CN114438218B

CN114438218B - 一种检测多种肿瘤的基因Panel、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN114438218B
Application number: CN202210339492.1A
Authority: CN
Inventors: 季序我; 胥新芸; 董宇; 韦宝耶
Original assignee: Beijing Pukang Ruiren Medical Laboratory Co ltd; Predatum Biomedicine Suzhou Co ltd; Precision Scientific Technology Beijing Co ltd
Current assignee: Beijing Pukang Ruiren Medical Laboratory Co ltd; Predatum Biomedicine Suzhou Co ltd; Precision Scientific Technology Beijing Co ltd
Priority date: 2022-04-01
Filing date: 2022-04-01
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2042-04-01
Also published as: CN114438218A; ZA202209466B

Abstract

本发明公开了一种检测多种肿瘤的基因Panel、试剂盒及应用。基因Panel包括遗传性乳腺癌卵巢癌综合征BRCA相关基因、林奇综合征相关基因、其他与所述多种肿瘤相关的基因和同源重组修复通路关键基因。可针对遗传性乳腺癌卵巢癌综合征BRCA相关基因、林奇综合征相关基因、其他与所述多种肿瘤相关的基因和同源重组修复通路关键基因进行胚系水平或合并肿瘤组织水平的检测，并根据检测结果准确评估这些基因与妇科肿瘤、乳腺癌、前列腺癌及消化道肿瘤相关的遗传风险，指导肿瘤患者有关铂类化疗药及PARP抑制剂的适用情况。通过一次检测实现对妇科肿瘤、乳腺癌、前列腺癌及消化道肿瘤等多种肿瘤精准治疗的全面指导。

Description

一种检测多种肿瘤的基因Panel、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及肿瘤多基因检测技术领域，尤其涉及一种检测多种肿瘤的基因Panel、试剂盒及应用。

背景技术

据统计，妇科肿瘤、乳腺癌、前列腺癌及消化道肿瘤的发病率和死亡率都非常高。临床研究将肿瘤归为一种基因病，主要是由于原癌基因的激活或抑制基因的失活所导致。随着高通量测序（NGS）和生物技术的巨大进步，已发现多个与癌症发生发展相关的驱动基因以及可用于指导肿瘤治疗的生物标志物，且针对驱动基因和生物标志物开发了多款药物，在临床治疗中可根据检测到的驱动基因突变或生物标志物进行精准治疗。因此，检测到肿瘤相关的驱动基因突变或生物标志物就成为精准治疗的关键。

目前，用于精准治疗基因检测的技术手段包括Sanger测序（一代测序）、RT-PCR（聚合酶链式反应）、IHC（免疫组织化学法）、FISH（荧光原位杂交）和高通量测序（NGS）技术等。其中，Sanger测序虽然是测序的金标准，但由于该测序技术一个反应只能得到一条序列，因此测序通量低；虽然单个反应价格低廉，但是获得大量测序的成本高；检测灵敏度较低，一般只能检测突变丰度在20%以上的突变，对于一些低频突变存在漏检的可能。RT-PCR只能对已知位点进行检测，不能发现未知位点。IHC主要用于检测蛋白表达，不能检测基因的点突变（SNV）、小片段插入缺失（Indel）等，因此，需要根据基因SNV/Indel指导用药的检测不能通过IHC实现。FISH检测虽是鉴定基因融合（Fusion）、扩增（CNV）的金标准，但同样不适用SNV/Indel的检测。高通量测序（NGS）技术则具有如下优势：通量高（一次检测数个基因到数百个基因乃至全外显子组）、灵敏度高、检测限更低、探索能力更强，可发现未知突变、一次检测多种突变类型（SNV/Indel/Fusion/CNV）、还可以检测基因组生物标志物（肿瘤突变负荷/微卫星不稳定性）。仅通过一次检测可实现对精准治疗的全面指导。但是，目前还没有能够同时检测妇科肿瘤、乳腺癌、前列腺癌及消化道肿瘤等多种肿瘤的高通量测序技术。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了如下技术方案。

