CN106636376A - 用于检测人类ros1融合基因的核酸、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测人类ROS1融合基因的核酸组、试剂盒，及其试剂盒的使用方法。本发明用于检测ROS1融合基因的类型多：可以检测出12种ROS1融合基因，并明确融合类型。该检测试剂盒适用于临床多种样本类型，具有检测种类多，灵敏度高，特异性强，实验操作简单，周期短，安全无毒，成本低等显著优点。

Description

用于检测人类ROS1融合基因的核酸、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及用于人类ROS1融合基因的核酸、试剂盒及方法。
背景技术
肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。从组织病理学上可以分为小细胞肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)两大类，其中NSCLC包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌、类癌等，NSCLC约占肺癌总病例的85％。在发达国家肺癌患者的5年生存率可以达到20％左右，而我国肺癌患者的5年生存率仅为13％，而约70％的NSCLC在确诊时己处于晚期。其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏的基因突变检测和确诊技术，以及与之相配的科学治疗方案，从而使患者错失了治疗的最佳时机。据我国卫生部的统计，肺癌相关死亡率居恶性肿瘤总死亡率的首位。手术、放疗和化疗一直是NSCLC的主要治疗方法。手术治疗是NSCLC最佳治疗方法，但当NSCLC被发现时，仅20～30％的病例有手术指征，且术后复发和转移率仍高达50％以上。其主要治疗方法化疗的疗效也并不让人满意。随着肿瘤分子生物学的发展，肺癌的分子靶向治疗因其特异性高，毒副作用低，日益成为临床医生首选治疗方式。
近年来，随着对肿瘤发病机制及其生物学行为研究的不断深入，肺癌的分子靶向治疗领域成为研究热点。活性氧基团基因1(Reactive Oxygen Species 1，ROS1)是胰岛素受体家族的一种跨膜酪氨酸激酶，与禽流感肉瘤病毒UR2的v-ros序列具有同源性，因此被命名为ROS基因。ROS1基因编码一种受体酪氨酸激酶，当与CD74、EZR、SLC34A2等基因发生融合后，会持续激活ROS1酪氨酸激酶区及下游PI3K/AKT、JAK/STAT、RAS/MAPK等信号通路，导致肿瘤的发生和转移。ROS1融合基因是NSCLC中最新发现的分子靶标，其融合基因具有生物学活性。就目前的研究而言，20～30％的NSCLC患者存在ROSl的高表达，作为最新发现的肺癌驱动基因，对临床实践具有非常重要的指导意义。临床实践证明，小分子酪氨酸激酶抑制剂克唑替尼(Crizotinib)对于ROS1融合阳性的NSCLC患者有显著疗效，检测ROS1融合基因可筛选出对ROS1融合基因突变靶向药物受益的患者。
临床上检测ROS1融合基因突变的检测方法主要为直接测序法和荧光原位杂交(FISH)法。然而，直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30％，易出现假阴性；检测操作复杂，效率低，通常要1-2天才可出检测结果；而FISH法检测特异性差，灵敏度低，检测时间长。此外，FISH检测需要昂贵的专用仪器设备，试剂成本较高，操作复杂，使临床检测广泛使用受到了限制。FISH检测要求检测样本保存时间不宜过长，采用保存时间长的样本进行检测会导致假阴性的发生，影响了检测的准确性。因而，直接测序法和荧光原位杂交(FISH)法无法满足临床检测实际的需求，临床迫切需要开发一种快速融合基因突变检测的方法，以实现对融合基因突变进行快速、准确地检测。
发明内容
为克服以上现有检测人类ROS1融合基因方法的不足，本发明的目的是提供用于检测人类ROS1融合基因的核酸组。本发明的另一个目的是提供一种用于检测人类ROS1融合基因的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于检测人类ROS1融合基因的核酸组，该核酸组包括以下S01～S12的12种ROS1融合基因变体类型的检测引物对的一组或多组：
S01：CD74:ROS1(C6:R32)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ IDNO.2所示；
S02：SDC4:ROS1(S2:R32)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ IDNO.2所示；
S03：SDC4:ROS1(S4:R32)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ IDNO.2所示；
S04：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.6和SEQ IDNO.2所示；
S05：SDC4:ROS1(S4:R34)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ IDNO.8所示；
S06：CD74:ROS1(C6:R34)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.10和SEQ IDNO.8所示；
