O，充分溶解DNA，室温下静置5min后，置于磁力架上，吸取50ul上清于新的离心管中。
9.文库杂交
9.1杂交前的准备，分别溶解SeqCap HE Universal Oligo和SeqCap HE IndexOligo至终浓度为1000uM置于-20℃.
9.2准备杂交混合样本，将5个不同Index的样本定量，并且相同比例混合至1.25ug。
9.3准备提高混合杂交的引物池，在冰上溶解1000uM的SeqCap HE UniversalOligo和SeqCap HE Index Oligo，混合比例为50％的SeqCap HE Universal Oligo和50％的SeqCap HE Index Oligos，总引物量为2000pmol，具体实施如下表
组分含量
9.4准备杂交样本
9.4.1取5ul COT Human DNA(1mg/ml)加入1.5ml离心管中
9.4.2将1.25ug的混合文库加入到9.4.1的离心管中
9.4.3将2000pmol的混合引物SeqCap HE Universal Oligo和SeqCap HE IndexOligo加入到离心管中。
具体实施如下
将上述混合液置于具孔的离心管中并置于60℃真空浓缩，向管中加入7.5ul 2×Hybridization Buffer和3ul of Hybridization Component A，充分混匀，以最大转速离心10s后置于95℃孵育10min。以最大转速离心10s。
向上述管中加入4.5ul的杂交探针SeqCap EZ probe pool，最终混合物如下表
将上述混合物混匀后，置于47℃中，17h，热盖温度为57℃
10.洗涤回收捕获产物
洗涤回收前准备，将10×Wash Buffers(I,II,III and Stringent)和2.5×BeadWash Buffer稀释成1×。
提前将1×Stringent Wash Buffer、1×Wash Buffer I置于47℃中预热
洗涤前磁珠的准备，吸取100ul磁珠在室温下放置30min，涡旋15s，置于磁力架上，静置5min后弃掉上清，加入200ul的1×Bead Wash Buffer，涡旋10s，置于磁力架上，弃掉上清。再加入200ul的1×Bead Wash Buffer，涡旋10s，置于磁力架上，弃掉上清。
10.1磁珠结合DNA。将磁珠加入到15ul杂交文库中，上下吹打10次后置于47℃45min，每隔15min涡旋3s。
10.2洗涤DNA结合磁珠，加入100ul预热到47℃的1×Wash Buffer I至15ul含有磁珠的文库中，转移到1.5ml EP管中，置于磁力架上，弃掉上清，加入200ul 47℃预热的1×Stringent Wash Buffer，上下弹打混匀，迅速置于47℃热浴上
10.3重复10.2操作一次。
10.4将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入200ul室温下的1X Wash BufferI，涡旋2min。将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入200ul室温下的1×Wash BufferII，涡旋1min。将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入200ul室温下的1×Wash BufferIII，涡旋30s。将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入50ul ddH2O，置于-20℃下保存。
11.捕获后文库扩增
扩增前将引物用ddH2O溶解，并将Post-LM-PCR Master Mix置于冰上溶解，配置如下反应体系
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2x) 25ul
Post-LM-PCR Oligos 1&2,5μM* 5ul
涡旋文库使磁珠混匀，取20ul加入到上述混合体系中，混匀并置于PCR仪中，执行如下程序
反应结束后得到的即是捕获前PCR样本。
12.纯化最终文库
12.1.让AMPure XP bead在室温放置至少30min，充分混匀AMPure XP bead悬浮液；
12.2.在1.5ml新管中加入1.8倍体积混匀的AMPure XP beads悬浮液和PCR样品，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；
12.3.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
12.4.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
12.5.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
12.6.重复步骤5；
12.7.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量，加入30ulddH2O,混匀后室温下放置2min，置于磁力架上，取28ul澄清液至新的EP管中。
13文库质量检测，检测通过后即可上机测序，并对测序结果进行数据分析
具体实施方式
