CN104818336A - 一种基于多探针富集56基因靶区域的方法 - Google Patents

一种基于多探针富集56基因靶区域的方法 Download PDF

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揣少坤
段飞蝶
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Guangzhou Burning Rock Dx Laboratory Co ltd
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
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Abstract

本发明公开了一种基于多探针富集56基因靶区域的方法，通过设计一个捕获探针库，在DNA水平采用探针捕获的方式富集靶基因序列，从而检测靶基因的所有变异类型，如突变、缺失、插入、融合、拷贝数扩增，克服了目前在DNA水平上通过PCR的方法富集靶基因序列，但只能检测靶基因的突变和缺失，无法检测融合的缺点。

Description

一种基于多探针富集56基因靶区域的方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于多探针富集56基因靶区域的方法。
背景技术
在过去的数年里，对NSCLC(非小细胞肺癌)的生物学认知取得进步促使可以识别出对于恶性肿瘤转化和癌细胞生存至关重要的一些分子事件并形成了潜在治疗靶点。近年来，关于针对非小细胞肺癌的靶向治疗药物进展迅速，已获FDA批准的有EGFR小分子抑制剂吉非替尼，厄洛替尼，ALK小分子抑制剂克唑替尼，色瑞替尼等。值得注意的是，这些靶向治疗药物都只针对携带某些特定基因变异的人群有效。如携带EGFR L858R或19号外显子缺失性突变的非小细胞肺癌患者对第一代EGFR小分子抑制剂敏感。而携带ALK融合的非小细胞肺癌患者则对ALK小分子抑制剂敏感。因此，随着靶向治疗药物的推广，与之配合的伴随分子诊断变得必不可少。2015年美国癌症联盟(NCCN)指南中建议对非小细胞肺癌患者检测七项与靶向药物相关的基因变异：EGFR突变，ALK融合，MET扩增，ERBB2突变，BRAF突变，ROS1突变，以及RET突变。
早期分子诊断采用多种技术平台，如定量PCR，FISH，免疫组化等，一次检测一种或几种基因变异，对同一患者采用顺位检测的方法。传统方法的局限性在于，由于每次检测仅限于一种基因，所需的活检组织量随检测基因数的增长而增加。在可预见的未来，将难以满足检测所有靶标基因的需求。与此同时，近期有研究表明，肺癌中的重要靶点基因变异并非完全互斥，而是在一小部分患者中并存。Wu et al.的研究显示，中国非小细胞肺癌患者中有1.3％同时携带EGFR突变与ALK融合(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24443562)。对于这些患者，对于分子靶点基因变异顺序检测的方法会引起某些基因变异事件的漏检，从而使医生对该患者最适宜的靶向治疗方法产生可能的误判。而基于目标区域捕获的DNA二代测序法可以一次性平行检测几十，乃至上百种基因中包括点突变，插入缺失，DNA拷贝数改变，融合重排等多种变异形式，从而一次性检出所有与靶向治疗相关的靶点基因变异，并对于同时并存的基因变异的突变丰度进行估算与排序。因此为突破传统分子诊断方法的局限提供了新的途径。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种多探针富集56基因靶区域的方法，通过设计专用的捕获探针库，采用探针捕获技术一次性富集多个基因多靶点序列，从而实现多基因多靶点并行深度高通量测序。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于多探针富集56基因靶区域的方法，包括如下步骤：
S1 gDNA片段化和加接头adaptor
1.1)准备所需试剂如下：
SureSelect QXT终止反应液、SureSelect QXT缓冲液、SureSelect QXT转座酶溶液、二甲基亚砜(DMSO)、AMPure XP磁珠、乙醇；
1.2)定量待建库样本，调整浓度至25ng/μL，体积2μL；
1.3)PCR仪设置DNA片段化程序，设好程序后，点击开启，再立即点击暂停；
1.4)SureSelect QXT缓冲液和SureSelect QXT转座酶溶液分别高速涡旋混匀备用；
1.5)将SureSelect QXT缓冲液、样本和SureSelect QXT转座酶溶液依次添加到PCR管中，于冰上操作配制片段化反应体系，每种试剂单独添加；配制完成后，短暂离心，再高速涡旋充分混匀20s，并再次短暂离心，完成后立即将PCR管放置于步骤1.3)中暂停的PCR仪上，重新启动反应程序；
1.6)PCR完成后，立即将其转移至冰上；然后往其中加32μL1XSureSelect QXT终止反应液，高速涡旋5s，短暂离心，室温孵育1min；
S2 AMPure XP磁珠纯化
2.1)将AMPure XP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温；
2.2)将步骤S1中得到的已片段化和加接头adaptor的样本转移至新的1.5mL EP管中；
2.3)加入52μL充分混匀的AMPure XP磁珠，涡旋5s，短暂离心，保证磁珠没有沉底；
2.4)置于混匀仪上室温孵育5min；
2.5)孵育好的样本短暂离心，放磁力架上吸附磁珠，时间为3-5min，弃上清；
