CN105506140A - Ros1融合基因arms荧光定量pcr分型检测试剂盒 - Google Patents

Ros1融合基因arms荧光定量pcr分型检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105506140A
CN105506140A CN201610040902.7A CN201610040902A CN105506140A CN 105506140 A CN105506140 A CN 105506140A CN 201610040902 A CN201610040902 A CN 201610040902A CN 105506140 A CN105506140 A CN 105506140A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fusion gene
ros1 fusion
seqidno
fluorescent
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610040902.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105506140B (zh
Inventor
钟明
李香梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Dajian Medical Technology Co Ltd
Original Assignee
Anhui Dajian Medical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Dajian Medical Technology Co Ltd filed Critical Anhui Dajian Medical Technology Co Ltd
Priority to CN201610040902.7A priority Critical patent/CN105506140B/zh
Publication of CN105506140A publication Critical patent/CN105506140A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105506140B publication Critical patent/CN105506140B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种ROS1融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒，包括：用于检测ROS1融合基因变体的正向引物、共用反向引物和荧光探针；所述正向引物为SEQIDNO.1至SEQIDNO.10所示的十种单链DNA中的至少一种；所述共用反向引物为SEQIDNO.11至SEQIDNO.13所示的三种单链DNA中的至少一种；所述荧光探针为SEQIDNO.14至SEQIDNO.16所示的三种单链DNA中的至少一种。本发明还公开了ROS1融合基因变体的检测方法。本发明针对ROS1融合基因变体设计了特异性引物和荧光探针，提高了对ROS1融合基因变体检测的敏感性和特异性，假阳性低。

Description

ROS1融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种ROS1融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒，属于分子生物学检测技术领域。
背景技术
肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌、类癌等，NSCLC占所有肺癌病例的80-90％，每年新发肺癌病例约为150万，严重威胁人类健康。NSCLC的治疗包括手术、化疗、放疗、分子靶向治疗及生物免疫治疗等多种方法。手术治疗是NSCLC最佳治疗方法，但当NSCLC发现时，仅20-30％的病例有手术指征，且术后复发和转移率仍高达50％以上。分子靶向治疗以其符合生理、低毒和理论上高效的特点，越来越成为非小细胞肺癌治疗的热点。靶向治疗为肺癌的治疗增添了一个新的领域，也为肺癌的个体化治疗带来了新的希望。
未来肺腺癌的个体化治疗的趋势是先确定基因突变相关的分子分型。肺腺癌常见的基因变异有表皮生长因子受体(EGFR)、Kirsten鼠肉瘤病毒基因(K-ras)、原癌基因人类表皮生长因子受体2(HER2)、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)基因突变，棘皮动物微管相关类蛋白4(EML4)与间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因EML4-ALK、驱动蛋白家5B基因(KIF5B)与酪氨酸激酶受体(RET)融合基因KIF5B-RET，EGFR突变与EML4-ALK融合并存以及新发现的活性氧基团基因1(ROS1)的重排。不同的基因变异型患者存在不同的治疗靶点，临床治疗及疗效亦存在明显的个体差异性。就目前的研究而言，20％～30％的NSCLC患者存在ROSl的高表达，作为最新发现的肺癌驱动基因，对临床实践具有非常重要的指导意义。ROSl融合基因的发现及其抑制剂临床活性的证实，进一步推动了晚期NSCLC个体化治疗的发展。目前对于女性不吸烟的亚裔NSCLC患者而言，通过分子标志物检测，94％的患者可获知其肿瘤驱动基因的表达。而在不远的将来，随着这些不同的分子标志物检测手段的成熟，我们必将迎来NSCLC个体化治疗的全新突破。
活性氧基团基因1(reactiveoxygenspecies1，ROS1)是胰岛素受体家族的一种跨膜酪氨酸激酶，与禽流感肉瘤病毒UR2的v-ros序列具有同源性，因此被命名为ROS基因，之前也称为c-ros-1、mcf3基因。ROS1基因位于6q22染色体，含7368bp和43外显子，ROS1基因由一个酪氨酸激酶区域、一个跨膜区域和一个含N端糖基化位点的细胞外区域组成，编码具有酪氨酸激酶活性的Ⅰ型完整膜蛋白，其配体未知。ROS1基因发生重排时丢失细胞外区域，保留跨膜和细胞内酪氨酸激酶区域，重排位点主要发生在ROS1基因的32-36外显子。在NSCLC中ROS1基因主要与SLC34A2、CD74发生融合，CD74-ROSl融合：染色体5q32和6q22的易位导致了ROSl基因的大部分细胞外结构域编码区被CD74替代，CD74的6号外显子与ROSl的34号或是32号外显子结合形成新的CD74-ROSl融合基因，导致了跨膜受体CD74的N末端与ROSl结合形成融合蛋白；SLC34A2-ROSl融合：SLC34A2-ROSl融合基因在HCC78细胞株中首次被发现，SLC34A2和ROSl的结合位点与CD74-ROSl相似，ROSl的细胞外结构域被SLC34A2替代，并且同样保留了ROSl细胞内的酪氨酸激酶结构域。目前，可能导致肿瘤生长的基因组学改变包括基因突变、基因扩增、基因易位和基因序列内部串联，现今发现的ROSl融合基因融合类型主要有以下十种：Variant1(TPM3exon10/ROS1exon35)、Variant2(SDC4exon2/ROS1exon32)、Variant3(SDC4exon4/ROS1exon32)、Variant4(SDC4exon4/ROS1exon34)、Variant5(SLC34A2exon13/ROS1exon32,aninsertionatthepositionofnucleotide568ofSLC34A2exon13)、Variant6(CD74exon6/ROS1exon32)、Variant7(CD74exon6/ROS1exon34)、Variant8(EZRexon10/ROSexon34)、Variant9(LRIG3exon17/ROS1exon35)、Variant10(GOPCexon7/ROS1exon35)。注：“Variant”代表融合基因变体；“exon”代表外显子。