本发明一方面提供了一种检测多种肿瘤的基因Panel，所述多种肿瘤包括妇科肿瘤、乳腺癌、前列腺癌及消化道肿瘤，所述基因Panel包括遗传性乳腺癌卵巢癌综合征BRCA相关基因、林奇综合征相关基因、其他与所述多种肿瘤相关的基因和同源重组修复通路关键基因。

优选地，所述遗传性乳腺癌卵巢癌综合征BRCA相关基因包括：BRCA1、BRCA2。

优选地，所述林奇综合征相关基因包括：MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM。

优选地，所述其他与所述多种肿瘤相关的基因包括：PTEN、STK11、TP53、BRIP1、RAD51C、RAD51D、ATM、PALB2、CDH1、NBN、CHEK2、BARD1、RAD50、MRE11。

优选地，所述同源重组修复通路关键基因包括：ABRAXAS1(FAM175A)、ATM、ATR、BAP1、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、C11ORF30(EMSY)、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCI、FANCL、MRE11、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD50、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54B、RAD54L。

本发明第二方面提供了一种检测多种肿瘤的探针Panel，所述探针Panel为针对第一方面所述的遗传性乳腺癌卵巢癌综合征BRCA相关基因、林奇综合征相关基因、其他与所述多种肿瘤相关的基因和同源重组修复通路关键基因的检测探针。

本发明第三方面提供了一种检测多种肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包括至少一次用量的第二方面所述的探针Panel。

本发明第四方面提供了第一方面所述的基因Panel或第二方面所述的探针Panel在制备多种肿瘤检测装置中的应用。

本发明第五方面提供了一种检测多种肿瘤的装置，包括：

测序模块，用于对待测样本的DNA进行提取，并进行高通量测序，获得测序结果；

分析模块，用于对高通量测序的结果进行生物信息学分析，得到检测样本的突变信息；

对比模块，将突变信息与第一方面所述的基因Panel进行比对，判断突变的致病性。

本发明第六方面提供了一种检测多种肿瘤的方法，包括：

提取检测样本DNA；

构建检测样本DNA文库；

构建如第一方面所述的基因Panel的检测探针；

所述检测探针与所述DNA文库杂交捕获，并测序；

对测序结果进行生物信息学分析，得到检测样本的突变信息；

将突变信息与第一方面所述的基因Panel进行比对，判断突变信息的致病性。

本发明的有益效果是：本发明提供的基因Panel、试剂盒和应用，可针对遗传性乳腺癌卵巢癌综合征BRCA相关基因、林奇综合征相关基因、其他与所述多种肿瘤相关的基因和同源重组修复通路关键基因进行胚系水平或合并肿瘤组织水平的检测，并根据检测结果准确评估这些基因与妇科肿瘤、乳腺癌、前列腺癌及消化道肿瘤相关的遗传风险，指导肿瘤患者有关铂类化疗药及PARP抑制剂的适用情况。

附图说明

图1为本发明具体实施例所述阳性变异证据描述报告截图；

图2为本发明具体实施例所述BRCA1突变相关的临床意义描述或可能获益情况的报告截图。

具体实施方式

为了更好地理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案做详细的说明。

本发明实施例提供的基因Panel中包括的基因采用如下方法筛选得到：

从TCGA（The Cancer Genome Atlas，肿瘤基因组图谱）数据库中筛选有关妇科肿瘤、乳腺癌、前列腺癌及消化道肿瘤研究数据中的HRR（homologous recombinationrepair，同源重组修复）通路关键基因（HRR）；

根据美国国立癌症综合网络（NCCN）指南中关于遗传性乳腺癌卵巢癌多基因Panel推荐进行筛选；

从文献报道中筛选与PARP［poly（ADP-ribose）polymerase， PARP，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶］抑制剂疗效相关的HRR基因；