S07：EZR:ROS1(E10:R34)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.11和SEQ IDNO.8所示；
S08：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.12和SEQ IDNO.8所示；
S09：TPM3:ROS1(T8:R35)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ IDNO.14所示；
S10：LRIG3:ROS1(L16:R35)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.16和SEQ IDNO.14所示；
S11：GOPC:ROS1(G8:R35)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.17和SEQ IDNO.14所示；
S12：GOPC:ROS1(G4:R36)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.18和SEQ IDNO.19所示。
如上所述核酸组，还包括用于荧光RT-PCR检测时，各基因相应的如下检测探针：
S01：CD74:ROS1(C6:R32)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
S02：SDC4:ROS1(S2:R32)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
S03：SDC4:ROS1(S4:R32)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
S04：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
S05：SDC4:ROS1(S4:R34)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
S06：CD74:ROS1(C6:R34)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
S07：EZR:ROS1(E10:R34)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
S08：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
S09：TPM3:ROS1(T8:R35)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
S10：LRIG3:ROS1(L16:R35)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
S11：GOPC:ROS1(G8:R35)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
S12：GOPC:ROS1(G4:R36)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，上述检测探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
如上所述核酸组，还包括用于每组基因检测的内部质控，所述内部质控包括质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，所述质控探针的5’端标记有不同于所述检测探针的荧光基团，3’端标记淬灭基团。
如上所述核酸组，还包括S01～S12的12种ROS1融合基因变体类型中的一组或多组如下的阳性对照品：
S01：CD74:ROS1(C6:R32)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.24所示；
S02：SDC4:ROS1(S2:R32)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.25所示；
S03：SDC4:ROS1(S4:R32)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.26所示；
S04：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.27所示；
S05：SDC4:ROS1(S4:R34)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；
S06：CD74:ROS1(C6:R34)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.29所示；
S07：EZR:ROS1(E10:R34)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.30所示；
S08：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.31所示；
S09：TPM3:ROS1(T8:R35)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.32所示；