2.6)加300μL现配的70％乙醇，计时1min，期间沿水平方向缓慢旋转EP管一圈，令干扰的磁珠下沉，弃上清；
2.7)重复步骤2.6)一次；
2.8)短暂离心，将EP管重新放回磁力架静置30s，使用P10移液器除净残留乙醇；
2.9)37℃烘干磁珠，时间为1-3min，或置于通风厨1-3min使磁珠干燥；干燥完成后，加36μL不含核酸酶的水，涡旋混匀，短暂离心；
2.10)室温孵育2min，放置磁力架上，取一定量上清至新的PCR管中，即得到纯化样本并放置冰上；
S3捕获前PCR
3.1)所需试剂如下：
Herculase II Fusion DNA聚合酶、5×Herculase II反应缓冲液、每个三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)25mM的100mM dNTP混合液、SureSelect QXT引物混合物、DMSO、AMPure XP磁珠和乙醇；
3.2)在冰上操作，将5×Herculase II反应缓冲液、每个dNTP25mM的100mM dNTP混合液、DMSO、SureSelect QXT引物混合物、Herculase II Fusion DNA聚合酶配制捕获前PCR反应混合液，一次反应中各试剂的剂量依次为10μL、0.5μL、2.5μL、1μL、1μL和15μL；
3.3)将步骤3.2)中制得的捕获前PCR反应混合液加入35μL步骤S2中得到的纯化样本中，涡旋5s混匀；然后放置于PCR仪上，设置PCR反应程序并启动；反应完毕后得到捕获前PCR样本并放置冰上；
S4 AMPure XP磁珠纯化
4.1)将XP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温；
4.2)将步骤S3得到捕获前PCR样本转移至新的1.5mL EP管中；
4.3)按照步骤2.3)-2.10)进行操作；完成后即得到预文库；
S5将步骤S4得到预文库进行质量检测和浓度检测，包括预文库DNA的片段大小是否主要分布在245-325bp、以及DNA浓度是否满足≥500ng；
S6预文库DNA的准备
6.1)取一定量的通过步骤S5检测的预文库至新PCR管中；
6.2)将步骤6.1)中的样本PCR管放入浓缩仪中进行浓缩蒸干；
6.3)加入12μL不含核酸酶的水进行溶解，得到12μL预文库DNA；
S7杂交
7.1)准备所需试剂如下：
SureSelect QXT快速杂交缓冲液、SureSelect QXT快速封闭液、SureSelect RNase封闭剂、捕获探针库；
需要说明的是，所述捕获探针库中的探针主要根据NCCN(美国国立综合癌症网络)关于非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌(breastcancer)、直肠癌(colon cancer)、甲状腺癌(thyroid cancer)、肾细胞癌(renal cell carcinoma)、胃癌(gastric cancer)and原始神经外胚层肿瘤(PNET)的指导、现已公开的癌症基因(包括PMID：24071851、PMID：23945592、PMID：24657537、PMID：24132290、PMID：25656898)、TGGA数据库所公开的内容(包括乳头状甲状腺癌：PMID：25417114、肾细胞癌：PMID：25155756，PMID：23792563、胃癌：PMID：25079317、肺腺癌：PMID：25079552、乳腺癌：PMID：23000897、肺鳞状细胞癌：PMID：22960745和结肠癌：PMID：22810696)进行选取设计的。
7.2)分两管配制混合液，记为A管和B管，A管中，用12μL步骤S6得到的预文库DNA和5μL的SureSelect QXT快速封闭液配制混合液，用移液器上下吹打8-10次，涡旋5s混匀，短暂离心；B管中配制捕获库杂交混合液，涡旋5s混匀，放置室温备用；
7.3)PCR仪上设置反应程序，体积设置为30μL；
7.4)将A管转移至PCR仪上，启动运行，在运行一段时间暂停运行；
7.5)在PCR仪上，将B管中的捕获库杂交混合液转移至A管中，用移液器上下吹打8-10次，然后密封好，涡旋5s，快速离心后放回PCR仪上继续杂交反应程序，反应完毕后得到杂交样本；
S8 T1磁珠捕获
8.1)准备所需试剂如下：
SureSelect结合缓冲液、SureSelect洗液2、SureSelect洗液1、Dynabeads MyOne链霉素T1磁珠；
8.2)将Dynabeads MyOne链霉素T1磁珠涡旋混匀后，取50μL至新的1.5mL EP管中，置于磁力架上静置几分钟，待澄清后弃上清；
8.3)向步骤8.2)已加入T1磁珠的EP管中加入200μL SureSelect结合缓冲液，移液器上下吹打10次，放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清；
8.4)重复步骤8.3)两次；
8.5)向完成步骤8.4)后的EP管中加入200μL SureSelect结合缓冲液重悬磁珠备用；
8.6)将步骤S7最终得到的杂交样本转移至室温，在室温下将30μL杂交样本转移至步骤8.5)已加入200μL SureSelect结合缓冲液的EP管中，以1800rmp的速度混匀，在混匀仪上室温孵育30min；
8.7)按照600μl/样本的量预热SureSelect洗液2，保证步骤8.10)使用时温度达65℃；
8.8)步骤8.6)孵育好的样本短暂离心后放磁力架上，待澄清，弃上清，然后加入200μL SureSelect洗液1，吹打8-10次，确保磁珠悬浮；