根据 PARP抑制剂疗效临床试验筛选与妇科肿瘤、乳腺癌、前列腺癌及消化道肿瘤有关的HRR基因；

根据已上市的与妇科肿瘤、乳腺癌、前列腺癌及消化道肿瘤有关的基因Panel进行筛选。

本发明实施例中，筛选得到的遗传性乳腺癌卵巢癌综合征BRCA（breast cancersusceptibility gene）相关基因包括：BRCA1、BRCA2。其中，BRCA1基因有害突变可显著增加女性乳腺癌、卵巢癌的罹患风险，也会增加男性乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等罹患风险。BRCA1突变可导致遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征，以常染色体显性的方式遗传。BRCA2基因有害突变可显著增加女性乳腺癌、卵巢癌、男性乳腺癌、胰腺癌的罹患风险，也会增加黑色素瘤和前列腺癌等罹患风险。BRCA2突变可导致遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征，以常染色体显性的方式遗传。BRCA2又名FANCD1，双等位突变可导致范可尼贫血症（Fanconi Anemia-D1），以常染色体隐性的方式遗传。

筛选得到的林奇综合征相关基因包括：MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM。这些基因突变可显著增加结直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和胰腺癌等罹患风险。而且上述基因突变可导致林奇综合征（Lynch Syndrome, LS）/遗传性非息肉病性结直肠癌（Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer, HNPCC），以常染色体显性的方式遗传。针对MLH1、MSH2、MSH6、PMS2双等位突变可导致构成性错配修复缺陷综合征（CMMR-D），以常染色体隐性的方式遗传。

筛选得到的其他与所述多种肿瘤相关的基因包括：PTEN、STK11、TP53、BRIP1、RAD51C、RAD51D、ATM、PALB2、CDH1、NBN、CHEK2、BARD1、RAD50、MRE11。其中，PTEN基因的有害突变可显著增加女性乳腺癌、子宫内膜癌、结直肠癌等多种癌症的罹患风险。PTEN突变可导致PTEN错构瘤综合征/Cowden综合征，以常染色体显性的方式遗传。

STK11基因的有害突变可增加非上皮性卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、女性乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌等多种癌症的罹患风险。STK11突变可导致黑斑息肉综合征/Peutz-Jeghers综合征（PJS），以常染色体显性的方式遗传。

TP53基因的有害突变可显著增加女性乳腺癌风险，同时也增加子宫内膜癌、卵巢癌、结直肠癌和胰腺癌等多种癌症的罹患风险。TP53突变可导致Li-Fraumeni综合征，以常染色体显性的方式遗传。

BRIP1基因的有害突变可显著增加卵巢癌的风险，可能增加女性乳腺癌风险。BRIP1又名FANCJ，突变可导致范可尼贫血症（Fanconi Anemia-J），以常染色体隐性的方式遗传。

RAD51C基因的有害突变可显著增加卵巢癌的风险，可增加女性ER/PR阴性乳腺癌的风险。RAD51C又名FANCO，突变可导致范可尼贫血症（Fanconi Anemia-O），以常染色体隐性的方式遗传。

RAD51D基因的有害突变可显著增加卵巢癌的风险，可增加女性ER/PR阴性乳腺癌的风险。

ATM基因的有害突变可增加女性乳腺癌、结直肠癌和胰腺癌的罹患风险，潜在增加卵巢癌的罹患风险。ATM突变可导致共济失调性毛细血管扩张症（A-T），以常染色体隐性的方式遗传。

PALB2基因的有害突变可增加女性乳腺癌、男性乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌等罹患风险。PALB2又名FANCN，突变可导致范可尼贫血症（Fanconi Anemia-N），以常染色体隐性的方式遗传。

CDH1基因的有害突变可增加女性乳腺癌、胃癌，结直肠癌的罹患风险。CDH1突变可导致遗传性弥漫性胃癌，以常染色体显性的方式遗传。

NBN基因的有害突变可能增加女性乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等的罹患风险。NBN突变可导致奈梅亨染色体不稳定综合征（Nijmegen breakage syndrome, NBS），以常染色体隐性的方式遗传。

CHEK2基因的有害突变可增加女性乳腺癌、男性乳腺癌的风险。

BARD1基因的有害突变可增加女性乳腺癌的风险。

RAD50基因的有害突变可能增加乳腺癌、卵巢癌的罹患风险。

MRE11基因的有害突变可能增加乳腺癌、卵巢癌的罹患风险。

本发明实施例中，筛选得到的妇科肿瘤、乳腺癌、前列腺癌及消化道肿瘤相关的同源重组修复通路关键基因包括：ABRAXAS1(FAM175A)、ATM、ATR、BAP1、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、C11ORF30(EMSY)、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCI、FANCL、MRE11、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD50、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54B、RAD54L。