目前，ROS1融合基因的常用方法主要是荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybrid-ization，FISH)、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)、逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerisechainreaction，RT-PCR)。FISH已获美国食品与药品管理局(FDA)批准用于在NSCLC患者中检测ALK重排。FISH在检测未知融合型方面的优势是其他两种方法所不能及的，且特异性很高，但也存在检测成本高、检测结果难以判读、主观性强等劣势。IHC的检测成本较低，大部分医院的病理科都可以开展。但IHC检测取决于ROSl融合蛋白的表达量和相应抗体的特异性与敏感性，在未发现理想的抗体之前，IHC检测的准确性和重复性尚难保证。RT-PCR具有可以明确融合型、所需组织量极少等优点，但不能检测新的未知的融合型，在当前ROSl的融合型并未全部揭晓之前，使用其筛查ROSl融合可能遗漏未知的融合型，而且其对组织中RNA的质量有较高要求，若组织中的RNA降解严重，则可能影响最终的检测结果。
扩增阻碍突变系统(AmplificationRefractoryMutationSystem,ARMS)也称为等位基因特异性扩增法(Allele-specificamplification,ASA)或等位基因特性PCR(allele-specificPCR，ASPCR)，于1989年建立，是PCR技术应用的发展，用于对已知突变基因进行检测。ARMS的基本原理是PCR扩增时引物是否能延伸主要取决于引物3′端的1～2个碱基是否与模板配对，如果不配对则引物不能延伸，故只要能设计适当的引物，就可以区别正常和突变的DNA序列。该法首先设计两个5′端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3′端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3′端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。即在PCR扩增时，引物的延伸是从其3'未端开始的，而这种延伸的进行要求引物3'端的碱基与模板需完全配对，只有这样引物才能延伸，扩增才得以进行下去而得到预期的扩增产物，若引物3'端与模板不能配对，则引物的延伸即阻断，不能得到相对应的扩增产物。ARMS借鉴多重PCR原理，可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点。利用该系统进行基因突变检测时不仅能检出突变的纯合子，而且能检出杂合子个体，在这种情况下，同一个体的DNA模板利用突变引物和正常引物均能引发扩增反应，利用多对突变引物和正常引物进行多重3'特异PCR，可使DNA分子上的多位点突变的鉴定准确，快速，简便。
实时荧光定量PCR技术(real-timefluorescentquantitativePCR，FQ-PCR)于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，它是一种在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任一一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。
RT-ARMS-qPCR(realtime-amplificationrefractorymutationsystem-quantitativePCR)技术基于实时PCR平台，结合ARMS突变富集和qPCR特异性荧光检测两种技术对微量突变进行检测。利用ARMS引物对突变靶序列进行特异性PCR扩增，Taqman探针对扩增产物进行特异性微点检测，在实时PCR基础上鉴定特定突变。由于采用RT-ARMS-qPCR技术对微量突变进行检测时，对于所使用的引物和探针的特异性和扩增效率要求很高，因此，大大提高了引物和探针的设计难度。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种ROS1融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种基于RT-ARMS-qPCR检测ROS1融合基因变体的方法。
本发明中，所述ROS1融合基因变体主要包括：Variant1(TPM3exon10/ROS1exon35)、Variant2(SDC4exon2/ROS1exon32)、Variant3(SDC4exon4/ROS1exon32)、Variant4(SDC4exon4/ROS1exon34)、Variant5(SLC34A2exon13/ROS1exon32,aninsertionatthepositionofnucleotide568ofSLC34A2exon13)、Variant6(CD74exon6/ROS1exon32)、Variant7(CD74exon6/ROS1exon34)、Variant8(EZRexon10/ROSexon34)、Variant9(LRIG3exon17/ROS1exon35)、Variant10(GOPCexon7/ROS1exon35)十种融合基因变体。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种ROS1融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒，包括：用于检测ROS1融合基因变体的正向引物、共用反向引物和荧光探针；
所述正向引物为SEQIDNO.1至SEQIDNO.10所示的十种单链DNA中的至少一种；所述共用反向引物为SEQIDNO.11至SEQIDNO.13所示的三种单链DNA中的至少一种；所述荧光探针为SEQIDNO.14至SEQIDNO.16所示的三种单链DNA中的至少一种。
在上述试剂盒中，所述荧光探针的5′端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。
优选的，上述试剂盒中，包括：用于检测ROS1融合基因变体Variant1、Variant9和Variant10的三条正向引物、一条共用反向引物和一条荧光探针，其正向引物序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；共用反向引物序列如SEQIDNO.11所示；荧光探针序列如SEQIDNO.14所示；