下面结合各个具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行详细说明，其中：本实施例以技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
1.利用凯杰ctDNA提取试剂盒提取5个不同样本血浆中的游离DNA，将DNA定量后分别溶解在50ul ddH2O中，进行文库构建。所需试剂准备如表1所示。
试剂名称 储存方式 准备方式
Buffer ACL* 室温 室温
Buffer ACW1 室温 室温
Buffer ACW2 室温 室温
Buffer ACB 室温 室温
蛋白酶K -20℃ 冰上
Buffer AVE 室温 室温
1.1血浆分离
1.1.1将5个采血管垂直放置，让其自然沉淀1-2小时。
1.1.2离心机速度调至3000rpm，将5个采血管离心15分钟。
1.1.3将离心管离心15分钟后，取一支样品管，旋下管帽，并将其放置在架架上(禁止颠倒)。
1.1.4分别将5个离心管中约5ml血浆转移到新的15ml离心管中。将离心机速度调至14000rpm，离心10分钟。
1.1.5分别将5个离心管中约5ml血浆转移到新的15ml离心管中，旋紧样品管盖，在样品管壁上做好标记。
1.2ctDNA提取
1.2.1分别吸取500ul的蛋白酶K到5个新的50ml离心管中。
1.2.2向50ml离心管中分别加入上述5个样本5ml的血浆。
1.2.3向50ml离心管中加入4ml Buffer ACL(包含10ug carrier RNA)。关上盖子，涡旋震荡30s混匀。
1.2.4混匀后立即将离心管置于60℃的水浴中，孵育30min。
1.2.5分别将离心管置于离心管架上，小心拧开盖子，分别加入9ml Buffer ACB于该离心管中，涡旋15-30s后，冰上冰浴5min。
1.2.6将上述离心管中的混合液一次通过收集膜管，12000rpm离心1min
1.2.7加入750ul Buffer ACW2到收集膜管中，12000rpm离心1min
1.2.8加入750ul无水乙醇到收集膜管中，12000rpm离心1min
1.2.9 14000rpm空管离心3min后，将收集膜置于一个新的2ml收集管中，打开盖子，置于56℃热块中10min晾干。
1.2.10将收集膜置于新的1.5ml离心管中，向膜中加入20-150ul的Buffer AVE，盖上盖子，室温静置3min，14000rpm离心1min收集DNA。
1.2.11Qubit检测提取的5个样本的核酸浓度。
2末端修复，准备所需试剂如下表2所示
5个样本DNA分别按照以下体系进行末端修复。
将混合液上下吹打混匀后，置于20℃孵育30min。
3.AMPure XP磁珠纯化
3.1.让AMPure XP bead在室温放置至少30min，充分混匀AMPure XP bead悬浮液；
3.2.在1.5ml新管中加入1.7倍体积混匀的AMPure XP beads悬浮液和修复后的5个DNA样品，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；
3.3.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
3.4.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
3.5.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
3.6.重复步骤3.5；
3.7.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量
4.连接A尾。准备所需试剂如表3
将上述磁珠分别溶解在50ul A尾连接体系中，体系如下
PCR级ddH2O 42ul
10×KAPA A-Tailing Buffer 5ul
KAPA A-Tailing Enzyme 3ul
将混合液上下吹打混匀后，置于30℃孵育30min。
5.纯化A尾连接产物
5.1向50ul连接产物中加入90ul融解的室温下的PEG/NaCl SPRI溶液，混匀混合物后室温静置15min以结合磁珠
5.2短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
5.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
5.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
5.5.重复步骤5.4；
5.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量
6.样本DNA连接接头，试剂准备如下表4
将上述磁珠分别溶解在47ul连接接头的体系中，体系如下
PCR级水 32ul
5×KAPA Ligation Buffer 10ul
KAPA T4DNA Ligase 5ul
将体系混匀后，每个样本中加入3ul含有不同Index的接头。上下吹混数次后，置于20℃孵育15min。
7.纯化接头连接产物
7.1向50ul连接产物中加入50ul融解的室温下的PEG/NaCl SPRI溶液，混匀混合物后室温静置15min以结合磁珠.