本发明实施例中，筛选得到的这些基因，不仅包括目前已上市PARP抑制剂、免疫药物所对应的所有生物标志物，可用于充分指导肿瘤的精准治疗；而且包括与妇科肿瘤、乳腺癌、前列腺癌及消化道肿瘤相关的HRR基因，生成的基因Panel精简且准确，可全面、精准地覆盖HRR通路相关的基因，实现用小的Panel全面地满足PARP抑制剂敏感性标志物的检测需求。

另外，由于本发明的基因Panel还包括遗传性肿瘤相关基因，因此可充分评估遗传性肿瘤风险。当受检者存在致病或可能致病遗传易感基因突变时，可建议家族中尚未发病的健康人进行遗传评估，有助于提前了解和控制相应肿瘤的发病风险。

为了实现对子妇科肿瘤、乳腺癌、前列腺癌及消化道肿瘤的精准治疗，本发明采用目标区域捕获二代测序技术，分析36个与肿瘤个体化用药肿瘤药物（PARP抑制剂及免疫检查点抑制剂）及遗传风险相关基因的全部外显子区域、部分基因的热点区域，以及化疗药物相关SNP位点。从而检测与妇科肿瘤、乳腺癌、前列腺癌及消化道肿瘤有明确临床意义的基因点突变（SNV）、小片段插入缺失（Indel）、进一步指导肿瘤的精准治疗。同时也可以根据肿瘤患者检测到的基因突变辅助入组相应的临床试验。对临床治疗、诊断以及新靶点的发现提供指导意义。

在本发明实施例中，具体的可以采用如下方法实现对多种肿瘤的检测：

提取检测样本DNA；

构建检测样本DNA文库；

构建如上所述的基因Panel的检测探针；

所述检测探针与所述DNA文库杂交捕获，并测序；

将突变信息与上述的基因Panel进行比对，判断突变信息的致病性。

其中，所属样本DNA包括血液样本DNA，肿瘤组织样本DNA。构建DNA文库主要采用如下步骤：DNA打断、末端修复加A、接头连接、文库扩增、纯化。

采用如下方法对本发明提供的方案效果进行验证，具体验证方法和结果如下：

1、建库起始量评估

评估不同起始量对检测结果的影响。选取2例样本，分别使用30ng、50ng和100ng起始建库，每个样本做三次重复。对比起始量对检测结果的影响。结果显示：最低投入量为30ng。

2、阳性符合率评估

检测54例样本（胚系23例，体系31例），46个BRCA基因相关突变，样本来源包括细胞系、临床样本。检测结果均为阳性。即阳性位点符合率为100%。

3、阴性符合率评估

检测20例阴性样本（胚系10例，体系10例），样本来源为临床样本，检测结果均为阴性，即阴性符合率为100%。

4、最低检测限评估

选择5例细胞系样本，变异类型包括单核苷酸变异（SNV）、小片段插入缺失（Indel），每例样本稀释到1%、2%、5%，每个突变频率各做3次平行。结果显示，有一例样本稀释的2%频率经ddPCR验证频率为0.96%，该点NGS检测未检出。其他样本经ddPCR验证突变频率为1%的突变位点部分未检出，突变频率为2%和5%的位点全部检出。最终结果显示：最低检出限为 2%。

5、重复性验证

选择7例样本（临床样本和细胞系），进行3次批内重复及3次批间重复检测。检测结果显示5次重复结果一致。

6、干扰物分析

选取2例样本，分别添加干扰物质胆红素（浓度342μM/L）、甘油三酯（浓度37mM/L）、血红蛋白（浓度2g/L）及80%乙醇，每例样本每个处理做3个重复。结果显示：胆红素（浓度342μM/L）、甘油三酯（浓度342mM/L）、血红蛋白（浓度2g/L）、80%乙醇均对检测结果无影响。

7、DNA质量评估

选7例不同质量等级的样本，使用100ng DNA建库，每个样本重复3次。从而评估不同质量的样本对突变检出的影响。DNA主条带＞500bp的样本，变异位点均可被检出。

通过上述验证可知，采用本发明的方案，以上验证样本肿瘤含量均≥20%，因此针对肿瘤含量≥20%的样本，30ng样本投入量，可以检测到2%突变频率的点突变和插入缺失。

具体实施例

以富集得到的36基因片段用于基于下一代测序技术对卵巢癌患者进行突变检测，指导患者精准治疗为例，示例性地说明本发明。

该检测过程主要包含如下步骤：准备DNA样本库、DNA文库的构建、检测探针与DNA文库杂交并基于下一代测序技术进行检测、生信分析识别突变、突变解读、根据解读结果出具报告。

步骤一：提取检测样本DNA（所属样本DNA包括血液样本DNA，肿瘤组织样本DNA）。

步骤二：检测样本DNA文库的构建。主要步骤有：DNA打断、末端修复加A、接头连接、PCR富集、文库扩增、纯化。具体可以按照如下步骤进行实施：

1、样本制备

对于石蜡包埋组织样本，使用 QIAGEN 公司QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，血液样本使用QIAamp DNA Blood Mini Kit，严格按照说明书步骤进行操作。所提 DNA 需要进行定量检测，提取后的 DNA 使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 及配套仪器进行检测，提取总量应不少于 50ng。

2、DNA文库构建

使用商品化文库构建试剂盒IDT xGEN Prism DNA Library Prep Kit（IDT，catNo.10006203）按照如下流程进行文库构建。

2.1取样打断

1)采用如表1所示打断体系：

2) FFPE DNA使用Covaris打断，血液细胞基因组DNA使用Covaris打断或Bioruptor打断。

①Covaris打断操作如下：

a.准备Covaris打断管，在管盖标记DNA样本序号

b.在打断管中加入TE Buffer pH 8.0和样本

c.对样本进行打断，打断仪打断参数如表2所示：

②Bioruptor打断操作如下：

a. 准备Bioruptor打断管，在管盖标记DNA样本序号

b. 在打断管中加入TE Buffer pH 8.0和样本

c.对样本进行打断，打断仪打断参数如表3所示：

d.打断后的DNA用2%琼脂糖凝胶电泳质检，使用50bp DNA Ladder和D2000 DNAladder，电压150V，电泳条带在200bp-300bp为合格。

2.2、末端修复

1) 按照表4配制End Repair Mix。

2)参照表5，设置End Repair反应程序，调节热盖温度为40℃。

3)将样本放入PCR仪，运行End Repair反应程序。

4)将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存。

2.3、配制Ligation1 Mix

1)按照表6配制Ligation 1 Mix。

2.4、末端修复后纯化

1)从4℃冰箱取出AMPure XP磁珠，室温平衡30min。

2)取147.5μL（2.5×）AMPure XP磁珠加入到末端修复样品中，充分混匀。

3)室温静置10min，转移至磁力架，静置5min至液体完全澄清，弃上清，注意勿吸到磁珠。

4)沿管侧壁缓慢加入160μL 80%乙醇，静置30s, 使用移液器移弃上清。

5)重复步骤4）一次。

6)用10μL移液器吸除残留的乙醇，室温放置3min晾干。

7)向样品管中加入30μL Ligation 1 Mix，震荡混匀，瞬时离心。

2.5、Ligation 1

1）参照表7，设置Ligation 1反应程序，调节热盖温度为70℃。

注：此环节结束后，可将样本放于4℃保存，不超过2h。

2）运行Ligation 1反应程序。

2.6、Ligation 2

1)按照表8，配制Ligation 2 Mix。

2）从PCR仪上取出Ligation 1的PCR反应管，瞬时离心后置于冰上。向每个反应管中分装10μL Ligation 2 Mix，振荡混匀，瞬时离心。

3）参照表9设置Ligation 2反应程序，调节热盖温度为70℃。

4）将样本放入PCR仪，运行Ligation 2反应程序。

2.7、Adaptor连接后纯化

1)取100μL（2.5×）PEG/NaCl加入到Ligation 2反应后的样品中，充分混匀。

2)室温静置10min，转移至磁力架，静置5min至液体完全澄清，弃上清，注意勿吸到磁珠。

3)沿管侧壁缓慢加入160μL 80%乙醇，静置30s, 使用移液器移弃上清。

4)重复步骤3）一次。

5)用10μL移液器吸除残留的乙醇，室温放置3min晾干。

6)向样品管中加入20μL Nuclease-Free Water，震荡混匀，瞬时离心。

2.8、PCR扩增

1)按照表10体系在PCR管中配制PCR反应体系。

2) 振荡混匀，瞬时离心使全部反应液置于PCR管底部。

PCR扩增程序如表11：

2.9、文库纯化与定量

1)从4℃冰箱取出AMPure XP磁珠，室温平衡30min。

2)将PCR产物从PCR仪中拿出，瞬时离心，放在磁力架上静置5min，将上清液转移至新管中。

3)取65μL（1.3×）AMPure XP磁珠加入到PCR产物中，用移液器（量程65μL）吹打20下，充分混匀。

4)室温静置10min，转移至磁力架，静置5min至液体完全澄清，弃上清，注意勿吸到磁珠。

5)沿管侧壁缓慢加入160μL 80%乙醇，静置30s, 使用移液器移弃上清。

注：若弃废液时吸到磁珠，需静置2min，待磁珠被吸附后，弃上清。

6)重复步骤5）一次。

7)用10μL移液器吸除残留的乙醇，室温放置3min晾干。

8)向样品管中加入32μL TE Buffer PH 8.0，震荡混匀，瞬时离心，室温孵育8min。

9)将样品管置于磁力架上5min，至液体完全澄清，使用移液器小心将30μL上清转移至新的1.5ml离心管中。

10)使用Qubit 4.0对文库Qubit进行定量。

2.10、文库质检

结果如表12所示。

2.11、文库保存，将文库放入扩增区-20℃冰箱存放。

步骤三：将本发明所述检测Panel的检测探针，与DNA文库杂交捕获，并测序。具体的，在本发明实施例中，具体采用Integrated DNA Technologies IDT 公司网站的 TargetCapture Probe Design & Ordering Tool工具设计并制造了2059个IDT探针。

文库杂交步骤如下：

1、将 Human Cot DNA和xGen® Universal Blockers-TS Mix振荡混匀，瞬时离心。

2、按照表13配制杂交反应液Mix。

3、向离心管中加入7μL Mix以及500ng-1ug DNA文库，震荡混匀，瞬时离心。并放入真空浓缩仪中干燥，备用。

4、按照表14将xGen^® 2x Hybridization Buffer 和xGen^® 2x Hyb BufferEnhancer振荡混匀，瞬时离心，得到杂交反应液。

5、向蒸干后的样本中加入上述杂交反应液、4μL探针，于恒温混匀仪上25℃孵育10min。

6、放入PCR仪中，点击程序，开始运行。PCR程序如表15：

文库洗脱步骤如下：

1. 链霉亲和素磁珠清洗

1）将xGen^® 2x Hybridization Buffer和xGen® 2X Hyb Buffer Enhancer振荡混匀，瞬时离心。

2）按照表16配制磁珠悬浮液Mix。

3) 将Dynabeads M-270 Streptavidin 振荡混匀。每个文库Dynabeads M-270Streptavidin 的用量为50μL。

4) 每个文库 1XBead Wash Buffer（Nuclease-Free Water和xGen® 2x BeadWash Buffer按1:1比例配制）的用量为100μL，向管中加入相应体积的1X Bead WashBuffer振荡混匀（n×100 μL），瞬时离心，置于磁力架1min，待液体完全澄清，使用移液器吸弃上清。

5) 重复步骤4）两次。

6) 用移液器将残留液体吸出。

7) 每个文库磁珠悬浮液的用量为17μL，向管中加入相应体积的磁珠悬浮液悬浮。

8) 准备相应个数的PCR管，每个管中分装17μL的磁珠与悬浮液的混合液。

9) 将含有磁珠悬浮液的PCR管放入PCR仪中孵育5min。

2. 链霉亲和素磁珠捕获

1）4-16h杂交反应后，将重悬的链霉亲和素磁珠混匀后分两次加到杂交体系中。将样本管转移至正在运行PCR仪中，并点击下一步。

2）65℃孵育45min，每15min振荡混匀一次，确保磁珠完全重悬。

3.热洗脱

1) 按照表17打开PCR仪设置程序。

2)将分装好的装有1X Wash BufferⅠ（ Nuclease-Free Water和xGen^®10x WashBufferⅠ按1:9比例配制）和1X Stringent Wash Buffer（Nuclease-Free Water和xGen^®10xStringent Wash Buffer按1:9比例配制）的PCR管放在PCR仪中预热。

3)45min 65℃孵育结束后，将与链霉亲和素磁珠捕获后的杂交样本转移至装有1XWash BufferⅠ的PCR管中混匀。将PCR管置于磁力架上1min，待液体完全澄清后，用移液器彻底移弃上清。

4)将1X Stringent Wash Buffer转移至装有样本磁珠的PCR管中，混匀，盖紧管盖，放入PCR仪中65℃孵育5min。到时间后将装有样本的PCR管置于磁力架上至澄清，用移液器彻底移弃上清。

5)重复步骤4）一次。

4.常温洗脱

1）将装有样本的PCR管从磁力架取下，用移液器从分装管中吸取150ul 1X WashBufferⅡ（ Nuclease-Free Water和xGen^®10x Wash BufferⅡ按1:9比例配制）加入装有磁珠的PCR管中，室温孵育2min，期间于恒温混匀仪上混匀30s后静置30s，交替进行，确保充分混匀。将PCR管瞬时离心后于磁力架静置1min，用移液器彻底移弃上清。

2）将装有样本的PCR管从磁力架取下，瞬时离心后上磁力架，用移液器移去少量残余Buffer。

3）向管中加入21μL Nuclease-Free Water，吹吸混匀。

4）提前15-20min将KAPA HiFi HotStart ReadyMix 、引物FCF（10μM）和FCR（10μM）置于4℃融解。

5) 按照表18在PCR管或离心管进行反应体系配制。

6) 将配置好的MIX分装到标记样本序号的PCR管中。

7) 用移液器转移20μL带磁珠产物至对应关系的PCR管中，混匀。

8) 在PCR仪上启动如表19所示程序：

文库纯化步骤如下：

1）将AMPure XP磁珠振荡混匀，吸取60μL加入至做好标记的PCR管中。

2）PCR扩增后，取出PCR管并置于磁力架2min，待液体完全澄清后，将上清转移至磁力架的PCR管中。

3）振荡混匀，室温孵育10min。

4）将PCR管瞬时离心后置于磁力架上5min，待液体完全澄清后，移弃上清（留5-10μL液体）。

5）沿PCR管侧壁缓慢加入200μL 80%乙醇，静置30s, 使用移液器移弃上清。

6）重复步骤5）一次。

7）将PCR管从磁力架取出，瞬时离心后置于磁力架上，使用移液器移去少量残留乙醇，注意勿吸到磁珠。

8）打开PCR管盖，使磁珠置于室温干燥，磁珠表面无液体反光，注意不能过度干燥。

9）向PCR管加入31μL TE Buffer pH 8.0，振荡混匀，室温孵育5min。

10）将PCR管瞬时离心后置于磁力架上1-2min，至液体完全澄清，用移液器小心将30μL上清转移至新的1.5mL离心管中，注意勿吸到磁珠。

11）进行文库质检，合格后上机测序。

步骤四：对测序结果进行生物信息学分析，获得检测样本的突变结果。具体可以采用如下方法进行实施：

使用fastp（v0.19.4）软件去除实验及测序环节引入的接头序列及低质量碱基序列获得高质量测序数据。其中，要求数据质量满足Q30≥80%，否则判定为质控不通过。

使用bwa（0.7.17）序列比对软件将上述满足要求的数据比对至hg19（GRCh37）参考基因组上，生成记录比对结果的BAM格式文件。然后使用Samtools（v1.9）和GenomeAnalysisTK（v4.1.0）工具对BAM文件进行排序、去重及碱基质量校正，获得最终BAM文件，并基于此文件进行后续突变分析。

其中，参考基因组比对率需≥90%，对照样本目标区域平均测序深度需≥100×，肿瘤样本目标区域平均测序深度需≥500×，目标区域内深度大于平均深度×0.2的位点比例需≥90%。

使用GenomeAnalysisTK（v4.1.0）的变异鉴定模块对样本中的点突变、插入缺失突变进行分析。得到89个变异，经过人群频率及数据库过滤掉明确的良性变异后，最后获得如下三个变异进入注释流程：变异1：NM_007294.3(BRCA1):c.5470_5477del(p.Ile1824AspfsTer3)；变异2：NM_001184.3(ATR):c.117A>G(p.Gln39=)；

变异3：NM_000546.5(TP53):c.460G>A(p.Gly154Ser)；

对得到的三个变异进行注释：使用基于Annovar（v2018.04.16）搭建的变异注释模块对点突变、插入缺失等类型变异进行注释，注释使用的数据库及工具包括ClinVar、LOVD、gnomAD、REVEL等。注释结果反馈医学进行位点解读和报告出具。

步骤五：对突变结果进行解读，判断突变的致病性。基于步骤4中对变异的注释结果，针对检出的三个非良性变异按照《ACMG遗传变异分类标准与指南》规定的变异分类标准，确认、补充匹配的证据，根据证据分析得出三个变异的分类结果：

变异1：NM_007294.3(BRCA1):c.5470_5477del(p.Ile1824AspfsTer3)匹配到的证据为PM2+PP5+PVS1+PS4，故将变异1划分为5类-致病；

变异2：NM_001184.3(ATR):c.117A>G(p.Gln39=)匹配到的证据为 BP4+BP7，故将变异2划分为2类-可能良性；

变异3：NM_000546.5(TP53):c.460G>A(p.Gly154Ser)未匹配到相应证据，故将变异3划分为3类-临床意义未明。

根据上述解读分类结果，最终将变异1：NM_007294.3(BRCA1):c.5470_5477del(p.Ile1824AspfsTer3)作为阳性变异报出，并进行证据描述，具体的报告截图可如图1所示。

步骤六：根据位点解读结果出具检测报告。

该卵巢癌患者血液样本中，检测到致病胚系突变NM_007294.3(BRCA1):c.5470_5477del。即，BRCA1存在致病胚系突变。同时携带BRCA1致病胚系变异提示受检者为HBOC（遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征）患者，除增加卵巢癌风险外，还会显著增加乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、男性乳腺癌、黑色素瘤等的发病风险；且该综合征以常染色体显性的方式遗传，提示受检者的一级亲属有50%的概率携带该BRCA1的致病变异。BRCA1突变相关的临床意义描述或可能获益情况的报告截图可如图2所示。

可见，采用本发明提供的技术方案可以用于包括卵巢癌等多种肿瘤的突变检测，检测结果能够实现精准治疗的有效的指导作用。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。

Claims

1.一种检测卵巢癌的探针Panel在制备评估卵巢癌遗传风险装置中的应用，其特征在于，所述探针Panel包括遗传性乳腺癌卵巢癌综合征BRCA相关基因、林奇综合征相关基因、其他与肿瘤相关的基因和同源重组修复通路关键基因的检测探针；其他与肿瘤相关的基因包括：PTEN、STK11、TP53、BRIP1、RAD51C、RAD51D、ATM、PALB2、CDH1、NBN、CHEK2、BARD1、RAD50、MRE11；

所述遗传性乳腺癌卵巢癌综合征BRCA相关基因包括：BRCA1、BRCA2；

所述林奇综合征相关基因包括：MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM；

所述同源重组修复通路关键基因包括：ABRAXAS1、ATM、ATR、BAP1、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、C11ORF30、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCI、FANCL、MRE11、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD50、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54B、RAD54L。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其中所述装置还包括：

对比模块，将突变信息与权利要求1中所述探针Panel所检测的基因进行比对，判断突变的致病性。