8.9)高速涡旋8s，短暂离心，放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清；
8.10)加200μL步骤8.7)中预热的SureSelect洗液2，移液器上下吹打至少10次确保磁珠重悬；然后高速涡旋5s，短暂离心；离心完成后，在65℃下孵育10min；孵育完成后，放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清；重复上述操作两次；
8.11)快速离心，放置于磁力架上静置，吸干残留液体；然后加入23μL不含核酸酶的水，混匀，得到23μL带T1磁珠的样本，放置冰上备用；
S9捕获后PCR加标签Index：
9.1)实验前试剂准备，所需试剂如下：
Herculase II Fusion DNA聚合酶、5×Herculase II反应缓冲液、每个dNTP 25mM的100mM dNTP混合液、SureSelect QXT P7和P5双端标签引物、AMPure XP磁珠、乙醇；
9.2)在冰上配制捕获后PCR反应混合液，一次反应的配制剂量为不含核酸酶的水13.5μL、5×Herculaes II反应缓冲液10μL、每个dNTP 25mM的100mM dNTP混合液0.5μL、Herculase II FusionDNA聚合酶1μL；涡旋混匀；
9.3)将捕获后PCR反应混合液加入步骤S8最终得到的23μL带有T1磁珠的样本EP管中；
9.4)依次加入1μL P7端接头引物和1μL P5端接头引物，上下吹打混匀，确保磁珠重悬；然后进行PCR仪反应设置；
9.5)将PCR后的样本管放置磁力架上，取50μL上清至新的1.5mLEP管中；
S10 AMPure XP磁珠纯化
10.1)使用前充分混匀XP磁珠；
10.2)加60μL充分混匀的XP磁珠至上述转移至1.5mL EP管中的样本中，涡旋5s，短暂离心，保证磁珠没有沉底；
10.3)置于混匀仪上室温孵育5min；
10.4)放磁力架上吸附磁珠3-5min，弃上清；
10.5)加300μL现配的70％乙醇，计时1min，期间沿水平方向缓慢旋转EP管一圈，令干扰的磁珠下沉，弃上清；
10.6)重复步骤10.5)一次；
10.7)短暂离心，将EP管重新放回磁力架静置30s，使用P10移液器除净残留乙醇；
10.8)37℃烘干磁珠，时间为1-3min，或置于通风厨1-3min使磁珠干燥；
10.9)加25μL不含核酸酶的水，涡旋混匀，短暂离心；然后室温孵育2min，放置磁力架上，取25μL上清至新的1.5mL管中，即得到文库，放置冰上；
S11对步骤S10得到的文库进行质量检测以及qPCR检测。
需要说明的是，步骤1.1)中，确保SureSelect QXT终止反应液添加25％乙醇：首次使用时，在4.5mL的SureSelect QXT终止反应液中加1.5mL 25％乙醇，涡旋混匀、离心并做好标记，放置室温密封保存备用。
需要说明的是，步骤1.3)中，PCR的参数设定如下：
步骤1：温度45℃，运行时间10分钟；
步骤2：温度4℃，运行时间1分钟；
步骤3：温度4摄氏度，锁定；
其中，需要确保在开始DNA片段化时温度到达45℃。
需要说明的是，步骤1.5)中，SureSelect QXT缓冲液、样本和SureSelect QXT转座酶溶液添加到PCR管的具体方法如下：
1.5.1)在PCR管中，加17μL SureSelect QXT缓冲液；
1.5.2)加2μL样本至管底，样本量为50ng；
1.5.3)加2μL SureSelect QXT转座酶溶液至管底。
需要说明的是，步骤3.3)，PCR反应参数设置如下：
步骤1：循环次数为1，温度设为68℃，运行2分钟；
步骤2：循环次数为1，温度设为98℃，运行2分钟；
步骤3：循环次数为8，温度设为98℃运行30秒，然后温度设为57℃运行30秒，最后温度设为72℃运行1分钟；
步骤4：循环次数为1，温度设为72℃，运行5分钟；
步骤5：循环次数为1，温度设为4摄氏度，锁定。
需要说明的是，步骤7.2)中，B管中的捕获杂交混合液的配置方法为：按一次反应的剂量为捕获探针库2μL、SureSelect QXT快速杂交缓冲液6μL、SureSelect RNase封闭液0.5μL、ddH2O 4.5μL。
需要说明的是，步骤7.3)中，PCR反应程序参数设置如下：
步骤1：循环次数为1，95℃下运行5分钟；
步骤2：循环次数为1，65℃下运行10分钟；
步骤3：循环次数为1，65℃下运行1分钟；
步骤4：循环次数为60，每次在65℃下运行1分钟，37℃下运行3秒；
步骤5：循环次数为1，65℃下锁定；
其中，步骤7.4)中PGR的暂停具体是在步骤3结束后进行的。
需要说明的是，步骤6.1)中，用于杂交的DNA数量为500to 750ng，具体取12μL预文库。
本发明的有益效果在于：利用专门设计的捕获探针库，采用探针捕获技术一次性富集56个基因多靶点序列，从而实现多基因多靶点并行深度高通量测序，且同时检查基因的多种变异类型，如突变，缺失，插入，融合，拷贝数扩增，克服了目前在DNA水平上有通过PGR的方法富集靶基因序列，但只能检测靶基因的突变和缺失，无法检测融合的缺点。
附图说明
图1为本发明的实施流程图；
图2为本发明性能指标FFPE_coverage的结果示意图；
图3为本发明性能指标目标区域序列占比的结果示意图；
图4为本发明性能指标样本间相关性的结果示意图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
如图1所示，本发明的实施流程具体如下：
预文库(Pre-Library)制备(50ng DNA samples)
一、gDNA片段化和加接头adaptor
实验前试剂准备
1、所需试剂如表1所示：
表1
2、确保SureSelect QXT终止反应液添加25％乙醇：首次使用时，在4.5mL的SureSelect QXT终止反应液中加1.5mL乙醇，涡旋混匀、离心并做好标记，放置室温密封保存备用。
操作流程：
1)用Qubit dsDNA HS分析试剂盒定量待建库样本，调整浓度至25ng/μL，体积2μL。
2)PCR仪设置DNA片段化程序(需热盖)，如表2所示：
表2
步骤 温度 时间
步骤1 45℃ 10分钟
步骤2 4℃ 1分钟
步骤3 4℃ Hold锁定
需要注意的是，45℃不能超过10min。
设好程序后，点击开启，再立即点击暂停。确保在开始DNA片段化时温度到达45℃。
3、SureSelect QXT缓冲液和SureSelect QXT转座酶溶液分别高速涡旋混匀备用。
4、在冰上操作，配制片段化反应体系。每种试剂单独加，勿配混合Mix。加样顺序依次进行：
1)在PCR管中，加17μL SureSelect QXT缓冲液。
2)加2μL样本至管底(样本量为50ng)。
3)加2μL SureSelect QXT转座酶溶液至管底。
加完后，移液器上下吹打8-10次，确保粘性试剂完全转移至PCR管中。
5、将样本PCR管短暂离心，再高速涡旋充分混匀20s，然后再次短暂离心。
6、立即将其放置于步骤2中暂停的PCR仪上，重新启动反应程序。
7、4℃1min运行完成后，立即将其转移至冰上。
8、加32μL 1XSureSelect QXT终止反应液，高速涡旋5s，短暂离心，室温孵育1min后，进行下一步纯化。
二、AMPure XP磁珠纯化
1、使用前充分混匀已平衡至室温的XP磁珠。
2、配制70％乙醇，现配现用，每个样本需要600μL/次。
3、将已片段化和加adaptor的样本转移至新的1.5mL EP管中。
4、加52μL充分混匀的XP磁珠，涡旋5s，短暂离心(保证磁珠没有沉底)。
5、置于混匀仪上室温孵育5min。
6、孵育好的样本短暂离心，放磁力架上吸附磁珠，时间为3-5min，弃上清。
7、加300μL70％乙醇(现配现用)，计时1min，期间沿水平方向缓慢旋转离心管一圈，一些干扰的磁珠会下沉，弃上清。
8、重复步骤7一次。
9、短暂离心，将EP管重新放回磁力架静置30s，使用P10移液器除净残留乙醇。
10、37℃烘干磁珠，时间为1-3min或置于通风厨1-3min使磁珠干燥，其中磁珠不能太干，否则会影响样本溶解效率。
11、加36μL不含核酸酶的水，涡旋混匀，短暂离心。
12、室温孵育2min，放置磁力架上，取上清(约35μL)至新的PCR管中，放置冰上。
三、捕获前PCR
实验前试剂准备
所需试剂如表3所示：
表3
操作流程
1、涡旋混匀试剂。
2、本步骤在冰上操作，配制捕获前PCR反应混合液，如表4所示：
表4
3、将捕获前PCR反应混合液加入上述的35μL的纯化样本中。涡旋5s混匀。
4、放置于PCR仪上，程序如下(需热盖)，设置参数如表5所示：
表5
5、反应完后放置冰上。
四、AMPure XP磁珠纯化
操作流程
1、使用前充分混匀XP磁珠。
2、将步骤三中所得的捕获前PCR样本库转移至新的1.5mLEP管中。
3、加50μL充分混匀的XP磁珠，涡旋5s，短暂离心(保证磁珠没有沉底)。
4、置于混匀仪上室温孵育5min。
5、孵育好的样本短暂离心，放磁力架上吸附磁珠(时间大约3-5min)，弃上清。
6、加300μL70％乙醇(现配现用)，计时1min，期间沿水平方向缓慢旋转离心管一圈，一些干扰的磁珠会下沉，弃上清。
7、重复步骤6一次。
8、短暂离心，将EP管重新放回磁力架静置30s，使用P10移液器除净残留乙醇。
9、37℃烘干磁珠，时间为1-3min或置于通风厨1-3min使磁珠干燥(磁珠不能太干，否则会影响样本溶解效率)。
10、加13μL不含核酸酶的水，涡旋混匀，短暂离心。
11、室温孵育2min，放置磁力架上，取上清(约12μL)至新的PCR管中，放置冰上(或4℃存储过夜或-20℃长期存储)。
五、预文库质量检测
1、2100检测
检测试剂：Agilent 2100 DNA 1000试剂盒
检测目的：判断预文库DNA的片段大小
结果分析：此建库方法预文库DNA的片段主要分布在245-325bp。
需要注意的是，DNA片段大小若小于245bp表明可能在片段化反应中gDNA的量太少，测序结果可能会增加duplicates；若大于325bp表明可能在片段化反应中gDNA的量太多，测序结果可能会降低靶向区域覆盖度。
2、Qubit测浓度
检测试剂：Qubit双链DNA分析试剂盒
检测目的：测定预文库DNA的浓度
结果分析：杂交预文库DNA的总量应≥500ng。
杂交捕获
六、杂交预文库DNA准备
取500-750ng的预文库DNA至新PCR管中，调整终体积至12μL
七、杂交
实验前试剂准备
所需试剂如表6所示：
表6
操作流程
1、配混合液，分两管，配制体系如下
A管：样本管，混合液的配制如表7所示：
表7
试剂 1次反应的体积
预文库DNA 12μL
SureSelect QXT快速封闭液 5μL
总体积 17μL
用移液器上下吹打8-10次，涡旋5s混匀，短暂离心。
B管：配置捕获库杂交混合液(Capture Library HybridizationMix)，配置试剂及剂量如表8所示。
表8
涡旋5s混匀，放置室温备用。
1、PCR上设置反应程序，具体设置参数如表9所示。体积设置为30μL，需要说明的是，该体积为杂交反应的终体积。
表9
2、将A管(17μL)转移至PCR仪上，点击“开始”。