S10：LRIG3:ROS1(L16:R35)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；
S11：GOPC:ROS1(G8:R35)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.34所示；
S12：GOPC:ROS1(G4:R36)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.35所示。
一种用于检测人类ROS1融合基因的试剂盒，该试剂盒包括如上所述的核酸组。
如上所述的试剂盒，优选地，该试剂盒用于荧光RT-PCR检测，其中，所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。
如上所述的试剂盒，优选地，该试剂盒用于荧光RT-PCR检测，试剂盒内包括：
不同基因类型的检测试剂：每一个ROS1融合基因变体的检测引物和检测探针在一个反应体系中，该基因类型的反应体系中还含有质控引物对和质控探针，以及PCR缓冲液，构成一管该基因类型的检测试剂；
一管含反转录酶和DNA聚合酶的酶试剂；
有阳性对照品的，还有一管阳性对照品混合液，阳性对照混合液内含与该试剂盒内所有检测引物基因类型相应的该种ROS1融合基因类型的阳性对照品。
其中，PCR缓冲液含buffer、dNTPs、Mg2+等，可以直接购买市售商品，也可以自行配制，为现有技术已知内容。
如上所述的试剂盒，优选地，试剂盒中包括全部12种ROS1融合基因类型的检测引物对和检测探针，每种基因类型的检测引物和探针，连同质控引物对和质控探针以及PCR缓冲液独立包装在一管内。
本发明还提供了以上任一所述的用于检测人类ROS1融合基因的试剂盒，用于荧光RT-PCR检测，其中所述各基因的检测探针的5’端标记FAM，所述质控探针的5’端标记JOE，，使用方法是将待检样品提取RNA，加入到各种ROS1融合基因类型的检测反应体系中，进行荧光定量PCR反应，收集反应信号，JOE信号应达到设定阈值Ct值小于26，检测结果有效，否则实验失败，应重新检测；检测JOE信号满足Ct值小于26后，进行下列判断：
每种检测体系中FAM信号Ct值＞30或无Ct值，表明该样本阴性不存在ROS1融合基因；
其中某种检测体系中FAM信号Ct值≤30，表明该待检样品中含有该种类型的ROS1融合基因。
优选地，上述使用方法中，荧光定量PCR反应程序为：45℃反应5min，1个循环；95℃反应5min，1个循环；95℃反应30s，58℃反应45s，共10个循环；95℃反应15s，58℃反应45s，共35个循环，在58℃时收集信号。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)检测融合类型多：可以检测出多种ROS1融合基因，见表1。
(2)明确融合类型：一种融合类型对应一个反应孔，使样本检测出来的融合类型很明确，见表4。
(3)适用于多种样本类型：本技术对标本RNA获取质量要求低，无论是新鲜组织还是石蜡组织，血清，血浆都能获得理想的检测效果。
(4)操作简单，检测时间短：目前市场产品和技术都是两步PCR，第一步反转录把RNA转录成cDNA，第二步开管把cDNA加入到PCR反应条。但本试剂盒只需要一次加样直接加入提取好的样本RNA即可，反转录和PCR扩增在封闭的同一管反应体系中进行，这样不但降低了污染几率，而且降低了结果出现偏差的几率。一次检测只需90分钟完成。
(5)特异性好：用本试剂盒检测A549细胞系提取RNA，检测ALK融合基因，检测RET融合基因，检测结果均为阴性。
(6)灵敏度高：经分析灵敏度，验证1～10copy DNA基因组均可检出。
(7)结果判读明确直观：直接看扩增曲线和Ct值就可判断结果。
总之，本发明涉及的人类ROS1融合基因检测试剂盒适用于临床多种样本类型选择，具有检测种类多，灵敏度高，实验操作简单，周期短，安全无毒，成本低等显著优点。
附图说明
图1为本发明试剂盒检测含ROS1融合基因的非小细胞肺腺癌FFPE样本RNA扩增曲线图。
图2为本发明试剂盒检测S1体系灵敏度的扩增曲线图。
图3为本发明试剂盒检测S2体系灵敏度的扩增曲线图。
图4为本发明试剂盒检测S3体系灵敏度的扩增曲线图。
图5为本发明试剂盒检测S4体系灵敏度的扩增曲线图。
图6为本发明试剂盒检测S5体系灵敏度的扩增曲线图。
图7为本发明试剂盒检测S6体系灵敏度的扩增曲线图。
图8为本发明试剂盒检测S7体系灵敏度的扩增曲线图。
图9为本发明试剂盒检测S8体系灵敏度的扩增曲线图。
图10为本发明试剂盒检测S9体系灵敏度的扩增曲线图。
图11为本发明试剂盒检测S10体系灵敏度的扩增曲线图。
图12为本发明试剂盒检测S11体系灵敏度的扩增曲线图。
图13为本发明试剂盒检测S12体系灵敏度的扩增曲线图。
图14为本发明试剂盒检测不含ROS1融合基因的A549细胞系RNA模板扩增曲线图。
图15为本发明试剂盒检测含有ALK融合基因定的扩增曲线图。
图16为本发明试剂盒检测含有RET融合基因模板的扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1引物、探针、验证模板
设计本发明是针对人类ROS1融合基因12组不同融合基因类型来设计检测引物，本发明设计的检测引物用于普通PCR可扩增出对应的融合基因类型的特异性产物，并设计检测探针用于实时荧光RT-PCR的检测，具体融合基因的类型见表1.