用于检测ROS1融合基因变体Variant2、Variant3、Variant5和Variant6的四条正向引物、一条共用反向引物和一条荧光探针，其正向引物序列分别如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示；共用反向引物序列如SEQIDNO.12所示；荧光探针序列如SEQIDNO.15所示；
用于检测ROS1融合基因变体Variant4、Variant7、Variant8的三条正向引物、一条共用反向引物和一条荧光探针，其正向引物序列分别如SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；共用反向引物序列如SEQIDNO.13所示；荧光探针序列如SEQIDNO.16所示。
上述试剂盒中，还包括如下物质中的至少一种：阳性对照和荧光定量反应液预混液(PCRMasterMix)。
所述阳性对照为分别包含ROS1融合基因变体Variant1、Variant2、Variant3、Variant4、Variant5、Variant6、Variant7、Variant8、Variant9和Variant10基因组片断的DNA质粒。
作为一种具体的应用形式，上述试剂盒的组成包括：荧光定量反应预混液(PCRMasterMix)；荧光定量反应液A、荧光定量反应液B和荧光定量反应液C；以及阳性对照样品A、阳性对照样品B和阳性对照样品C。
所述荧光定量反应液A，包括上述用于检测ROS1融合基因变体Variant1、Variant9和Variant10的三条正向引物、一条共用反向引物和一条荧光探针；
所述荧光定量反应液B，包括上述用于检测ROS1融合基因变体Variant2、Variant3、Variant5和Variant6的四条正向引物、一条共用反向引物和一条荧光探针；
所述荧光定量反应液C，包括上述用于检测ROS1融合基因变体Variant4、Variant7、Variant8的三条正向引物、一条共用反向引物和一条荧光探针。
所述阳性对照样品A为包含所检测ROS1融合基因变体Variant1、Variant9、Variant10基因组片断的DNA质粒；
所述阳性对照样品B为包含所检测ROS1融合基因变体Variant2、Variant3、Variant5、Variant6基因组片断的DNA质粒；
所述阳性对照样品C为包含所检测ROS1融合基因变体Variant4、Variant7、Variant8基因组片断的DNA质粒。
制备所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。
该方法具体包括如下步骤：将荧光定量反应液A、荧光定量反应液B和荧光定量反应液C分别单独包装；将阳性对照样品A、阳性对照样品B和阳性对照样品C分别单独包装；然后与荧光定量反应预混液(PCRMasterMix)包装于同一试剂盒中。
上述试剂盒在制备检测或辅助检测ROS1融合基因变体的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明进一步提供利用上述试剂盒检测ROS1融合基因变体的方法，采用上述ARMS引物对待测样品的目的基因进行PCR扩增，利用Taqman探针对扩增产物进行特异性微点检测，根据PCR扩增后荧光信号的强弱对ROS1融合基因变体进行定性或定量检测。
上述方法，所述PCR扩增的条件为：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
本发明对ROS1融合基因变体检测的原理为：针对ROS1融合基因10种融合变体的保守序列特异设计TaqMan探针及引物；利用ARMS引物对突变靶序列进行特异性PCR扩增，Taqman探针对扩增产物进行特异性微点检测，在实时PCR基础上鉴定特定突变。本发明将ARMS-PCR扩增技术与实时荧光定量PCR技术相结合，在PCR扩增的同时加入一个特异性的荧光探针，实现了荧光信号累积与PCR产物形成完全同步，直接达到一个反应管内同时检测并区分多个融合突变型基因的目的。
本发明采用的TaqMan-MGB探针与传统的TaqMan-TAMRA探针相比较，MGB探针具有提高TM值，使探针的长度缩短，并且提高配对与非配对模板间的TM值差异；提高信噪比，使实验结果更精确，分辨率更高；更简化实验，MGB探针实验优化步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性大大提高等优势。
本发明提供的两端都标有荧光发光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，TaqDNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5′-3′外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次建立了ROS1融合基因变体的RT-ARMS-qPCR检测方法，利用此检测方法可以对待测样品中的ROS1融合基因变体进行定性或定量检测。
(2)检测灵敏度高，特异性好：本发明针对ROS1融合基因变体设计了特异性引物和荧光探针，提高了对ROS1融合基因变体检测的敏感性和特异性，假阳性低。
(3)线性关系好，可定量检测，由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量，误差小。
(4)操作简单，ARMS-qPCR技术对PCR产物的扩增和检测在闭管的情况下一步完成，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少，因此也就降低了结果偏差的几率。
(5)结果判读明确、直观，可对结果进行定量分析。荧光定量PCR法结果的判读：在域值线以上有扩增曲线的标本均为阳性标本，结果判读非常简单、直观。
(6)安全：整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害。
(7)没有后处理，不用杂交、电泳、拍照。
附图说明
图1：ROS1融合基因Variant1的ARMS-qPCR图；
图2：ROS1融合基因Variant1的测序结果图；
图3：ROS1融合基因Variant9的ARMS-qPCR图；
图4：ROS1融合基因Variant9的测序结果图；
图5：ROS1融合基因Variant10的ARMS-qPCR图；
图6：ROS1融合基因Variant10的测序结果图；
图7：ROS1融合基因Variant2的ARMS-qPCR图；
图8：ROS1融合基因Variant2的测序结果图；
图9：ROS1融合基因Variant3的ARMS-qPCR图；
图10：ROS1融合基因Variant3的测序结果图；
图11：ROS1融合基因Variant5的ARMS-qPCR图；
图12：ROS1融合基因Variant5的测序结果图；
图13：ROS1融合基因Variant6的ARMS-qPCR图；
图14：ROS1融合基因Variant6的测序结果图；
图15：ROS1融合基因Variant4的ARMS-qPCR图；
图16：ROS1融合基因Variant4的测序结果图；
图17：ROS1融合基因Variant7的ARMS-qPCR图；