3、运行到第3步(65℃，1min)，立即点击“暂停”。
4、(在PCR仪上操作)转移B管中的13μL捕获库杂交混合液至A管中，用移液器上下吹打8-10次。
5、将其密封好，涡旋5s，快速离心，放回PCR仪上继续杂交反应程序。
八、T1磁珠捕获
实验前试剂准备：所需试剂如表10所示：
表10
操作流程
1、将Dynabeads MyOne链霉素T1磁珠涡旋混匀后，取50μL T1磁珠于新的1.5mL EP管中，置于磁力架上静置几分钟，待澄清后弃上清。
2、向磁珠中加入200μL SureSelect结合缓冲液，移液器上下吹打10次，放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清。
3、重复2两次，共三次。
4、向磁珠中加入200μL SureSelect结合缓冲液重悬磁珠备用。
5、待杂交结束，将杂交样本转移至室温，在室温下将杂交样本(约30μL)转移至200μL SureSelect结合缓冲液中。1800rmp混匀，混匀仪上室温孵育30min。
6、按照600μl/样本的量65℃预热SureSelect洗液2，保证第10步使用时温度达65℃。
7、第5步孵育好的样本短暂离心后放磁力架上，待澄清，弃上清。
8、向有样本的磁珠中加入200μL SureSelect洗液1，吹打8-10次，确保磁珠悬浮。
9、高速涡旋8s，短暂离心，放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清。
10、加SureSelect洗液2：
1)加200μL步骤6中预热的65℃SureSelect洗液2，移液器上下吹打至少10次确保磁珠重悬。
2)高速涡旋5s，短暂离心。
3)65℃孵育10min(若使用PCR仪孵育，不需热盖)。
4)放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清。
5)重复1)-4)两次
11、第3次弃上清后，快速离心，放置于磁力架上静置，吸干残留液体。
12、加23μL不含核酸酶的水，混匀，放置冰上备用。
文库(Library)制备
九、捕获后PCR加标签
实验前试剂准备，所需试剂如表11所示：
表11
操作流程
1、在冰上配制捕获后PCR反应混合液，配制剂量如表12所示。
表12
上述试剂均需要涡旋混匀。
2、将捕获后PCR反应混合液加入23μL带有T1磁珠的样本管中。
3、加1μL P7端接头引物；
4、加1μL P5端接头引物；
5、上下吹打混匀，确保磁珠重悬。PCR仪反应设置如表13所示。
表13
步骤 循环次数 温度 运行时间
1 1 98℃ 2分钟
2 10 98℃ 30秒
3 1 72℃ 5分钟
4 1 4℃ 锁定
6、PCR完成后，PCR后的样本管放置磁力架上，取上清(约50μL)至新的1.5mL EP管中进行下一步纯化。
十、AMPure XP磁珠纯化
操作流程
1、使用前充分混匀XP磁珠。
2、配制70％乙醇((现配现用，每个样本需要600μL)。
3、加60μL充分混匀的XP磁珠至上述转移至1.5mL EP管中样本中，涡旋5s，短暂离心(保证磁珠没有沉底)。
4、置于混匀仪上室温孵育5min。
5、放磁力架上吸附磁珠(时间大约3-5min)，弃上清。
6、加300μL70％乙醇(现配现用)，计时1min，期间沿水平方向缓慢旋转离心管一圈，一些干扰的磁珠会下沉，弃上清。
7、重复6一次。
8、短暂离心，将EP管重新放回磁力架静置30s，使用P10移液器除净残留乙醇。
9、37℃烘干磁珠，时间为1-3min或置于通风厨1-3min使磁珠干燥(磁珠不能太干，否则会影响样本溶解效率)。
10、加25μL不含核酸酶的水，涡旋混匀，短暂离心。
11、室温孵育2min，放置磁力架上，取上清(约25μL)至新的1.5mL管中，放置冰上(或4℃存储过夜或-20℃长期存储)。
十一、文库质量检测，检测通过后，即可上机进行测序以及根据测序结果进行数据分析。
以下将结合目标区域序列占比、FFPE_coverage和样品间相关性三个指标说明本发明的性能：
1、FFPE_coverage：图2所示为本发明序列测序深度的分布情况，基本都在均值1600层左右，没有长拖尾，说明覆盖均一；
2、目标区域序列占比：如图3所示，本发明目标区域序列占比均值是71％，说明本发明捕获效率较高；
3、样本间相关性：该指标说明不同样本间覆盖深度的相关性，如图4所示，本发明的样本间相关性均值在0.65，说明不同样本间重复性好。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，作出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于多探针富集56基因靶区域的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1gDNA片段化和加接头adaptor
1.1)准备所需试剂如下：
SureSelect QXT终止反应液、SureSelect QXT缓冲液、SureSelect QXT转座酶溶液、二甲基亚砜(DMSO)、AMPure XP磁珠、乙醇；
1.2)定量待建库样本，调整浓度至25ng/μL，体积2μL；
1.3)PCR仪设置DNA片段化程序，设好程序后，点击开启，再立即点击暂停；
1.4)SureSelect QXT缓冲液和SureSelect QXT转座酶溶液分别高速涡旋混匀备用；
1.5)将SureSelect QXT缓冲液、样本和SureSelect QXT转座酶溶液依次添加到PCR管中，于冰上操作配制片段化反应体系，每种试剂单独添加；配制完成后，短暂离心，再高速涡旋充分混匀20s，并再次短暂离心，完成后立即将PCR管放置于步骤1.3)中暂停的PCR仪上，重新启动反应程序；
1.6)PCR完成后，立即将其转移至冰上；然后往其中加32μL1×SureSelect QXT终止反应液，高速涡旋5s，短暂离心，室温孵育1min；
S2AMPure XP磁珠纯化
2.1)将AMPure XP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温；
2.2)将步骤S1中得到的已片段化和加接头adaptor的样本转移至新的1.5mL EP管中；
2.3)加入52μL充分混匀的AMPure XP磁珠，涡旋5s，短暂离心，保证磁珠没有沉底；
2.4)置于混匀仪上室温孵育5min；
2.5)孵育好的样本短暂离心，放磁力架上吸附磁珠，时间为3-5min，弃上清；
2.6)加300μL现配的70％乙醇，计时1min，期间沿水平方向缓慢旋转EP管一圈，令干扰的磁珠下沉，弃上清；
2.7)重复步骤2.6)一次；
2.8)短暂离心，将EP管重新放回磁力架静置30s，使用P10移液器除净残留乙醇；
2.9)37℃烘干磁珠，时间为1-3min，或置于通风厨1-3min使磁珠干燥；干燥完成后，加36μL不含核酸酶的水，涡旋混匀，短暂离心；
2.10)室温孵育2min，放置磁力架上，取一定量上清至新的PCR管中，即得到纯化样本并放置冰上；
S3捕获前PCR
3.1)所需试剂如下：
Herculase II Fusion DNA聚合酶、5×Herculase II反应缓冲液、每个三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)25mM的100mM dNTP混合液、SureSelect QXT引物混合物、DMSO、AMPure XP磁珠和乙醇；
3.2)在冰上操作，将5×Herculase II反应缓冲液、每个dNTP25mM的100mM dNTP混合液、DMSO、SureSelect QXT引物混合物、Herculase II Fusion DNA聚合酶配制捕获前PCR反应混合液，一次反应中各试剂的剂量依次为10μL、0.5μL、2.5μL、1μL、1μL和15μL；
3.3)将步骤3.2)中制得的捕获前PCR反应混合液加入35μL步骤S2中得到的纯化样本中，涡旋5s混匀；然后放置于PCR仪上，设置PCR反应程序并启动；反应完毕后得到捕获前PCR样本并放置冰上；
S4AMPure XP磁珠纯化
4.1)将XP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温；
4.2)将步骤S3得到捕获前PCR样本转移至新的1.5mL EP管中；
4.3)按照步骤2.3)-2.10)进行操作；完成后即得到预文库；
S5将步骤S4得到预文库进行质量检测和浓度检测，包括预文库DNA的片段大小是否主要分布在245-325bp、以及DNA浓度是否满足≥500ng；
S6预文库DNA的准备
6.1)取一定量的通过步骤S5检测的预文库至新PCR管中；
6.2)将步骤6.1)中的样本PCR管放入浓缩仪中进行浓缩蒸干；
6.3)加入12μL不含核酸酶的水进行溶解，得到12μL预文库DNA；
S7杂交
7.1)准备所需试剂如下：
SureSelect QXT快速杂交缓冲液、SureSelect QXT快速封闭液、SureSelect RNase封闭剂、捕获探针库；
7.2)分两管配制混合液，记为A管和B管，A管中，用12μL步骤S6得到的预文库DNA和5μL的SureSelect QXT快速封闭液配制混合液，用移液器上下吹打8-10次，涡旋5s混匀，短暂离心；B管中配制捕获库杂交混合液，涡旋5s混匀，放置室温备用；
7.3)PCR仪上设置反应程序，体积设置为30μL；
7.4)将A管转移至PCR仪上，启动运行，在运行一段时间暂停运行；
7.5)在PCR仪上，将B管中的捕获库杂交混合液转移至A管中，用移液器上下吹打8-10次，然后密封好，涡旋5s，快速离心后放回PCR仪上继续杂交反应程序，反应完毕后得到杂交样本；
S8T1磁珠捕获
8.1)准备所需试剂如下：
SureSelect结合缓冲液、SureSelect洗液2、SureSelect洗液1、Dynabeads MyOne链霉素T1磁珠；
8.2)将Dynabeads MyOne链霉素T1磁珠涡旋混匀后，取50μL至新的1.5mL EP管中，置于磁力架上静置几分钟，待澄清后弃上清；
8.3)向步骤8.2)已加入T1磁珠的EP管中加入200μL SureSelect结合缓冲液，移液器上下吹打10次，放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清；
8.4)重复步骤8.3)两次；
8.5)向完成步骤8.4)后的EP管中加入200μL SureSelect结合缓冲液重悬磁珠备用；
8.6)将步骤S7最终得到的杂交样本转移至室温，在室温下将30μL杂交样本转移至步骤8.5)已加入200μL SureSelect结合缓冲液的EP管中，以1800rmp的速度混匀，在混匀仪上室温孵育30min；
8.7)按照600μl/样本的量预热SureSelect洗液2，保证步骤8.10)使用时温度达65℃；
8.8)步骤8.6)孵育好的样本短暂离心后放磁力架上，待澄清，弃上清，然后加入200μL SureSelect洗液1，吹打8-10次，确保磁珠悬浮；
8.9)高速涡旋8s，短暂离心，放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清；
8.10)加200μL步骤8.7)中预热的SureSelect洗液2，移液器上下吹打至少10次确保磁珠重悬；然后高速涡旋5s，短暂离心；离心完成后，在65℃下孵育10min；孵育完成后，放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清；重复上述操作两次；
8.11)快速离心，放置于磁力架上静置，吸干残留液体；然后加入23μL不含核酸酶的水，混匀，得到23μL带T1磁珠的样本，放置冰上备用；
S9捕获后PCR加标签Index：
9.1)实验前试剂准备，所需试剂如下：
Herculase II Fusion DNA聚合酶、5×Herculase II反应缓冲液、每个dNTP 25mM的100mM dNTP混合液、SureSelect QXT P7和P5双端标签引物、AMPure XP磁珠、乙醇；
9.2)在冰上配制捕获后PCR反应混合液，一次反应的配制剂量为不含核酸酶的水13.5μL、5×Herculaes II反应缓冲液10μL、每个dNTP 25mM的100mM dNTP混合液0.5μL、Herculase II FusionDNA聚合酶1μL；涡旋混匀；
9.3)将捕获后PCR反应混合液加入步骤S8最终得到的23μL带有T1磁珠的样本EP管中；
9.4)依次加入1μL P7端接头引物和1μL P5端接头引物，上下吹打混匀，确保磁珠重悬；然后进行PCR仪反应设置；
9.5)将PCR后的样本管放置磁力架上，取50μL上清至新的1.5mLEP管中；
S10AMPure XP磁珠纯化
10.1)使用前充分混匀XP磁珠；
10.2)加60μL充分混匀的XP磁珠至上述转移至1.5mL EP管中的样本中，涡旋5s，短暂离心，保证磁珠没有沉底；
10.3)置于混匀仪上室温孵育5min；
10.4)放磁力架上吸附磁珠3-5min，弃上清；
10.5)加300μL现配的70％乙醇，计时1min，期间沿水平方向缓慢旋转EP管一圈，令干扰的磁珠下沉，弃上清；
10.6)重复步骤10.5)一次；
10.7)短暂离心，将EP管重新放回磁力架静置30s，使用P10移液器除净残留乙醇；
10.8)37℃烘干磁珠，时间为1-3min，或置于通风厨1-3min使磁珠干燥；
10.9)加25μL不含核酸酶的水，涡旋混匀，短暂离心；然后室温孵育2min，放置磁力架上，取25μL上清至新的1.5mL管中，即得到文库，放置冰上；
S11对步骤S10得到的文库进行质量检测以及qPCR检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于多探针富集56基因靶区域的方法，其特征在于，步骤1.1)中，确保SureSelect QXT终止反应液添加25％乙醇：首次使用时，在4.5mL的SureSelect QXT终止反应液中加1.5mL 25％乙醇，涡旋混匀、离心并做好标记，放置室温密封保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种基于多探针富集56基因靶区域的方法，其特征在于，步骤1.3)中，PCR的参数设定如下：
步骤1：温度45℃，运行时间10分钟；
步骤2：温度4℃，运行时间1分钟；
步骤3：温度4摄氏度，锁定；
其中，需要确保在开始DNA片段化时温度到达45℃。
4.根据权利要求1所述的一种基于多探针富集56基因靶区域的方法，其特征在于，步骤1.5)中，SureSelect QXT缓冲液、样本和SureSelect QXT转座酶溶液添加到PCR管的具体方法如下：
1.5.1)在PCR管中，加17μL SureSelect QXT缓冲液；
1.5.2)加2μL样本至管底，样本量为50ng；
1.5.3)加2μL SureSelect QXT转座酶溶液至管底。
5.根据权利要求1所述的一种基于多探针富集56基因靶区域的方法，其特征在于，步骤3.3)，PCR反应参数设置如下：
步骤1：循环次数为1，温度设为68℃，运行2分钟；
步骤2：循环次数为1，温度设为98℃，运行2分钟；
步骤3：循环次数为8，温度设为98℃运行30秒，然后温度设为57℃运行30秒，最后温度设为72℃运行1分钟；
步骤4：循环次数为1，温度设为72℃，运行5分钟；
步骤5：循环次数为1，温度设为4摄氏度，锁定。
6.根据权利要求1所述的一种基于多探针富集56基因靶区域的方法，其特征在于，步骤7.2)中，B管中的捕获杂交混合液的配置方法为：按一次反应的剂量为捕获探针库2μL、SureSelect QXT快速杂交缓冲液6μL、SureSelect RNaSe封闭液0.5μL、ddH204.5μL。
7.根据权利要求1所述的一种基于多探针富集56基因靶区域的方法，其特征在于，步骤7.3)中，PCR反应程序参数设置如下：
步骤1：循环次数为1，95℃下运行5分钟；
步骤2：循环次数为1，65℃下运行10分钟；
步骤3：循环次数为1，65℃下运行1分钟；
步骤4：循环次数为60，每次在65℃下运行1分钟，37℃下运行3秒；
步骤5：循环次数为1，65℃下锁定；
其中，步骤7.4)中PCR的暂停具体是在步骤3结束后进行的。
8.根据权利要求1所述的一种基于多探针富集56基因靶区域的方法，其特征在于，步骤6.1)中，用于杂交的DNA数量为500to 750ng，具体取12μL预文库。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543380A (zh) * 2016-01-27 2016-05-04 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 一种检测基因融合的方法及装置