表1 本发明可检测融合基因的类型
通过对检测引物对、检测探针的筛选和体系的优化，最终确定的各基因的检测引物对和检测探针及可以作为阳性对照品的各基因对应扩增产物的序列如下，其中检测引物对及探针的核苷酸序列见表2，ROS1融合基因外显子拼接序列，即阳性对照品的序列见表3。
S01：ROS1融合基因变体：CD74:ROS1(C6:R32)的检测引物对：上游引物(SEQ IDNO.1)，下游引物(SEQ ID NO.2)、检测探针(SEQ ID NO.3)；其阳性对照品(含SEQ IDNO.24)；
S02：ROS1融合基因变体：SDC4:ROS1(S2:R32)的检测引物对：上游引物(SEQ IDNO.4)，下游引物(SEQ ID NO.2)；检测探针(SEQ ID NO.3)、其阳性对照品(SEQ ID NO.25)；
S03：ROS1融合基因变体：SDC4:ROS1(S4:R32)的检测引物对：上游引物(SEQ IDNO.5)，下游引物(SEQ ID NO.2)；检测探针：(SEQ ID NO.3),其阳性对照品(SEQ IDNO.26)；
S04：ROS1融合基因变体：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的检测引物对：上游引物(SEQ IDNO.6)，下游引物(SEQ ID NO.2)；检测探针(SEQ ID NO.3)，其阳性对照品(SEQ ID NO.27)；
S05：ROS1融合基因变体：SDC4:ROS1(S4:R34)的检测引物对：上游引物(SEQ IDNO.7)，下游引物(SEQ ID NO.8)，检测探针(SEQ ID NO.9)，其阳性对照品(SEQ ID NO.28)；
S06：ROS1融合基因变体：CD74:ROS1(C6:R34)的检测引物对：上游引物(SEQ IDNO.10)，下游引物(SEQ ID NO.8)，检测探针(SEQ ID NO.9)，其阳性对照品(SEQ IDNO.29)；
S07：ROS1融合基因变体：EZR:ROS1(E10:R34)的检测引物对：上游引物(SEQ IDNO.11)，下游引物(SEQ ID NO.8)，检测探针(SEQ ID NO.9)，其阳性对照品(SEQ IDNO.30)；
S08：ROS1融合基因变体：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的检测引物对：上游引物(SEQ IDNO.12)，下游引物(SEQ ID NO.8)，检测探针(SEQ ID NO.9)，其阳性对照品(SEQ IDNO.31)；
S09：ROS1融合基因变体：TPM3:ROS1(T8:R35)的检测引物对：上游引物(SEQ IDNO.13)，下游引物(SEQ ID NO.14)，检测探针(SEQ ID NO.15)，其阳性对照品(SEQ IDNO.32)；
S10：ROS1融合基因变体：LRIG3:ROS1(L16:R35)的检测引物对：上游引物(SEQ IDNO.16)，下游引物(SEQ ID NO.14)，检测探针(SEQ ID NO.15)，其阳性对照品(SEQ IDNO.33)；
S11：ROS1融合基因变体：GOPC:ROS1(G8:R35)的检测引物对：上游引物(SEQ IDNO.17)，下游引物(SEQ ID NO.14)，检测探针(SEQ ID NO.15)，其阳性对照品(SEQ IDNO.34)；
S12：ROS1融合基因变体：GOPC:ROS1(G4:R36)的检测引物对：上游引物(SEQ IDNO.18)，下游引物(SEQ ID NO.19)，检测探针(SEQ ID NO.20)，其阳性对照品(SEQ IDNO.35)。
表2 相关引物探针序列
编号 序列(5＇-3＇)
SEQ ID NO.1 TGTTTGAAATGAGCAGGCACT
SEQ ID NO.2 CATTATCTTCAGCTTTCTCCCACTG
SEQ ID NO.3 TTTGGGAATGCCTGGTT
SEQ ID NO.4 GGCAGGAATCTGATGACTT
SEQ ID NO.5 AGAGAATCTCACCCGTTGAAGAG
SEQ ID NO.6 GGATATTCTTAGTAGCGCCTTCC
SEQ ID NO.7 GTTTGAAATGAGCAGGCACT
SEQ ID NO.8 CAAAGGTCAGTGGGATTGTAACA
SEQ ID NO.9 CCAGAAATATTCCAACTAT
SEQ ID NO.10 GACAGGCGGTGGATCAGATAA
SEQ ID NO.11 ACTGTGCAGGGCAGCAACA
SEQ ID NO.12 GGATATTCTTAGTAGCGCCTTCC
SEQ ID NO.13 TAGTTATTTGTCATCTCAGGGAACG
SEQ ID NO.14 GTATTGCATAGCAGGCATTAGCC
SEQ ID NO.15 CCTACTCCGGCTGCCA
SEQ ID NO.16 TTGAGGCTCAGGCGGAGAA
SEQ ID NO.17 CTTGATGAGTTAGAAGGAGGTGGTA
SEQ ID NO.18 GAATGAAGCCCTTCGTAGACATA
SEQ ID NO.19 CTTCATACACTTCTCCAAAGGCTC
SEQ ID NO.20 CCGAGGGAAGGCAGG
SEQ ID NO.21 ACCGAGCGCGGCTACAG
SEQ ID NO.22 CTTAATGTCACGCACGATTTCC