图18：ROS1融合基因Variant7的测序结果图；
图19：ROS1融合基因Variant8的ARMS-qPCR图；
图20：ROS1融合基因Variant8的测序结果图。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：用于对ROS1融合基因变体RT-ARMS-qPCR检测的引物及探针的设计与筛选
1.ARMS引物设计
本发明在进行ARMS引物设计时，利用Taq酶缺乏3’-5’外切酶活性，当引物的3’端不能与模板完全配对，则PCR扩增不能进行。将引物的3’端设计为仅与突变模板匹配，而与正常模板不匹配，该引物只能扩增突变模板，而对正常模板不扩增，从而达到分型的目的。
本发明在常规ARMS引物的基础上，在距引物3’端第3个碱基处和第7个碱基处分别引入一个错配碱基，以增强引物的特异性，抑制非特异性扩增。
突变位点的位置对引物的特异性至关重要，一些突变位点不能阻遏引物对正常模板的扩增；或者由于过强的扩增抑制作用造成突变模板亦不能进行扩增。因此，要确保筛选的ARMS引物在一定的扩增系统中仅能扩增突变模板，而对正常模板不扩增。
本实施例经优化筛选设计了用于检测ROS1融合基因Variant1(TPM3exon10/ROS1exon35)、Variant9(LRIG3exon17/ROS1exon35)、Variant10(GOPCexon7/ROS1exon35)的3条正向引物和1条共用反向引物。其序列分别如下：
正向引物序列为：
Variant1-ForwardPrimer：5’-TTGATGACCTGGAAGTCTGGC-3’；(SEQIDNO.1)
Variant9-ForwardPrimer：5’-CTTACCACAACATGACAGTAGTGTCTG-3’；(SEQIDNO.2)
Variant10-ForwardPrimer：5’-TGGGGAAATCAAAGTATTACAAGTCTG-3’；(SEQIDNO.3)
共用反向引物序列为：
Variant1-ReversePrimer:5’-TTGGCTGAGCTGCGAGGT-3’；(SEQIDNO.11)
用于检测ROS1融合基因Variant2(SDC4exon2/ROS1exon32)、Variant3(SDC4exon4/ROS1exon32)、Variant5(SLC34A2exon13/ROS1exon32,aninsertionatthepositionofnucleotide568ofSLC34A2exon13)、Variant6(CD74exon6/ROS1exon32)的4条正向引物和1条共用反向引物。其序列分别如下：
正向引物序列为：
Variant2-ForwardPrimer：5’-GCTCTGGAGATCTGGCTGGA-3’；(SEQIDNO.4)
Variant3-ForwardPrimer：5’-GAGGTCCTGGCAGCTGGAG-3’；(SEQIDNO.5)
Variant5-ForwardPrimer：5’-CAGAGAGGCTCAGGCTGGAG-3’；(SEQIDNO.6)
Variant6-ForwardPrimer：5’-GCTCCACCGAAAGCTGGAG-3’；(SEQIDNO.7)
共用反向引物序列为：
Variant2-ReversePrimer:5’-AATTCAATACAGTGGGAGAAAGCTG-3’；(SEQIDNO.12)
用于检测ROS1融合基因Variant4(SDC4exon4/ROS1exon34)、Variant7(CD74exon6/ROS1exon34)、Variant8(EZRexon10/ROSexon34)的3条正向引物和1条共用反向引物。其序列分别如下：
正向引物序列为：
Variant4-ForwardPrimer：5’-CGGAGGTCCTGGCAGATG-3’；(SEQIDNO.8)
Variant7-ForwardPrimer：5’-CGCTCCACCGAAAGATGATT-3’；(SEQIDNO.9)
Variant8-ForwardPrimer：5’-GACAAAGAAGGCAGAGAGAGATGAT-3’；(SEQIDNO.10)
共用反向引物序列为：
Variant4-ReversePrimer:5’-GTGCCAAGGAAGGGGTGAC-3’；(SEQIDNO.13)
2.探针设计
在ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值为60℃-65℃，GC值为60％，并对探针的5’端和3’端进行荧光标记。
本实施例经优化筛选设计了用于检测ROS1融合基因Variant1(TPM3exon10/ROS1exon35)、Variant9(LRIG3exon17/ROS1exon35)、Variant10(GOPCexon7/ROS1exon35)的探针，其序列如下：
Variant1-Taqman-Probe:5’-FAM-AAGTGCCAAGGAAG-MGB-3’；(SEQIDNO.14)
用于检测ROS1融合基因Variant2(SDC4exon2/ROS1exon32)、Variant3(SDC4exon4/ROS1exon32)、Variant5(SLC34A2exon13/ROS1exon32,aninsertionatthepositionofnucleotide568ofSLC34A2exon13)、Variant6(CD74exon6/ROS1exon32)的探针，其序列如下：
Variant2-Taqman-Probe:5’-FAM-TCCCAAATAAACCAGGCAT-MGB-3’；(SEQIDNO.15)
用于检测ROS1融合基因Variant4(SDC4exon4/ROS1exon34)、Variant7(CD74exon6/ROS1exon34)、Variant8(EZRexon10/ROSexon34)的荧光探针，其序列如下：
Variant4-Taqman-Probe:5’-FAM-CCAGAAACAAGTTTCATACTTA-MGB-3’；(SEQIDNO.16)。
实施例2：用于ROS1融合基因变体RT-ARMS-qPCR检测的引物及探针的特异性考察
分别以含有ROS1融合基因Variant1、Variant2、Variant3、Variant4、Variant5、Variant6、Variant7、Variant8、Variant9和Variant10基因组片段的DNA质粒作为样品模板，分别采用实施例1筛选的引物及探针组合进行RT-ARMS-qPCR检测。
检测的反应体系为：引物、探针混合液1μL(浓度为5uM)，样品模板DNA2μL(100-300ng/μL)，2*TaqmanuniversalPCRMasterMix(购自美国应用生物公司)15μL，ddH2O7μL。
PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
结果为：用于检测ROS1融合基因Variant1的引物和探针组合(包含SEQIDNO.1所示的正向引物和SEQIDNO.11所示的反向引物和SEQIDNO.14所示的探针)仅能特异性扩增ROS1融合基因Variant1(在其所对应的检测孔出现扩增曲线)，而对于其他ROS1融合基因无扩增曲线。