7.2短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
7.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
7.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
7.5.重复步骤7.5；
7.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量
7.7加入22ul ddH2O溶解DNA，混匀后室温5min，充分溶解，置于磁力架上静置2min，吸取22ul上清。
8.捕获前扩增，试剂准备如下表5
扩增前将引物用ddH2O溶解，并将Pre-Capture LM-PCR Master Mix置于冰上溶解，配置如下反应体系
KAPA HiFi Hot Start Ready Mix(2x) 25ul
Pre LM-PCR Oligos 1&2,5μM* 5ul
文库DNA 20
将上述混合液混匀并置于PCR仪中，执行如下程序
反应结束后得到的即是捕获前PCR样本。
9.纯化捕获前前PCR产物
9.1.在1.5ml新管中加入1.4倍体积混匀的AMPure XP beads悬浮液和5个PCR产物，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；
9.2.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
9.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
9.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
9.5.重复步骤9.4；
9.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量
9.7.在磁力架上取下离心管加入52ul ddH2O，充分溶解DNA，室温下静置5min后，置于磁力架上，吸取50ul上清于新的离心管中。
10.文库杂交，试剂准备如下表6
10.1杂交前的准备，分别溶解SeqCap HE Universal Oligo和SeqCap HE IndexOligo至终浓度为1000uM置于-20℃.
10.2准备杂交混合样本，将5个不同Index的样本定量，并且相同比例混合至1.25ug。
10.3准备提高混合杂交的引物池，在冰上溶解1000uM的SeqCap HE UniversalOligo和SeqCap HE Index Oligo，混合比例为50％的SeqCap HE Universal Oligo和50％的SeqCap HE Index Oligos，总引物量为2000pmol，具体实施如下表
组分含量
10.4准备杂交样本
10.4.1取5ul COT Human DNA(1mg/ml)加入1.5ml离心管中
10.4.2将1.25ug的混合文库加入到9.4.1的离心管中
10.4.3将2000pmol的混合引物SeqCap HE Universal Oligo和SeqCap HE IndexOligo加入到离心管中。
具体实施如下
将上述混合液置于具孔的离心管中并置于60℃真空浓缩，向管中加入7.5ul 2×Hybridization Buffer和3ul of Hybridization Component A，充分混匀，以最大转速离心10s后置于95℃孵育10min。以最大转速离心10s。
向上述管中加入4.5ul的杂交探针SeqCap EZ probe pool，最终混合物如下表
将上述混合物混匀后，置于47℃中，17h，热盖温度为57℃
11.洗涤回收捕获产物，所需试剂准备如下表7
洗涤回收前准备，将10×Wash Buffers(I,II,III and Stringent)和2.5×BeadWash Buffer稀释成1×。
提前将1×Stringent Wash Buffer、1×Wash Buffer I置于47℃中预热
洗涤前磁珠的准备，吸取100ul磁珠在室温下放置30min，涡旋15s，置于磁力架上，静置5min后弃掉上清，加入200ul的1×Bead Wash Buffer，涡旋10s，置于磁力架上，弃掉上清。再加入200ul的1×Bead Wash Buffer，涡旋10s，置于磁力架上，弃掉上清。
11.1磁珠结合DNA。将磁珠加入到15ul杂交文库中，上下吹打10次后置于47℃45min，每隔15min涡旋3s。
11.2洗涤DNA结合磁珠，加入100ul预热到47℃的1×Wash Buffer I至15ul含有磁珠的文库中，转移到1.5ml EP管中，置于磁力架上，弃掉上清，加入200ul 47℃预热的1×Stringent Wash Buffer，上下弹打混匀，迅速置于47℃热浴上
11.3重复10.2操作一次。
11.4将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入200ul室温下的1X Wash BufferI，涡旋2min。将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入200ul室温下的1×Wash BufferII，涡旋1min。将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入200ul室温下的1×Wash BufferIII，涡旋30s。将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入50ul ddH2O，置于-20℃下保存。
12.捕获后文库扩增，试剂准备如下表8
扩增前将引物用ddH2O溶解，并将Post-LM-PCR Master Mix置于冰上溶解，配置如下反应体系
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2x) 25ul
Post-LM-PCR Oligos 1&2,5μM* 5ul
涡旋文库使磁珠混匀，取20ul加入到上述混合体系中，混匀并置于PCR仪中，执行如下程序
反应结束后得到的即是捕获前PCR样本。
13.纯化最终文库
13.1.让AMPure XP bead在室温放置至少30min，充分混匀AMPure XP bead悬浮液；
13.2.在1.5ml新管中加入1.8倍体积混匀的AMPure XP beads悬浮液和PCR样品，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；
13.3.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
13.4.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
13.5.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
13.6.重复步骤13.5；
13.7.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量，加入30ulddH2O,混匀后室温下放置2min，置于磁力架上，取28ul澄清液至新的EP管中。
14文库质量检测，检测通过后即可上机测序，并对测序结果进行数据分析
以下将通过对五个样本，按照如上方法进行试验得到混合文库，对该混合文库的实验结果做如下检测，并对本发明的性能进行分析：
图1为本发明的实验流程图
图2为以本发明方法制备的五样本混合文库的QC检测示意图，通过Agilent 2100片段分析仪检测使用本发明构建的文库，结果显示成功捕获到了血浆游离的DNA，加上接头290bp左右。
图3a-3e为以本发明方法制备得到的混合文库的测序深度示意图，本发明五个样本的序列测序深度的分布均在15000层左右，没有长拖尾，覆盖均一。
图4为插入片段结果示意图，通过对测序数据的分析，该实验的得到的混合文库的插入片段为170左右，说明成功捕获到了血浆游离DNA。

Claims (2)

1.一种用于165基因靶区域富集方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取5个不同样本血浆中的游离DNA，将DNA定量后分别溶解在50ul ddH2O中，进行文库构建。提取5个不同样本血浆中的游离DNA，将DNA定量后分别溶解在50ul ddH2O中，进行文库构建。
1.1准备末端修复所需试剂，10×KAPA End Repair Buffer，KAPA End Repair EnzymeMix置于冰上溶解，5个样本DNA分别按照以下体系进行末端修复。
将混合液上下吹打混匀后，置于20℃孵育30min。
AMPure XP磁珠纯化
2.1.让AMPure XP bead在室温放置至少30min，充分混匀AMPure XP bead悬浮液；
2.2.在1.5ml新管中加入1.7倍体积混匀的AMPure XP beads悬浮液和修复后的5个DNA样品，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；
2.3.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
2.4.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
2.5.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
2.6.重复步骤5；
2.7.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量。
连接A尾。
3.1将上述磁珠分别溶解在50ul A尾连接体系中，体系如下
PCR级ddH2O 42ul
10×KAPA A-Tailing Buffer 5ul
KAPA A-Tailing Enzyme 3ul
将混合液上下吹打混匀后，置于30℃孵育30min。
纯化A尾连接产物
4.1向50ul连接产物中加入90ul融解的室温下的PEG/NaCl SPRI溶液，混匀混合物后室温静置15min以结合磁珠
4.2短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
4.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
4.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
4.5.重复步骤4.4；
4.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量样本DNA连接接头
5.1将上述磁珠分别溶解在47ul连接接头的体系中，体系如下
PCR级水 32ul
5×KAPA Ligation Buffer 10ul
KAPA T4DNA Ligase 5ul
5.2将体系混匀后，每个样本中加入3ul含有不同Index的接头。上下吹混数次后，置于20℃孵育15min。
纯化接头连接产物
6.1向50ul连接产物中加入50ul融解的室温下的PEG/NaCl SPRI溶液，混匀混合物后室温静置15min以结合磁珠.
6.2短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
6.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
6.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
6.5.重复步骤5；
6.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量
6.7加入22ul ddH2O溶解DNA，混匀后室温5min，充分溶解，置于磁力架上静置2min，吸取22ul上清。
捕获前扩增
7.1扩增前将引物用ddH2O溶解，并将Pre-Capture LM-PCR Master Mix置于冰上溶解，配置如下反应体系
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2x) 25ul
Pre LM-PCR Oligos 1&2,5μM* 5ul
文库DNA 20
将上述混合液混匀并置于PCR仪中，执行如下程序
反应结束后得到的即是捕获前PCR样本。
纯化捕获前前PCR产物
8.1.在1.5ml新管中加入1.4倍体积混匀的AMPure XP beads悬浮液和5个PCR产物，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；
8.2.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
8.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
8.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
8.5.重复步骤5；
8.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量
8.7.在磁力架上取下离心管加入52ul ddH2O，充分溶解DNA，室温下静置5min后，置于磁力架上，吸取50ul上清于新的离心管中。
文库杂交
9.1杂交前的准备，分别溶解SeqCap HE Universal Oligo和SeqCap HE Index Oligo至终浓度为1000uM置于-20℃.