SEQ ID NO.23 ACCACCACGGCCGAG
表3 ROS1融合基因外显子拼接
进一步，为了对上述各组基因检测时，对实时荧光PCR反应体系和实验操作过程进行质控，同时检测样本的质量，避免漏检，本发明选用根据NCBI数据库公布的人类ACTB基因设计的内部控制引物和内控探针，并对内控的上下游引物进行筛选，使非模版体系(NTC)不起线，样本起线正常，并且要求设计的质控引物、质控探针、及质控扩增产物均不会与上述基因的检测引物对、检测探针及扩增产物有交叉反应。通过内部质控的质控引物对、质控探针的筛选和体系优化，建立了实时荧光PCR内部质控检测体系，其中，质控引物对(SEQ IDNO.21～22)、质控探针(SEQ ID NO.23)最后确定的核苷酸序列如表1中所示。
作为内部质控的质控引物对进行PCR扩增时，其扩增序列的大小为60bp，将扩增序列作为内部质控阳性对照物，即包含如SEQ ID No.36所示序列，作为验证是否漏检的质控阳性对照。
实施例2：用于检测人类ROS1融合基因的试剂盒
用于检测人类ROS1融合基因的试剂盒包括有实施例1中的检测12种不同的ROS1融合基因变体类型的检测引物对，可用于普通PCR扩增，来检测相对应的ROS1融合基因变体。
优选地，在上述试剂盒的基础上，用于实时荧光RT-PCR检测时，添加有各基因检测探针，检测探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，可用实时荧光RT-PCR来检测相应的ROS1融合基因变体。检测效率高，耗时短，不用跑电泳就可以获得检测结果。其中，荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。
为了便于PCR反应时，反应体系的配置，试剂盒还配有其他的反应试剂如PCR缓冲液、反转录酶、DNA聚合酶、DEPC水等。
在实际操作中，反应体系需要一一配置，本发明中提供一种配置好反应体系的试剂盒，该试剂盒用于人类ROS1融合基因的检测试剂盒，含12个PCR反应体系(两条6联条PCR管)，用来检测待检样本ROS1融合基因变体的情况。试剂盒内还有一管酶试剂(含有RT酶、TaqDNA酶)，试剂盒内PCR反应体系组成及检测ROS1融合类型见表4。
表4 ROS1融合基因荧光PCR检测试剂盒组成
其中，RT酶为逆转录酶，用于将RNA逆转录为cDNA；TaqDNA酶为DNA聚合酶；buffer为反应缓冲液；检测探针为TaqMan-MGB探针，5’端可标记FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一种，3’端可标记MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。
对样品进行检测时，为避免漏检，如避免有的反应体系中未加检测样本的情况出现，在每个检测体系中均设置有内部质控，即将质控引物对和质控探针都加入上述各检测体系中，其质控引物对和质控探针具体序列如实施例1中所述。应当注意的是检测探针与质控探针荧光基团标记为不同检测模式的荧光基团。
实施例3实时荧光RT-PCR法扩增临床样本RNA
1.临床样本RNA的提取
本实施例是从同济医院获得的4例非小细胞肺腺癌患者的石蜡包埋组织切片中提取RNA，并对其进行定量，作为检测模板。采用Qiagen公司的Cat.NO.73504QIAamp石蜡包埋组织提取试剂盒，具体详见该说明书，最后将将提取的RNA用紫外分光光度计进行定量，并稀释RNA浓度到1ng/μL。
2.运用实施例2中表4所述的试剂盒进行检测，其中，检测探针的5’端标记为荧光基团为FAM，3’端标记淬灭基团为MGB质控探针的5’端标记为JOE，3’端标记淬灭基团BHQ1，检测步骤如下：
(1)首先取6支离心管(PCR级，需自备)在管盖分别标记样本1、样本2、样本3、样本4、阴性对照和阳性对照；其次对相应6支离心管分别加入65μL(2ng/μL)待检测样本、阳性对照(STD)及非模板对照NTC(超纯水)至管底；最后再向6支离心管各自加入酶试剂(含RT酶和TaqDNA聚合酶)6.5μL；盖紧离心管盖后轻微震荡，离心，置于冰上，待用。
(2)取PCR反应条，确定好管号后轻轻打开PCR反应条管盖，，将步骤(1)混匀的待用液分别加到相对应的PCR孔中，5.5μL/孔。盖紧PCR反应条管盖，混匀离心，确保试剂全在PCR反应管的管底。
(3)把离心好的PCR反应条放于荧光定量PCR仪中，其中，PCR反应体系为：
(4)设定反应程序如下：
第一阶段：45℃反应5min；
第二阶段：95℃5min；
第三阶段：95℃30s，58℃45s，10个循环；
第四阶段：95℃反应15s，58℃反应45s，35个循环；
第四阶段：35个循环时，58℃45s收集FAM和JOE信号。
本发明通过各反应体系检测的FAM和JOE的荧光强度来判断检测结果；JOE是内控信号，用于检测是否漏加样本及判定样本质量，JOE信号应达到设定阈值(CT值＜26)；FAM是检测信号，用于检测是否存在ROS1融合基因位点；在内控信号达到要求后，以FAM信号达到设定阈值所需的循环次数Ct值作为判断标准，若12孔PCR管的FAM信号通道的Ct值＞30或无Ct证明样本阴性不存在融合类型，若12孔PCR管的FAM信号通道的任何一孔有扩增曲线且Ct值＜30则证明样本阳性存在融合类型，哪一孔有扩增曲线就判定次样本为对应哪种ROS1融合类型。具体判定见表5。
表5：试剂盒结果判定参考值
经过阳性对照品验证后，样本阴阳性的检测结果完全准确，其中，样本3含ROS1融合基因的非小细胞肺腺癌FFPE样本RNA扩增曲线图，见图1。
实施例4本发明试剂盒灵敏度和特异性检测
1.灵敏度检测
将实施例2的试剂盒中的阳性对照品进行稀释，加入上述12种各基因检测的反应体系中，使在每个反应体系中，分别含有浓度为1000拷贝/反应、100拷贝/反应、10拷贝/反应、1拷贝/反应的阳性对照品，进行实施例3中的实时荧光RT-PCR扩增，各个反应体系的灵敏度扩增图见图2～图13，由扩增图可看出，本发明的试剂盒可以准确检出低至1～10copyDNA基因的基因组DNA。
2.特异性检测
运用实施例2制备的试剂盒对由同济医院提供的不含ROS1融合基因的A549细胞系RNA、含有ALK融合基因和RET融合基因的样本为模板，进行实施例3中的实时荧光RT-PCR法检测，扩增曲线：其中不含ROS1融合基因的A549细胞系RNA的检测结果如图14，显示只有JOE有曲线，FAM信号通道无曲线；含有ALK融合基因为模板的检测结果见图15，显示只有JOE有曲线，FAM信号通道无曲线；其中含有RET融合基因为模板的检测结果见图16，显示只有JOE有曲线，FAM信号通道无曲线。说明本发明设计的引物对与检测探针具有较强的特异性。特异性强，与其它非目的基因没有非特异性扩增。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉海吉力生物科技有限公司
<120> 用于检测人类ROS1融合基因的核酸、试剂盒及方法
<130>
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
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tgtttgaaat gagcaggcac tccttggagc aaaagcccac tgacgctcca ccgaaagctg 60
gagtcccaaa taaaccaggc attcccaaat tactagaagg gagtaaaaat tcaatacagt 120
gggagaaagc tgaagataat g 141
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aaccaggcat tcccaaatta ctagaaggga gtaaaaattc aatacagtgg gagaaagctg 120
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agagaatctc acccgttgaa gagagtgagg atgtgtccaa caaggtgtca atgtccagca 60
ctgtgcaggg cagcaacatc tttgagagaa cggaggtcct ggcagctgga gtcccaaata 120
aaccaggcat tcccaaatta ctagaaggga gtaaaaattc aatacagtgg gagaaagctg 180
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tcccaaatta ctagaaggga gtaaaaattc aatacagtgg gagaaagctg aagataatg 119
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actgtgcagg gcagcaacat ctttgagaga acggaggtcc tggcagatga tttttggata 60
ccagaaacaa gtttcatact tactattata gttggaatat ttctggttgt tacaatccca 120
ctgacctttg 130
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tgtttgaaat gagcaggcac tccttggagc aaaagcccac tgacgctcca ccgaaagatg 60
atttttggat accagaaaca agtttcatac ttactattat agttggaata tttctggttg 120
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tg 122
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tttcatactt actattatag ttggaatatt tctggttgtt acaatcccac tgacctttg 119
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aggggtgaca gtgcttataa acgaagacaa agagttggct gagctgcgag gtctggcagc 120
cggagtaggc ctggctaatg cctgctatgc aatac 155
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aagtggaagc caccaccagt ttgtcacatc ttcaggtgct ggatttttct taccacaaca 120
tgacagtagt gtctggcata gaagattaaa gaatcaaaaa agtgccaagg aaggggtgac 180
agtgcttata aacgaagaca aagagttggc tgagctgcga ggtctggcag ccggagtagg 240
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atcaaagtat tacaagtctg gcatagaaga ttaaagaatc aaaaaagtgc caaggaaggg 120
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gtaggcctgg ctaatgcctg ctatgcaata c 211
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agctgccaag tacttggata aggaactggc aggaagtact cttccaaccc aagaggagat 120
tgaaaatctt cctgccttcc ctcgggaaaa actgactctg cgtctcttgc tgggaagtgg 180
agcctttgga gaagtgtatg aag 203
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Claims (10)

1.用于检测人类ROS1融合基因的核酸组，其特征在于，该核酸组包括以下S01～S12的12种ROS1融合基因变体类型的检测引物对的一组或多组：
S01：CD74:ROS1(C6:R32)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID NO.2所示；
S02：SDC4:ROS1(S2:R32)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID NO.2所示；
S03：SDC4:ROS1(S4:R32)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID NO.2所示；
S04：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.6和SEQ ID NO.2所示；
S05：SDC4:ROS1(S4:R34)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID NO.8所示；
S06：CD74:ROS1(C6:R34)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.10和SEQ ID NO.8所示；
S07：EZR:ROS1(E10:R34)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.11和SEQ ID NO.8所示；
S08：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.12和SEQ IDNO.8所示；
S09：TPM3:ROS1(T8:R35)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID NO.14所示；
S10：LRIG3:ROS1(L16:R35)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.16和SEQ IDNO.14所示；
S11：GOPC:ROS1(G8:R35)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.17和SEQ ID NO.14所示；
S12：GOPC:ROS1(G4:R36)的检测引物对：核苷酸序列如SEQ ID No.18和SEQ ID NO.19所示。
2.如权利要求1所述核酸组，其特征在于，还包括用于荧光RT-PCR检测时，各基因相应的如下检测探针：
S01：CD74:ROS1(C6:R32)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
S02：SDC4:ROS1(S2:R32)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
S03：SDC4:ROS1(S4:R32)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
S04：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
S05：SDC4:ROS1(S4:R34)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
S06：CD74:ROS1(C6:R34)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
S07：EZR:ROS1(E10:R34)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
S08：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
S09：TPM3:ROS1(T8:R35)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
S10：LRIG3:ROS1(L16:R35)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