同样的，用于检测ROS1融合基因Variant2-Variant10的引物和探针组合也仅能特异性扩增所对应检测的ROS1融合基因，对于其他ROS1融合基因无法进行扩增。
表明本发明实施例1筛选得到的引物及探针是经过严格的设计和验证的，具有高度的特异性。
对比例1：
ARMS引物的特异性对检测结果的准确性尤为重要，为提高准确性，需在ARMS引物的3’端引入错配。如果不引入错配，则容易出现分型错误的现象。
共用反向引物和探针序列不变，将用于检测ROS1融合基因Variant1的正向引物不人为引入错配，其引物序列如下：
5’-TTGATGACCTGGAACTCTCGC-3’。
以上述未人为引入错配的正向引物、共用反向引物和探针对上述10种ROS1融合基因进行检测，结果ROS1融合基因Variant1、ROS1融合基因Variant2和ROS1融合基因Variant4所对应的检测孔均出现了扩增曲线。上述结果说明：由于未人工引入错配碱基，使引物的特异性降低，容易导致分型错误。
对比例2：
在位点的排布过程中，需要根据序列特征及位点距离合理安排。如果设置不当，扩增序列中GC含量过高，容易形成二级结构或者容易产生非特异性扩增，影响检测的效率和准确度。
其他引物及组分均保持不变，将用于检测ROS1融合基因Variant2的正向引物改为：5’-GCTCTGGCCATCCGGCTGGA-3’，扩增产物会在250bp位置出现非特异性扩增。
实施例3：ROS1融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒
本发明的ROS1融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒包括各自独立包装的荧光定量反应预混液(PCRMasterMix)、荧光定量反应液A、荧光定量反应液B和荧光定量反应液C；以及阳性对照样品A、阳性对照样品B和阳性对照样品C，再共同组装在一外包装盒中。
其中，荧光定量反应液A，包括实施例1中筛选得到的用于检测ROS1融合基因变体Variant1、Variant9和Variant10的三条正向引物、一条共用反向引物和一条荧光探针；
荧光定量反应液B，包括实施例1中筛选得到的用于检测ROS1融合基因变体Variant2、Variant3、Variant5和Variant6的四条正向引物、一条共用反向引物和一条荧光探针；
荧光定量反应液C，包括实施例1中筛选得到的用于检测ROS1融合基因变体Variant4、Variant7、Variant8的三条正向引物、一条共用反向引物和一条荧光探针。
所述阳性对照样品A包含所检测ROS1融合基因变体Variant1、Variant9、Variant10基因组片断DNA质粒；
所述阳性对照样品B包含所检测ROS1融合基因变体Variant2、Variant3、Variant5、Variant6基因组片断DNA质粒；
所述阳性对照样品C包含所检测ROS1融合基因变体Variant4、Variant7、Variant8基因组片断DNA质粒。
上述阳性对照样品A、B和C中包含的所检测ROS1融合基因变体基因组片段DNA质粒，由宝生物工程(大连)有限公司合成。
实施例4：试剂盒的灵敏度检测
取含有ROS1融合基因变体Variant1基因组片断DNA质粒(宝生物工程(大连)有限公司合成)，进行梯度稀释，至浓度分别为102拷贝/微升、103拷贝/微升、104拷贝/微升、105拷贝/微升，作为样品。
然后采用实施例3的试剂盒在优化反应体系进行ARMS-qPCR的检测：反应体系为25μL，荧光定量反应液A(引物、探针混合液，浓度为5uM)1μL，样品模板DNA2μL(200ng/μL)，2*TaqmanuniversalPCRMasterMix(购自美国应用生物公司)15μL，ddH2O7μL。
PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
结果表明本发明的试剂盒可以准确检测ROS1融合基因变体，最低能够检测到100拷贝ROS1融合基因中5％的基因突变。
实施例5：10种不同ROS1融合基因变体的检测
所用阳性样本收集自中山大学附属肿瘤医院病理科临床病理诊断为ROS1基因融合的蜡块组织。从蜡块中提取基因组DNA供实验应用。
1.ROS1融合基因Variant1、Variant9和Variant10的检测
由于ROS1融合基因Variant1、Variant9和Variant10的重排位点均发生在ROS1基因的35外显子上，故对于ROS1融合基因Variant1、Variant9和Variant10的检测使用一个共用反向引物，共用一个反向引物可以减小复合扩增体系的复杂程度，避免非特异性扩增的可能性，提高扩增准确率，同时降低了生产成本。
(1)ROS1融合基因Variant1的检测
采用本发明实施例3的试剂盒中的荧光定量反应液A在优化的反应体系中进行ARMS-qPCR检测：反应体系为25μL，荧光定量反应液A(引物、探针混合液，浓度为5uM)1μL，样品模板DNA2μL(100-300ng/μL)，2*TaqmanuniversalPCRMasterMix(购自美国应用生物公司)15μL，ddH2O7μL。
PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
同时在荧光定量试验中，在检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性。
结果判定：
阴性结果判定标准：对应通道检测无扩增(不呈典型的S型曲线)或Ct值为>38；
阳性结果判定标准：对应通道检测有扩增(呈典型的S型曲线)且Ct值≤38。
结果：ROS1融合基因Variant1阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线图如图1所示，表明采用本发明的试剂盒能检测出ROS1融合基因Variant1。另外，将上述ROS1融合基因Variant1阳性样本进行测序验证，结果如图2所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的ROS1融合基因荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定ROS1融合基因突变情况。
图1中的水平线为“阈值线”，阈值设定方法为：使阈值线超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准，且Ct值为Undet。(CT值在1～15圈有曲线的突起，是背景荧光所引起，可忽略不计)。一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline，基线期)，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍(机器自动设置)。
(2)ROS1融合基因Variant9的检测
采用本发明实施例3的试剂盒中的荧光定量反应液A在优化的反应体系中进行ARMS-qPCR检测，反应体系和PCR反应条件同ROS1融合基因Variant1的检测。
结果：ROS1融合基因Variant9阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线图如图3所示，表明采用本发明的试剂盒能检测出ROS1融合基因Variant9。另外，将上述ROS1融合基因Variant9阳性样本进行测序验证，结果如图4所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。