9.2准备杂交混合样本，将5个不同Index的样本定量，并且相同比例混合至1.25ug。
9.3准备提高混合杂交的引物池，在冰上溶解1000uM的SeqCap HE Universal Oligo和SeqCap HE Index Oligo，混合比例为50％的SeqCap HE Universal Oligo和50％的SeqCapHE Index Oligos，总引物量为2000pmol，具体实施如下表
组分含量
9.4准备杂交样本
9.4.1取5ul COT Human DNA(1mg/ml)加入1.5ml离心管中
9.4.2将1.25ug的混合文库加入到9.4.1的离心管中
9.4.3将2000pmol的混合引物SeqCap HE Universal Oligo和SeqCap HE Index Oligo加入到离心管中。
具体实施如下
将上述混合液置于具孔的离心管中并置于60℃真空浓缩，向管中加入7.5ul 2×Hybridization Buffer和3ul of Hybridization Component A，充分混匀，以最大转速离心10s后置于95℃孵育10min。以最大转速离心10s。
向上述管中加入4.5ul的杂交探针SeqCap EZ probe pool，最终混合物如下表
将上述混合物混匀后，置于47℃中，17h，热盖温度为57℃
洗涤回收捕获产物
洗涤回收前准备，将10×Wash Buffers(I,II,III and Stringent)和2.5×Bead WashBuffer稀释成1×。
提前将1×Stringent Wash Buffer、1×Wash Buffer I置于47℃中预热
洗涤前磁珠的准备，吸取100ul磁珠在室温下放置30min，涡旋15s，置于磁力架上，静置5min后弃掉上清，加入200ul的1×Bead Wash Buffer，涡旋10s，置于磁力架上，弃掉上清。再加入200ul的1×Bead Wash Buffer，涡旋10s，置于磁力架上，弃掉上清。
10.1磁珠结合DNA。将磁珠加入到15ul杂交文库中，上下吹打10次后置于47℃45min，每隔15min涡旋3s。
10.2洗涤DNA结合磁珠，加入100ul预热到47℃的1×Wash Buffer I至15ul含有磁珠的文库中，转移到1.5ml EP管中，置于磁力架上，弃掉上清，加入200ul 47℃预热的1×Stringent Wash Buffer，上下弹打混匀，迅速置于47℃热浴上
10.3重复10.2操作一次。
10.4将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入200ul室温下的1X Wash Buffer I，涡旋2min。将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入200ul室温下的1×Wash Buffer II，涡旋1min。将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入200ul室温下的1×Wash Buffer III，涡旋30s。将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入50ul ddH2O，置于-20℃下保存。
捕获后文库扩增
11.1扩增前将引物用ddH2O溶解，并将Post-LM-PCR Master Mix置于冰上溶解，配置如下反应体系
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2x) 25ul
Post-LM-PCR Oligos 1&2,5μM* 5ul
涡旋文库使磁珠混匀，取20ul加入到上述混合体系中，混匀并置于PCR仪中，执行如下程序
反应结束后得到的即是捕获前PCR样本。
纯化最终文库
12.1.让AMPure XP bead在室温放置至少30min，充分混匀AMPure XP bead悬浮液；
12.2.在1.5ml新管中加入1.8倍体积混匀的AMPure XP beads悬浮液和PCR样品，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；
12.3.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3-5min至溶液变澄清；
12.4.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；
12.5.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；
12.6.重复步骤5；
12.7.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量，加入30ulddH2O,混匀后室温下放置2min，置于磁力架上，取28ul澄清液至新的EP管中。
2.一种用于165基因靶区域富集方法，其特征在于，用于循环肿瘤DNA(ctDNA)多靶点并行深度高通量测序，且同时检查基因的多种变异类型，如突变，缺失，插入，融合，拷贝数扩增，在检测的深度和广度上均优于现有的技术。
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