S11：GOPC:ROS1(G8:R35)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
S12：GOPC:ROS1(G4:R36)的检测探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，上述检测探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
3.如权利要求2所述核酸组，其特征在于，还包括用于每组基因检测的内部质控，所述内部质控包括质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，所述质控探针的5’端标记有不同于所述检测探针的荧光基团，3’端标记淬灭基团。
4.如权利要求1-3中任一所述的核酸组，其特征在于，还包括S01～S12的12种ROS1融合基因变体类型中的一组或多组如下的阳性对照品：
S01：CD74:ROS1(C6:R32)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.24所示；
S02：SDC4:ROS1(S2:R32)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.25所示；
S03：SDC4:ROS1(S4:R32)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.26所示；
S04：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.27所示；
S05：SDC4:ROS1(S4:R34)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；
S06：CD74:ROS1(C6:R34)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.29所示；
S07：EZR:ROS1(E10:R34)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.30所示；
S08：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.31所示；
S09：TPM3:ROS1(T8:R35)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.32所示；
S10：LRIG3:ROS1(L16:R35)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；
S11：GOPC:ROS1(G8:R35)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.34所示；
S12：GOPC:ROS1(G4:R36)的阳性对照品：含有核苷酸序列如SEQ ID No.35所示。
5.一种用于检测人类ROS1融合基因的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如权利要求1-4中任一所述的核酸组。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于荧光RT-PCR检测，其中，所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒内包括：
不同基因类型的检测试剂：每一个ROS1融合基因变体的检测引物和检测探针在一个反应体系中，该基因类型的反应体系中还含有质控引物对和质控探针，以及PCR缓冲液，构成一管该基因类型的检测试剂；
一管含反转录酶和DNA聚合酶的酶试剂；
有阳性对照品的，还有一管阳性对照品混合液，阳性对照混合液内含与该试剂盒内所有检测引物基因类型相应的该种ROS1融合基因类型的阳性对照品。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括全部12种ROS1融合基因类型的检测引物对和检测探针，每种基因类型的检测引物和探针，连同质控引物对和质控探针以及PCR缓冲液独立包装在一管内。
9.如权利要求6-8任一所述试剂盒的使用方法，其特征在于，用于荧光RT-PCR检测，其中所述各基因的检测探针的5’端标记FAM，3’端标记MGB，所述质控探针的5’端标记JOE，3’端标记BHQ1使用方法是将待检样品提取的RNA，加入到各种ROS1融合基因类型的检测反应体系中，进行荧光定量PCR反应，收集反应信号，JOE信号应达到设定阈值Ct值小于26，检测结果有效，否则应重新检测；检测JOE信号满足Ct值小于26后，进行下列判断：
每种检测体系中FAM信号Ct值＞30或无Ct值，表明该样本阴性不存在ROS1融合基因；
其中某种检测体系中FAM信号Ct值≤30，表明该待检样品中含有该种类型的ROS1融合基因。
10.如权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的程序为：45℃反应5min，1个循环；95℃反应5min，1个循环；95℃反应30s，58℃反应45s，共10个循环；95℃反应15s，58℃反应45s，共35个循环，在58℃时收集信号。
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