(3)ROS1融合基因Variant10的检测
采用本发明实施例3的试剂盒中的荧光定量反应液A在优化的反应体系中进行ARMS-qPCR检测，反应体系和PCR反应条件同ROS1融合基因Variant1的检测。
结果：ROS1融合基因Variant10阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线图如图5所示，表明采用本发明的试剂盒能检测出ROS1融合基因Variant10。另外，将上述ROS1融合基因Variant10阳性样本进行测序验证，结果如图6所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。
2.ROS1融合基因Variant2、Variant3、Variant5和Variant6的检测
(1)ROS1融合基因Variant2的检测
采用本发明实施例3的试剂盒中的荧光定量反应液B在优化的反应体系中进行ARMS-qPCR检测：反应体系为25μL，荧光定量反应液B(引物、探针混合液，浓度为5uM)1μL，样品模板DNA2μL(100-300ng/μL)，2*TaqmanuniversalPCRMasterMix(购自美国应用生物公司)15μL，ddH2O7μL。
PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
同时在荧光定量试验中，在检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性。
结果：ROS1融合基因Variant2阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线图如图7所示，表明采用本发明的试剂盒能检测出ROS1融合基因Variant2。另外，将上述ROS1融合基因Variant2阳性样本进行测序验证，结果如图8所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。
(2)ROS1融合基因Variant3的检测
采用本发明实施例3的试剂盒中的荧光定量反应液B在优化的反应体系中进行ARMS-qPCR检测，反应体系和PCR反应条件同ROS1融合基因Variant2的检测。
结果：ROS1融合基因Variant3阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线图如图9所示，表明采用本发明的试剂盒能检测出ROS1融合基因Variant3。另外，将上述ROS1融合基因Variant3阳性样本进行测序验证，结果如图10所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。
(3)ROS1融合基因Variant5的检测
采用本发明实施例3的试剂盒中的荧光定量反应液B在优化的反应体系中进行ARMS-qPCR检测，反应体系和PCR反应条件同ROS1融合基因Variant2的检测。
结果：ROS1融合基因Variant5阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线图如图11所示，表明采用本发明的试剂盒能检测出ROS1融合基因Variant5。另外，将上述ROS1融合基因Variant5阳性样本进行测序验证，结果如图12所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。
(4)ROS1融合基因Variant6的检测
采用本发明实施例3的试剂盒中的荧光定量反应液B在优化的反应体系中进行ARMS-qPCR检测，反应体系和PCR反应条件同ROS1融合基因Variant2的检测。
结果：ROS1融合基因Variant6阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线图如图13所示，表明采用本发明的试剂盒能检测出ROS1融合基因Variant6。另外，将上述ROS1融合基因Variant6阳性样本进行测序验证，结果如图14所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。
3.ROS1融合基因Variant4、Variant7和Variant8的检测
(1)ROS1融合基因Variant4的检测
采用本发明实施例3的试剂盒中的荧光定量反应液C在优化的反应体系中进行ARMS-qPCR检测：反应体系为25μL，荧光定量反应液C(引物、探针混合液，浓度为5uM)1μL，样品模板DNA2μL(100-300ng/μL)，2*TaqmanuniversalPCRMasterMix(购自美国应用生物公司)15μL，ddH2O7μL。
PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
同时在荧光定量试验中，在检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性。
结果：ROS1融合基因Variant4阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线图如图15所示，表明采用本发明的试剂盒能检测出ROS1融合基因Variant4。另外，将上述ROS1融合基因Variant4阳性样本进行测序验证，结果如图16所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。
(2)ROS1融合基因Variant7的检测
采用本发明实施例3的试剂盒中的荧光定量反应液C在优化的反应体系中进行ARMS-qPCR检测，反应体系和PCR反应条件同ROS1融合基因Variant4的检测。
结果：ROS1融合基因Variant7阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线图如图17所示，表明采用本发明的试剂盒能检测出ROS1融合基因Variant7。另外，将上述ROS1融合基因Variant7阳性样本进行测序验证，结果如图18所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。
(3)ROS1融合基因Variant8的检测
采用本发明实施例3的试剂盒中的荧光定量反应液C在优化的反应体系中进行ARMS-qPCR检测，反应体系和PCR反应条件同ROS1融合基因Variant4的检测。
结果：ROS1融合基因Variant8阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线图如图19所示，表明采用本发明的试剂盒能检测出ROS1融合基因Variant8。另外，将上述ROS1融合基因Variant8阳性样本进行测序验证，结果如图20所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因融合，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。
实施例6：临床样本检测