CN105925562A (zh) * 2016-05-10 2016-09-07 广州嘉检医学检测有限公司 一种富集4000人类致病靶基因的方法及试剂盒
CN106434911A (zh) * 2016-09-22 2017-02-22 刘鹏飞 一种165基因靶区域富集测序方法
CN106835291A (zh) * 2016-12-14 2017-06-13 广州燃石医学检验所有限公司 Dna 文库的制备方法以及试剂盒
CN107858426A (zh) * 2017-08-22 2018-03-30 上海派森诺生物科技股份有限公司 一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其方法
CN108148891A (zh) * 2018-03-05 2018-06-12 重庆市肿瘤研究所 肿瘤细胞dna损伤修复相关基因捕获测序的探针制备方法
CN109825498A (zh) * 2019-03-15 2019-05-31 清华大学 针对目标核酸靶标的探针的制备方法
CN110387400A (zh) * 2018-04-19 2019-10-29 上海迪赢生物科技有限公司 一种同时捕获基因组目标区域正反义双链的平行液相杂交捕获方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103103624A (zh) * 2011-11-15 2013-05-15 深圳华大基因科技有限公司 高通量测序文库的构建方法及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103103624A (zh) * 2011-11-15 2013-05-15 深圳华大基因科技有限公司 高通量测序文库的构建方法及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRANT C. FAIRCLOTH等: "A Phylogenomic Perspective on the Radiation of Ray-Finned Fishes Based upon Targeted Sequencing of Ultraconserved Elements (UCEs)", 《PLOS ONE》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543380A (zh) * 2016-01-27 2016-05-04 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 一种检测基因融合的方法及装置
CN105925562A (zh) * 2016-05-10 2016-09-07 广州嘉检医学检测有限公司 一种富集4000人类致病靶基因的方法及试剂盒
CN106434911A (zh) * 2016-09-22 2017-02-22 刘鹏飞 一种165基因靶区域富集测序方法
CN106835291A (zh) * 2016-12-14 2017-06-13 广州燃石医学检验所有限公司 Dna 文库的制备方法以及试剂盒
CN107858426A (zh) * 2017-08-22 2018-03-30 上海派森诺生物科技股份有限公司 一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其方法
CN107858426B (zh) * 2017-08-22 2021-04-09 上海派森诺生物科技股份有限公司 一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其方法
CN108148891A (zh) * 2018-03-05 2018-06-12 重庆市肿瘤研究所 肿瘤细胞dna损伤修复相关基因捕获测序的探针制备方法
CN110387400A (zh) * 2018-04-19 2019-10-29 上海迪赢生物科技有限公司 一种同时捕获基因组目标区域正反义双链的平行液相杂交捕获方法
CN110387400B (zh) * 2018-04-19 2023-03-21 上海迪赢生物科技有限公司 一种同时捕获基因组目标区域正反义双链的平行液相杂交捕获方法
CN109825498A (zh) * 2019-03-15 2019-05-31 清华大学 针对目标核酸靶标的探针的制备方法
CN109825498B (zh) * 2019-03-15 2020-10-09 清华大学 针对目标核酸靶标的探针的制备方法

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Inventor after: Han Yusheng

Inventor after: Chuai Shaokun

Inventor after: Duan Feidie

Inventor before: Han Yusheng

Inventor before: Chuai Shaokun

Inventor before: Duan Feidie

Inventor before: Zhang Zhihong

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
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Application publication date: 20150805