在检测者知情同意的情况下，检测口腔拭子样本，各样本均获自中山大学附属肿瘤医院，样本数量为152例，采用本发明实施例3的试剂盒进行检测，检测方法为：将提取的样本DNA在3个PCR反应管内分别采用试剂盒中的荧光定量反应液A、荧光定量反应液B和荧光定量反应液C同时进行检测。PCR反应条件：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
检测结果表明，所检测的152例样本中有6例发生了ROS1融合基因突变。
作为对比，所有样本同时采用专利CN104830989A中提供的检测试剂盒和检测方法进行检测，结果表明ROS1融合基因突变有4例，经测序证明，上述未检测出的样本为阳性样本。
所有的样本均经过直接测序检测验证，结果与采用本发明的试剂盒的分型检测结果完全一致，说明本发明的试剂盒及其检测方法准确、有效，特异性强，检测结果无假阳性和假阴性。
本发明试剂盒可在两小时内完成检测盒出具检测报告，包括样本DNA的提取需要1小时左右，荧光定量PCR的检测1小时左右。

Claims (10)

1.一种ROS1融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒，其特征在于，包括：用于检测ROS1融合基因变体的正向引物、共用反向引物和荧光探针；
所述正向引物为SEQIDNO.1至SEQIDNO.10所示的十种单链DNA中的至少一种；所述共用反向引物为SEQIDNO.11至SEQIDNO.13所示的三种单链DNA中的至少一种；所述荧光探针为SEQIDNO.14至SEQIDNO.16所示的三种单链DNA中的至少一种。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针的5′端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，包括：用于检测ROS1融合基因变体Variant1、Variant9和Variant10的正向引物、共用反向引物和荧光探针，其正向引物序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；共用反向引物序列如SEQIDNO.11所示；荧光探针序列如SEQIDNO.14所示；
用于检测ROS1融合基因变体Variant2、Variant3、Variant5和Variant6的正向引物、共用反向引物和荧光探针，其正向引物序列分别如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示；共用反向引物序列如SEQIDNO.12所示；荧光探针序列如SEQIDNO.15所示；
用于检测ROS1融合基因变体Variant4、Variant7和Variant8的正向引物、共用反向引物和荧光探针，其正向引物序列分别如SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；共用反向引物序列如SEQIDNO.13所示；荧光探针序列如SEQIDNO.16所示。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中，还包括如下物质中的至少一种：阳性对照和荧光定量反应液预混液。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为分别包含ROS1融合基因变体Variant1、Variant2、Variant3、Variant4、Variant5、Variant6、Variant7、Variant8、Variant9和Variant10基因组片断的DNA质粒。
6.制备权利要求4或5所述试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤：将用于检测ROS1融合基因变体Variant1、Variant9和Variant10的正向引物、共用反向引物和荧光探针的混合液作为荧光定量反应液A；将用于检测ROS1融合基因变体Variant2、Variant3、Variant5和Variant6的正向引物、共用反向引物和荧光探针的混合液作为荧光定量反应液B；将用于检测ROS1融合基因变体Variant4、Variant7和Variant8的正向引物、共用反向引物和荧光探针的混合液作为荧光定量反应液C；分别单独包装；
将分别包含ROS1融合基因变体Variant1、Variant9和Variant10基因组片断的DNA质粒作为阳性对照样品A；将分别包含ROS1融合基因变体Variant2、Variant3、Variant5和Variant6基因组片断的DNA质粒作为阳性对照样品B；将分别包含ROS1融合基因变体Variant4、Variant7和Variant8基因组片断的DNA质粒作为阳性对照样品C；分别单独包装；
然后与荧光定量反应液预混液包装于同一试剂盒中。
7.权利要求1-5任一项所述的试剂盒在制备检测或辅助检测ROS1融合基因变体的产品中的应用。
8.一种非诊断目的检测ROS1融合基因变体的方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述试剂盒中的引物对待测样品的目的基因进行PCR扩增，利用试剂盒中的荧光探针对扩增产物进行特异性微点检测，根据PCR扩增后荧光信号的强弱对ROS1融合基因变体进行定性或定量检测。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：95℃预变性30秒；按95℃15秒，62℃20秒，扩增反应20个循环；再按95℃15秒，60℃34秒，扩增反应40个循环。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，25μL的PCR反应体系中，荧光定量反应液A、荧光定量反应液B或荧光定量反应液C1μL，样品模板DNA2μL，2*PCRMasterMix15μL，ddH2O7μL。
CN201610040902.7A 2016-01-20 2016-01-20 Ros1融合基因arms荧光定量pcr分型检测试剂盒 Active CN105506140B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610040902.7A CN105506140B (zh) 2016-01-20 2016-01-20 Ros1融合基因arms荧光定量pcr分型检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610040902.7A CN105506140B (zh) 2016-01-20 2016-01-20 Ros1融合基因arms荧光定量pcr分型检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105506140A true CN105506140A (zh) 2016-04-20
CN105506140B CN105506140B (zh) 2019-01-15

Family

ID=55714430

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610040902.7A Active CN105506140B (zh) 2016-01-20 2016-01-20 Ros1融合基因arms荧光定量pcr分型检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105506140B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636376A (zh) * 2016-12-05 2017-05-10 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测人类ros1融合基因的核酸、试剂盒及方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031978A (zh) * 2013-03-06 2014-09-10 北京宏微特斯生物科技有限公司 一种基于arms荧光定量pcr检测基因突变的试剂盒和方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031978A (zh) * 2013-03-06 2014-09-10 北京宏微特斯生物科技有限公司 一种基于arms荧光定量pcr检测基因突变的试剂盒和方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KENGO TAKEUCHI ET AL: "RET，ROS1 and ALK fusions in lung cancer", 《NATURE MEDICINE》 *
KURTIS D. DAVIES: "Molecular pathway:ROS1 fusion protein in cancer.", 《CLINICAL》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636376A (zh) * 2016-12-05 2017-05-10 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测人类ros1融合基因的核酸、试剂盒及方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105506140B (zh) 2019-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Anderson et al. Multisite analytic performance studies of a real-time polymerase chain reaction assay for the detection of BRAF V600E mutations in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens of malignant melanoma
Jung et al. Liquid biopsy in tumor genetic diagnosis
CN103468813B (zh) Eml4-alk融合基因荧光定量pcr检测试剂盒
CN108048531B (zh) 一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量pcr方法
Khoo et al. Molecular methods for somatic mutation testing in lung adenocarcinoma: EGFR and beyond
CN108949990B (zh) 一种检测egfr基因突变的试剂盒及方法
Luk et al. BRAF mutations in non-small cell lung cancer
Okamoto et al. Multiplex genomic profiling of non–small cell lung cancers from the LETS phase III trial of first-line S-1/carboplatin versus paclitaxel/carboplatin: Results of a west Japan oncology group study
CN104099422A (zh) 一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物及其使用方法
CN104017887A (zh) 人类braf基因突变检测引物对和探针及其试剂盒
Zhang et al. Targeted next-generation sequencing in cytology specimens for molecular profiling of lung adenocarcinoma
Sorber et al. NTRK gene fusion detection in a pan-cancer setting using the Idylla GeneFusion assay
CN104774963A (zh) 检测pik3ca基因突变的试剂盒及其检测方法
CN105506138A (zh) Ret融合基因arms荧光定量pcr分型检测试剂盒
CN104480215B (zh) 一种基因联合检测方法及试剂盒
US11261482B2 (en) Composition for detecting epidermal cell growth factor receptor gene mutation, and kit comprising same
Qi et al. Blood digital polymerase chain reaction as a potential method to detect human epidermal growth factor receptor 2 amplification in non-small cell lung cancer
CN107354197B (zh) 一种检测人类nras基因突变的试剂盒
CN105506140A (zh) Ros1融合基因arms荧光定量pcr分型检测试剂盒
US9914975B2 (en) EGFR blood monitoring
CN102851368A (zh) 一种pik3ca基因突变荧光定量pcr分型检测试剂盒及其检测方法
Lüsebrink et al. Pre-clinical validation of a next generation sequencing testing panel
CN102660641B (zh) 一种基于热稳定性内切酶检测基因突变和snp位点的试剂盒及方法
JP2023507796A (ja) がん特異的無細胞ｄｎａを同定するための異なるフラグメントサイズを使用したマルチプレックスアッセイ
Mäki-Nevala et al. Concordant results of epidermal growth factor receptor mutation detection by real-time polymerase chain reaction and ion torrent technology in non-small cell lung cancer

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant