BR122023026077A2 - Métodos para detecção de pelo menos uma mutação em uma pluralidade de genes relacionados ao câncer, selecionar um indivíduo para tratamento e prever a probabilidade de capacidade de resposta ao tratamento - Google Patents

Métodos para detecção de pelo menos uma mutação em uma pluralidade de genes relacionados ao câncer, selecionar um indivíduo para tratamento e prever a probabilidade de capacidade de resposta ao tratamento Download PDF

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Abstract

MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE PELO MENOS UMA MUTAÇÃO EM UMA PLURALIDADE DE GENES RELACIONADOS AO CÂNCER, SELECIONAR UM INDIVÍDUO PARA TRATAMENTO E PREVER A PROBABILIDADE DE CAPACIDADE DE RESPOSTA AO TRATAMENTO A presente tecnologia se refere a métodos para determinar se um paciente diagnosticado com câncer de mama, câncer colorretal, melanoma ou câncer de pulmão se beneficiarão de ou é esperado que seja responsivo ao tratamento com um agente terapêutico individual ou uma combinação específica de agentes terapêuticos. Estes métodos se baseiam em fazer triagem de tumores sólidos do paciente e detectar alterações nas sequências de ácido nucleico alvo correspondendo a um conjunto específico de genes relacionados ao câncer. Também são providos kits para uso na prática dos métodos.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício da prioridade ao pedido U.S. 62/166.996, depositado em 27 de maio de 2015, e ao pedido U.S. 62/246.895, depositado em 27 de outubro de 2015, cujos conteúdos são aqui incorporados pela referência na sua íntegra.
CAMPO TÉCNICO
[002] A presente tecnologia se refere aos métodos para determinar se um paciente diagnosticado com câncer de mama, câncer colorretal, melanoma ou câncer de pulmão se beneficiará ou é previsto para ser responsivo ao tratamento com um agente terapêutico sozinho ou em uma combinação específica com outros agentes terapêuticos. Estes métodos são baseados em selecionar tumores sólidos do paciente e detectar alterações em sequências alvo de ácido nucleico que correspondem a um conjunto específico de genes relacionados ao câncer. Kits para uso na realização dos métodos também são fornecidos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[003] A descrição a seguir dos fundamentos da presente tecnologia é fornecida simplesmente como um auxílio no entendimento da presente tecnologia e não é admitida para descrever ou constituir a técnica anterior à presente tecnologia.
[004] O desenvolvimento de diagnósticos complementares apresenta o potencial para melhorar os resultados do paciente, e eliminar a necessidade de seguradoras pagarem por terapias caras e ineficientes. Como o número de genes implicado no câncer continua a crescer, torna-se evidente que uma caracterização cuidadosa das alterações genéticas que definem os tumores do paciente individual será frequentemente usada para determinar estratégias terapêuticas ideais. Por exemplo, Foundation Medicine® oferece um painel de triagem de tumor sólido em grande escala que questiona a sequência codificante completa de mais de 300 genes relacionados ao câncer e 28 rearranjos de gene usando bibliotecas de isca de DNA ou RNA (por exemplo, FoundationOne®). Tais ensaios exigem uma inserção de DNA no tumor de pelo menos 50 ng. Entretanto, a quantidade de DNA disponível para tais estudos abrangentes é frequentemente limitada e de qualidade inferior, em decorrência de o DNA do tumor ser isolado de tecidos embebidos em parafina e fixados com formalina (FFPE). O processo FFPE frequentemente degrada DNA em pequenos fragmentos e apresenta o potencial ao dano aos próprios pares de base de DNA.
[005] Tumor TruSight™ (Illumina, Inc.) é um exemplo de um painel de triagem de tumor NGS a base de PCR existente que questiona um conjunto mais estreito de genes relacionados ao câncer (174 amplicons em 26 genes) e exige uma inserção de DNA mínima de 30 ng. Entretanto, este método exige uma avaliação da qualidade de DNA genômico extraído da amostra do tumor FFPE por meio da PCR quantitativa antes de gerar uma biblioteca a base de amplicon em decorrência de nem a área do tecido nem o rendimento de DNA serem indicadores adequados de desempenho de biblioteca. Vide folha de dados do tumor TruSight™ (Illumina, Inc.); Generating Sequencing Libraries from FFPE Samples, White Paper (Illumina, Inc.).
[006] Detectar alterações genéticas úteis em tecidos FFPE é adicionalmente complicado pelo fato de que células em uma amostra de tumor podem exibir um alto grau de variação molecular entre tumores (heterogeneidade entre-tumor) e no próprio tumor individual (heterogeneidade intra-tumor). A heterogeneidade do tumor foi observada em leucemias, melanomas, carcinomas de mama, próstata, cólon, pulmão e ginecológicos. Dessa maneira, a fração pequena de células em uma biópsia pode não ser representativa da massa completa do tumor, que pode levar a resultados falso-negativos para uma dada alteração genética.
[007] A heterogeneidade intra-tumor também pode explicar, pelo menos em parte, porque alguns pacientes que respondem bem inicialmente a uma droga contra o câncer eventualmente têm recaída, frequentemente com novos tumores que não respondem mais à terapia. Quanto maior a diversidade de células em um tumor, maior o risco de uma célula ter que ser capaz de se adaptar ao tipo de estresse imposto pela droga. A resistência adquirida às drogas contra câncer pode se desenvolver por meio de uma variedade de mecanismos (Chong C. & Janne P., Nat. Med. 19: 1389-1400 (2013); Katayama et al., Sci. Transl. Med. 4(120): 120ra17 (2012)). Por exemplo, células resistentes podem desenvolver uma via de sinalização compensatória, ou “faixa de desvio”, que restabelece a ativação da proliferação chave à jusante e sinais de sobrevivência, apesar da inibição do oncogene original (Niederst & Engelman, Sci. Signal. 6: re6 (2013)). Assim, a heterogeneidade de células de câncer introduz desafios significantes em determinar estratégias de tratamento eficiente, especialmente quando uma mutação específica de gene não é detectada na biópsia.
[008] Assim, existe uma necessidade substancial de métodos mais resistentes e sensíveis que detectam eficientemente a presença de alterações genéticas em amostras de tumores muito heterogêneas, particularmente em tecidos FFPE. Tais métodos podem auxiliar na previsão da capacidade de resposta de cada paciente a um regime de droga particular, e na identificação de estratégias terapêuticas ideais no início.
SUMÁRIO DA PRESENTE TECNOLOGIA
[009] Os métodos e composições aqui descritos se referem à detecção de mutações que são preditivas da capacidade de resposta de um indivíduo diagnosticado com câncer de mama, câncer colorretal, melanoma, ou câncer de pulmão a um regime terapêutico particular. Em um outro aspecto, os métodos e composições da presente tecnologia são usados na seleção ou determinação de um regime terapêutico ideal para um indivíduo diagnosticado com câncer de mama, câncer colorretal, melanoma, ou câncer de pulmão. É previsto que os métodos aqui descritos permitem a detecção rápida e sensível de mutações nas sequências alvo de ácido nucleico de AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN. Em algumas modalidades, o regime terapêutico compreende uma ou mais das terapias anti-HER-2, inibidores de trajeto PI3K/AKT/mTor, inibidores do receptor de tirosina quinase (TKIs), inibidores de trajeto Notch, inibidores de BRAF, antagonistas de SMO, inibidores de ALK/MET, antagonistas de ERBB2, antagonistas de FGFR3, e inibidores de RAF/MEK/ERK.
[0010] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para detectar pelo menos uma mutação em uma pluralidade de genes relacionados ao câncer em um indivíduo compreendendo (a) extrair DNA genômico de uma amostra de tumor embebida em parafina fixada em formalina obtida do indivíduo; (b) gerar uma biblioteca compreendendo amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer, a dita pluralidade de genes relacionados ao câncer compreendendo AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN, em que (i) gerar a dita biblioteca ocorre sem o uso de um conjunto de isca compreendendo sequências de ácido nucleico que são complementares a pelo menos uma da pluralidade de amplicons; e (ii) a qualidade do DNA genômico extraído da amostra de tumor embebida em parafina fixada em formalina não é avaliada usando PCR quantitativa antes de gerar a biblioteca; (c) ligar uma sequência adaptadora às extremidades da pluralidade de amplicons; e (d) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons usando sequenciamento paralelo de alto rendimento maciço.
[0011] Em algumas modalidades do método, a pluralidade de amplicons é gerada por pelo menos dois pares de iniciador descritos na tabela 1, tabela 2, ou uma combinação dos mesmos.
[0012] Em algumas modalidades do método, a pelo menos uma mutação detectada é uma mutação em EGFR, KRAS, BRAF, NRAS, ERBB2 ou PIK3CA. Em uma modalidade, a pelo menos uma mutação detectada é selecionada do grupo que consiste em BRAF V600E, BRAF V600K, BRAF K483Q, BRAF G466V, BRAF G464V, BRAF E501V, BRAF E501K, EGFR ΔE746_A750, EGFR R680Q, EGFR G598E, KRAS A146T, KRAS R68M, KRAS L19F, KRAS G12V, KRAS G12D, KRAS G12C, KRAS G13D, KRAS G13C, KRAS G12A, KRAS G12S, KRAS Q22K, NRAS Q61K, NRAS Q61R, NRAS G12R, NRAS G12D, PIK3CA C420R, PIK3CA G106R, PIK3CA R38H, PIK3CA E453K, PIK3CA H1044R, PIK3CA N1044K, PIK3CA E545K, PIK3CA Q546H, PIK3CA H1047R, PIK3CA H1043L, PIK3CA M1043V, PIK3CA E542K, PIK3CA E542Q, PIK3CA T1053A, PIK3CA I121V, PIK3CA H1047L, ERBB2 L755S, ERBB2 S310Y, ERBB2 D769Y, ERBB2 S255R, DDR2 H92Y, DDR2 R31L, DDR2 L34P, DDR2 P381R e DDR2 K392N.
[0013] Em algumas modalidades do método, a biblioteca compreendendo amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer é gerada usando não mais que 10 ng de DNA genômico extraído da amostra de tumor embebida em parafina fixada em formalina.
[0014] Em algumas modalidades do método, a biblioteca compreendendo amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer é gerada usando 11-25 ng de DNA genômico extraído da amostra de tumor embebida em parafina fixada em formalina.
[0015] Em certas modalidades, o sequenciamento paralelo de alto rendimento maciço é realizado usando pirossequenciamento, sequenciamento de terminador de corante reversível, sequenciamento SOLiD, sequenciamento semicondutor de íon, sequenciamento de molécula única de Helioscope, sequenciamento por síntese, sequenciamento por ligação, ou sequenciamento SMRT™.
[0016] Em algumas modalidades do método, a sequência adaptadora é um adaptador P5, adaptador P7, adaptador P1, adaptador A, ou adaptador de código de barras Ion Xpress™.
[0017] Adicionalmente ou alternativamente, em algumas modalidades, a pluralidade de amplicons compreende adicionalmente uma sequência única de índice.
[0018] Em algumas modalidades, a amostra de tumor embebida em parafina fixada em formalina é um tumor heterogêneo. Em certas modalidades, 5% das células do tumor heterogêneo abrigam pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons.
[0019] Em algumas modalidades do método, o indivíduo foi diagnosticado com câncer de mama, melanoma, câncer colorretal ou câncer de pulmão.
[0020] Em um outro aspecto, a presente descrição fornece um método para selecionar um indivíduo para tratamento com um inibidor de trajeto PI3K/AKT/mTor e pelo menos um agente adicional compreendendo (a) extrair DNA genômico de um espécime embebido em parafina fixada em formalina, obtido a partir do indivíduo; (b) gerar uma biblioteca compreendendo amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer, a dita pluralidade de genes relacionados ao câncer compreendendo AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN, em que (i) gerar a dita biblioteca ocorre sem o uso de um conjunto de isca compreendendo sequências de ácido nucleico que são complementares a pelo menos uma da pluralidade de amplicons, e (ii) a qualidade do DNA genômico extraído do espécime embebido em parafina fixada em formalina não é avaliada usando PCR quantitativa antes de gerar a biblioteca; (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons; e (d) selecionar o indivíduo para tratamento com um inibidor de trajeto PI3K/AKT/mTor e pelo menos um agente adicional, se uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem axPIK3CA, PIK3R1 e PTEN, e uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem to NOTCH1, ERBB2, BRAF, PTCH1, SMO, EGFR, KRAS, DDR2, MAP2K1, FGFR3, NRAS, MET, e FBXW7 forem detectados.
[0021] Em algumas modalidades do método, os amplicons que correspondem a PIK3CA são gerados por um par de iniciadores selecionados do grupo que consiste em 5’ CCTAGTAGAATGTTTACTACCAA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ CTGCTTCTTGAGTAACACTT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ CATGTTCATGCTGTGTATGT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GCTTCTTTACAAACGTTCAGAA 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TCTATGTTCGAACAGGTATCT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ ACTGCTAAACACTAATATAACCTTTG 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TTGAAATGTGTTTTATAATTTAGACTAGT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ CCATGAGGTACTGGCC 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TTGGTGTTACTGGATCAAATC 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ TGCTGAACCAGTCAAACT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TATTATTTTATTTTACAGAGTAACAGACTAG 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ TTTAGCACTTACCTGTGACT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TGGAATGCCAGAACTACA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GTGGAAGATCCAATCCATTTT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ GGAATGAATGGCTGAATTATG 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GCGGTATAATCAGGAGTTTT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ AGTTGGCCTGAATCACTATA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GATGTTACTATTGTGACGATCTC 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ GTAAGTGTTACTCAAGAAGC 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ ATAGGATATTGTATCATACCAATTTCT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TCCACAGCTACACCATATAT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ AGCATCAGCATTTGACTTTA 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TACACAGACACTCTAGTATCTG 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GAAGGTTTGACTGCCATAAA 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ ATGACAAAGAACAGCTCAAA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GAGATCAGCCAAATTCAGTT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ GATGTGTTACAAGGCTTATCTA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GCCTCTTGCTCAGTTTTATC 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ GAGGCTTTGGAGTATTTCA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ CTGCTGAGAGTTATTAACAGT 3’ (SEQ ID NO.:__); e 5’ GCTTTTGGAGTCCTATTGT 3’ (SEQ CACAAACTAGAGTCACACAC 3’ (SEQ ID NO. ID :__). NO.:__) e 5’
[0022] Em algumas modalidades do método, os amplicons que correspondem a PIK3R1 são gerados por um par de iniciadores selecionados do grupo que consiste em 5’ GGGTTTTGGGCTGATATTA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ CCACAGAACTGAAGGTTAAT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TTATCCATTGAATTTATTTTAATCTTTCTAG 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GGGATGTGCGGGTATATT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ GTCTTGCAGTAAGAGATTGT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ TCTTTGCTGTACCGCT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ GTTTCTTTTGCCTGCA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ TGGATAAGGTCTGGTTTAATG 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ GCTACAATTCAGGATGAGTTA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ TCTTCTGCTATCACCATCTTT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ CCATCATGATGAGAAGACAT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ TTGCTGGAGATACATACACT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ GTGGTCACTAAACCTTAAGA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GGCTTACCTTAGTGTAAGAG 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TTTCATCGAGATGGGAAATATG 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ ACCTGTTGGTATTTGGATACT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ AGAAGATAATATTGAAGCTGTAGG 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ AGAACTCTTATTTTTTAATCTGATTTTCA 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ GGACAGCTATTGAAGCATTTA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ CACAAGAACAAGGGAAACAC 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ GCAGGCAGCTGAGTATC 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ TCATCCTGAATTGTAGCAATCA 3’ (SEQ ID NO.:__).
[0023] Em algumas modalidades do método, os amplicons que correspondem a PTEN são gerados por um par de iniciadores selecionados do grupo que consiste em 5’ CAGCTTCTGCCATCTCT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ AGCAGCCGCAGAAAT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ GTGGCTTTTTGTTTGTTTG 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ CACTCTAACAAGCAGATAACT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TACTTGTTAATTAAAAATTCAAGAGTTTT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ CTTAGCCATTGGTCAAGATC 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ ACAATCATGTTGCAGCA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ AAAAACATCAAAAAATAACTTACCTTTT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ AGAGGCGCTATGTGTATTA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ CATGGAAGGATGAGAATTTCA 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ GGAAGACAAGTTCATGTACT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ CTGTCCTTATTTTGGATATTTCTC 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ ATTAATTAAATATGTCATTTCATTTCTTTTTC 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GCTATCGATTTCTTGATCACA 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TGAGTCATATTTGTGGGTTTTC 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ TGATCAGGTTCATTGTCACTAA 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TTTGATTGCTGCATATTTCAG 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ TCAAAGCATTCTTACCTTACTAC 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TTTTAAACTTTTCTTTTAGTTGTGC 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ ACTCGATAATCTGGATGACT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ CAATTTAGTGAAATAACTATAATGGAAC 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ AGTGCCACTGGTCTATAAT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ CCTGTGAAATAATACTGGTATGT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ CTACTTTGATATCACCACACAC 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TAGAGCGTGCAGATAATGA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ TCAACAACCCCCACAAA 3’ (SEQ ID NO.:__); e 5’ CTTTCTCTAGGTGAAGCTGTA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GGTTCATTCTCTGGATCAGA 3’ (SEQ ID NO.:__).
[0024] Em algumas modalidades do método, o espécime embebido em parafina fixada em formalina é um tumor heterogêneo. Em certas modalidades, 5%-10% das células do tumor heterogêneo abrigam pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons. Em outras modalidades, pelo menos 10% das células do tumor heterogêneo abrigam pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons.
[0025] Em algumas modalidades do método, o inibidor de trajeto PI3K/AKT/mTor é selecionado do grupo que consiste em BKM120, BEZ235, Pictilisib (GDC-0941), LY294002, CAL-101 (Idelalisib), GNE-317, PI-3065, HS-173, PI-103, NU7441, GSK2636771, VS-5584, CZC24832, Duvelisib, TG100-115, A66, YM201636, CAY10505, GSK1059615, PF-04691502, PIK-75, PIK-93, AS-605240, BGT226, AZD6482, Voxtalisib, Alpelisib, CUDC-907, IC-87114, Omipalisib, TG100713, Gedatolisib, CH5132799, PKI-402, BAY 80-6946, TGX-221, XL147, PIK-90, PIK-293, PIK-294, 3- Metiladenina, Quercetina, Wortmannina, ZSTK474, AS-252424, AS-604850, everolimus, e Apitolisib.
[0026] Em uma modalidade particular, o indivíduo é diagnosticado como tendo câncer de mama HER-2 negativo. Em algumas modalidades do método, o pelo menos um agente adicional é selecionado do grupo que consiste em inibidores de trajeto Notch, inibidores de BRAF, antagonistas de SMO, inibidores de MET, e antagonistas de ERBB2. Em certas modalidades, os inibidores de trajeto de Notch são selecionados do grupo que consiste em FLI-06, LY411575, Dibenzazepine, RO4929097, Composto E, Z-Leu-Leu- Nle-CHO, SAHM1, TR4 e Semagacestat. Em algumas modalidades, os antagonistas de SMO são selecionados do grupo que consiste em Purmorphamine, Taladegib (LY2940680), Ciclopamina, Vismodegib (GDC- 0449), LDE225, Glasdegib (PF-04449913), PF-5274857, TAK-441, SANT-1, BMS-833923, GANT61 e IPI-926.
[0027] Em algumas modalidades, os antagonistas de ERBB2 são selecionados do grupo que consiste em Lapatinib, Canertinib, CP-724,714, AZD8931, AEE788, Tyrphostin AG 879, Mubritinib, e Pertuzumab. Em certas modalidades, os inibidores de BRAF são selecionados do grupo que consiste em GDC-0879, SB590885, Encorafenib, RAF265, TAK-632, PLX4720, CEP-32496, AZ628, Sorafenib Tosylate, Sorafenib, Vemurafenib (Zelboraf) e Dabrafenib (GSK2118436).
[0028] Em algumas modalidades do método, o indivíduo é diagnosticado como tendo câncer colorretal. Em uma modalidade adicional, o pelo menos um agente adicional é selecionado do grupo que consiste em inibidores de trajeto de Notch, antagonistas de FGFR3, e inibidores de RAF/MEK/ERK. Em certas modalidades, os inibidores de RAF/MEK/ERK são selecionados do grupo que consiste em Vemurafenib (Zelboraf) e Dabrafenib (GSK2118436), Encorafenib, TAK-632, PLX4720, MLN2480, Cobimetinib (GDC-0973), MEK 162, RO5126766, GDC-0623, VTX11e, Selumetinib (AZD6244), PD0325901, Trametinib (GSK1120212), U0126-EtOH, PD184352 (CI-1040), Refametinib, PD98059, BIX02189, Binimetinib, Pimasertib (AS-703026), SL327, BIX02188, AZD8330, TAK-733, PD318088, SCH772984, e FR 180204.
[0029] Em algumas modalidades, os inibidores de trajeto de Notch são selecionados do grupo que consiste em FLI-06, LY411575, Dibenzazepine, RO4929097, Composto E, Z-Leu-Leu-Nle-CHO, SAHM1, TR4 e Semagacestat. Em certas modalidades, os antagonistas de FGFR3 são selecionados do grupo que consiste em BGJ398 (NVP-BGJ398), AZD4547, LY2874455, ácido dilático Dovitinib, Dovitinib, Dovitinib Lactato, CH5183284, e Nintedanib.
[0030] Em uma modalidade particular, uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a BRAF, MAP2K1 e NRAS e uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a FGFR3 e SMO são detectadas. Em uma modalidade adicional, o indivíduo é diagnosticado como tendo melanoma. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente adicional são inibidores de RAF/MEK/ERK, antagonistas de FGFR3, antagonistas de SMO ou uma combinação dos mesmos.
[0031] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para prever a probabilidade de ausência de resposta de capacidade ao tratamento com uma terapia anti-HER-2 em um indivíduo HER-2 positivo diagnosticado como tendo câncer de mama compreendendo: (a) extrair DNA genômico de um espécime embebido em parafina fixada em formalina obtido do indivíduo HER-2 positivo; (b) gerar uma biblioteca compreendendo os amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer, a dita pluralidade de genes relacionados ao câncer compreendendo AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN, em que (i) gerar a dita biblioteca procede independentemente do uso de um conjunto de isca compreendendo sequências de ácido nucleico, que são complementares a pelo menos uma da pluralidade de amplicons, e (ii) a qualidade do DNA genômico extraído do espécime embebido em parafina fixada em formalina não é avaliada usando PCR quantitativa antes de gerar a biblioteca; (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons; e (d) identificar o indivíduo HER-2 positivo como tendo uma probabilidade de ausência de resposta de capacidade ao tratamento com uma terapia anti-HER-2, quando uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a PIK3CA, PIK3R1 e PTEN é detectada. Em algumas modalidades do método, a terapia anti-HER-2 é trastuzumab ou lapatinib.
[0032] Em algumas modalidades do método, os amplicons que correspondem a PIK3CA são gerados por um par de iniciadores selecionados do grupo que consiste em 5’ CCTAGTAGAATGTTTACTACCAA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ CTGCTTCTTGAGTAACACTT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ CATGTTCATGCTGTGTATGT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GCTTCTTTACAAACGTTCAGAA 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TCTATGTTCGAACAGGTATCT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ ACTGCTAAACACTAATATAACCTTTG 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TTGAAATGTGTTTTATAATTTAGACTAGT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ CCATGAGGTACTGGCC 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TTGGTGTTACTGGATCAAATC 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ TGCTGAACCAGTCAAACT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TATTATTTTATTTTACAGAGTAACAGACTAG 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ TTTAGCACTTACCTGTGACT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ TGGAATGCCAGAACTACA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GTGGAAGATCCAATCCATTTT 3’ (SEQ ID NO.:__); 5’ GGAATGAATGGCTGAATTATG 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GCGGTATAATCAGGAGTTTT 3’ (SEQ ID NO.:__ ); 5’ AGTTGGCCTGAATCACTATA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GATGTTACTATTGTGACGATCTC 3’ (SEQ ID NO.:_ _); 5’ GTAAGTGTTACTCAAGAAGC 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ ATAGGATATTGTATCATACCAATTTCT 3’ (SEQ ID NO. :__); 5’ TCCACAGCTACACCATATAT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ AGCATCAGCATTTGACTTTA 3’ (SEQ ID NO.:__ ); 5’ TACACAGACACTCTAGTATCTG 3 ’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GAAGGTTTGACTGCCATAAA 3’ (SEQ ID NO.:_ ); 5’ ATGACAAAGAACAGCTCAAA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GAGATCAGCCAAATTCAGTT 3’ (SEQ ID NO.:_ ); 5’ GATGTGTTACAAGGCTTATCTA 3 ’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ GCCTCTTGCTCAGTTTTATC 3’ (SEQ ID NO.:__ ); 5’ GAGGCTTTGGAGTATTTCA 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ CTGCTGAGAGTTATTAACAGT 3’ (SEQ ID NO.:__); e 5’ GCTTTTGGAGTCCTATTGT 3’ (SEQ ID NO.:__) e 5’ CACAAACTAGAGTCACACAC 3’ (SEQ ID NO.:__).
[0033] Em certas modalidades, o indivíduo HER-2 positivo é tratado com trastuzumab emtansina, quando uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a PIK3CA, PIK3R1 e PTEN é detectada.
[0034] Em algumas modalidades, o estado de HER-2 positivo do indivíduo é ensaiado por imuno-histoquímica (IHC) ou hibridização fluorescente in situ (FISH).
[0035] Em um outro aspecto, a presente descrição fornece um método para selecionar um indivíduo para tratamento com um inibidor de EGFR tirosina quinase e pelo menos um agente adicional compreendendo: (a) extrair DNA genômico de um espécime embebido em parafina fixada em formalina, obtido a partir do indivíduo; (b) gerar uma biblioteca compreendendo os amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer, a dita pluralidade de genes relacionados ao câncer compreendendo AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN, em que (i) gerar a dita biblioteca procede independentemente do uso de um conjunto de isca compreendendo sequências de ácido nucleico, que são complementares a pelo menos uma da pluralidade de amplicons, e (ii) a qualidade do DNA genômico extraído do espécime embebido em parafina fixada em formalina não é avaliada usando PCR quantitativa antes de gerar a biblioteca; (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons; e (d) selecionar o indivíduo para tratamento com um inibidor de EGFR tirosina quinase e pelo menos um agente adicional, se uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a EGFR, e uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a KRAS, PIK3R1 e BRAF forem detectadas.
[0036] Em algumas modalidades do método, o espécime embebido em parafina fixada em formalina é um tumor heterogêneo. Em algumas modalidades, 5%-10% das células do tumor heterogêneo abrigam pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons. Em outras modalidades, pelo menos 10% das células do tumor heterogêneo abrigam pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons.
[0037] Em certas modalidades, o inibidor de EGFR tirosina quinase é gefitinib ou erlotinib.
[0038] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para prever a probabilidade de capacidade de resposta ao tratamento com vemurafenib em um indivíduo diagnosticado como tendo melanoma compreendendo: (a) extrair DNA genômico de um espécime embebido em parafina fixada em formalina, obtido a partir do indivíduo; (b) gerar uma biblioteca compreendendo os amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer, a dita pluralidade de genes relacionados ao câncer compreendendo AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN, em que (i) gerar a dita biblioteca procede independentemente do uso de um conjunto de isca compreendendo sequências de ácido nucleico, que são complementares a pelo menos uma da pluralidade de amplicons, e (ii) a qualidade do DNA genômico extraído do espécime embebido em parafina fixada em formalina não é avaliada usando PCR quantitativa antes de gerar a biblioteca; (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons; e (d) identificar o indivíduo como tendo pelo menos um de uma alta probabilidade de capacidade de resposta ao tratamento com vemurafenib quando uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a BRAF é detectada, e uma baixa probabilidade de capacidade de resposta ao tratamento com vemurafenib quando uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a NRAS é detectada.
[0039] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para prever a probabilidade de capacidade de resposta ao tratamento com terapia anti-EGFR em um indivíduo diagnosticado como tendo câncer colorretal compreendendo: (a) extrair DNA genômico de um espécime embebido em parafina fixada em formalina, obtido a partir do indivíduo; (b) gerar uma biblioteca compreendendo os amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer, a dita pluralidade de genes relacionados ao câncer compreendendo AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN, em que (i) gerar a dita biblioteca procede independentemente do uso de um conjunto de isca compreendendo sequências de ácido nucleico, que são complementares a pelo menos uma da pluralidade de amplicons, e (ii) a qualidade do DNA genômico extraído do espécime embebido em parafina fixada em formalina não é avaliada usando PCR quantitativa antes de gerar a biblioteca; (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons; e (d) identificar o indivíduo como tendo uma baixa probabilidade de capacidade de resposta ao tratamento com terapia anti- EGFR quando uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a KRAS, BRAF, NRAS, PIK3CA, e PTEN é detectada.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
[0040] A figura 1 mostra as características clínicas dos 121 pacientes que forneceram as amostras de tumor que foram analisadas no presente estudo.
[0041] A figura 2 mostra os resultados dos experimentos de precisão inter-ensaio com espécimes de FFPE que abrigam variantes BRAF G466Y, TP53 R175H, DDR2 L34P, EGFR E865G, EGFR E866V, TP53 R248W, Notch Q2406Δ, e TP53 A159_M160insRA.
[0042] A figura 3 mostra os resultados dos experimentos de precisão inter-ensaio com linhagens celulares que abrigam variantes EGFR ΔE746_A750, EGFR L858R, e AKT1 E17K.
[0043] A figura 4 é um diagrama de Venn que resume os genes mutados detectados pelo ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia, de acordo com o tipo de tumor: câncer de pulmão, câncer colorretal, melanoma, e câncer de mama. Genes que foram mutados em vários tipos de tumor são representados em suas respectivas regiões de sobreposição onde possível.
[0044] A figura 5 mostra o percentual de amostras de FFPE por tipo de tumor que abriga mutações múltiplas de co-ocorrência (da maneira detectada pelo painel de triagem de tumor sólido da presente tecnologia). Nenhuma amostra de tumor abrigou > 5 mutações de co-ocorrência.
[0045] A figura 6 mostra as mutações detectadas pelo painel de triagem de tumor sólido da presente tecnologia para cada espécime individual (colunas) para (a) todos os tipos de tumor, (B) melanoma, (C) câncer colorretal, (D) câncer de pulmão, e (E) câncer de mama. O número total de espécimes testados para um dado tipo de tumor também é mostrado. O número de espécimes que abrigam mutações no gene representado por uma dada fileira é fornecido para cada painel (marcado nos eixos geométricos direitos para todos os painéis). Os espécimes que abrigam 2 mutações no mesmo gene também são mostrados. Os resultados de laboratório clínico para cada espécime são indicados pela legenda da figura.
[0046] A figura 7 mostra o perfil molecular de 28 amostras de tumor de câncer de mama que foram inicialmente triadas pela expressão de ER, PR e HER-2.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0047] A presente descrição fornece métodos para determinar se um paciente diagnosticado com câncer de mama, câncer colorretal, melanoma ou câncer de pulmão se beneficiará ou é previsto para ser responsivo ao tratamento com um único agente terapêutico ou uma combinação específica de agentes terapêuticos. Estes métodos são baseados em selecionar um tumor sólido do paciente e detectar alterações em sequências alvo de ácido nucleico que correspondem a um conjunto específico de genes relacionados ao câncer usando um ensaio a base de PCR por sequenciamento de nova geração muito sensível (NGS). Kits para uso na realização dos métodos também são fornecidos.
[0048] Traçar o perfil molecular de tumores está se tornando cada vez mais importante no controle de câncer avançado. NGS é amplamente usado em pesquisa sobre câncer e tem se tornado uma tecnologia de diagnóstico atraente em laboratórios clínicos, em decorrência de sua capacidade de detectar variantes múltiplos em um único ensaio.
[0049] Os espécimes de FFPE são integrais ao diagnóstico de praticamente todos os casos suspeitos de câncer, e as estimadas milhões de amostras arquivadas podem fornecer uma riqueza de informação molecular em relação à progressão e tratamento da doença. Embora técnicas de FFPE sejam o padrão para proteger tecidos por análise molecular à jusante e facilitar o arquivamento, o armazenamento de tecidos em solução de formaldeído resulta em reticulação extensiva de proteínas em outras proteínas e em ácidos nucleicos, e em fragmentação de ácido nucleico. A técnica de FFPE pode resultar na desnaturação parcial do DNA e pode causar dano aos próprios pares de base de DNA, comprometendo por meio disso a precisão de ensaios de NGS. Além do mais, a quantidade de tecido tumor disponível para biópsia é frequentemente limitada. Estes desafios são exacerbados adicionalmente pela extensão da heterogeneidade molecular observada em amostras de tumor, que torna a detecção de alterações genéticas úteis em tecidos de FFPE muito difícil.
[0050] Assim, a quantidade limitada de DNA de alta qualidade obtida de amostra do tumor FFPEs desincentiva o uso de painéis de triagem de tumor sólido em grande escala que exigem grandes quantidades de entrada de DNA (por exemplo, 50 ng para o painel FoundationOne® que pesquisa a sequência codificante completa de mais de 300 genes relacionados ao câncer e 28 rearranjos de gene, Foundation Medicine®). Além disso, a análise de genes relacionados ao câncer que são comumente associados com variações hematológicas (por exemplo, ABL1) são menos prováveis de fornecer orientação em estratégias de tratamento alvejado para tumores sólidos geneticamente heterogêneos. Dessa maneira, existe uma necessidade de painéis de triagem de tumor sólido mais focados, que forneçam informação precisa e clinicamente relevante em tumores sólidos heterogêneos, mas que sejam econômicos em termos de seu uso de DNA de entrada das amostras de FFPE.
[0051] Um objetivo da presente tecnologia foi desenvolver um painel de perfil de tumor sólido muito sensível, que pode detectar simultaneamente uma ampla faixa de mutações em exons ou gene regiões especificamente alvejados, de um conjunto pré-selecionado de genes relacionados ao câncer que são atualmente, ou são prováveis de se tornar, terapeuticamente viáveis em tumores sólidos. Em algumas modalidades, os tumores sólidos se manifestam em pacientes diagnosticados como tendo melanoma, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de tireoide, tumores estromais gastrointestinais, etc.
[0052] A presente descrição fornece métodos para detectar mutações genéticas viáveis em um conjunto específico de genes relacionados ao câncer em tumores sólidos (derivados de tecidos de FFPE), que são perdidos pelos métodos de sequenciamento de Sanger tradicionais. Em um aspecto, os métodos da presente tecnologia são usados pra detectar alterações genéticas em um conjunto específico de genes relacionados ao câncer em amostras de tumores muito heterogêneas. Adicionalmente, os métodos aqui descritos são menos trabalhosos, exigem menos inserção de DNA dos espécimes de FFPE, e fornecem conhecimentos adicionais em como vias de sinalização diferentes são impactadas em uma amostra de tumor particular (por exemplo, um tumor heterogêneo) comparado a outros ensaios de triagem de tumor a base de PCR NGS existentes. Em particular, os métodos da presente tecnologia triam mutações em regiões alvo específicas em 34 genes pré-selecionados relacionados ao câncer, que por sua vez fornecem uma visão geral do perfil molecular de uma amostra do tumor FFPE (por exemplo, um tumor heterogêneo), sem avaliação prévia da qualidade do DNA genômico extraído da amostra do tumor FFPE.
[0053] Os métodos aqui descritos são usados em: (a) prever a capacidade de resposta de um indivíduo diagnosticado com câncer de mama, câncer colorretal, melanoma ou câncer de pulmão a um agente terapêutico particular, e (b) selecionar estratégias ideais de tratamento para o indivíduo à luz da natureza do tumor de cada indivíduo. Dessa maneira, a degradação de DNA/desnaturação parcial de DNA durante o processo FFPE e heterogeneidade do tumor não parecem influenciar a sensibilidade do ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia.
Definições
[0054] Da maneira aqui usada, o termo “cerca de” em relação a um número é em geral utilizado para incluir números que estão em uma faixa de 1%-5% em qualquer direção (maior que ou menor que) do número, a menos que de outra forma declarada ou de outra forma evidente a partir do contexto.
[0055] Da maneira aqui usada, os termos “amplificar” ou “amplificação” com relação às sequências de ácido nucleico, se referem aos métodos que aumentam a representação de uma população de sequências de ácido nucleico em uma amostra. Os métodos de amplificação de ácido nucleico, tais como PCR, métodos isotérmicos, métodos de círculo rolante, etc., são bem conhecidos pelos versados na técnica. Cópias de uma sequência de ácido nucleico particular geradas in vitro em uma reação de amplificação são denominadas “amplicons” ou “produtos de amplificação”.
[0056] Da maneira aqui usada, o termo “alterações genéticas úteis” se refere a mutações que são associadas a (1) tratamento com uma droga aprovada pela FDA, (2) um tratamento com droga auxiliado por diretriz, (3) uma indicação diretriz de sensibilidade ou resistência a um tratamento particular, (4) testes clínicos em andamento, (5) dados clínicos que auxiliam uma indicação de resistência ou sensibilidade ao tratamento com a droga, (6) dados pré-clínicos que mostram forte evidência de resistência ou sensibilidade a um tratamento alvejado, ou (6) uma implicação prognóstica que pode orientar as decisões de tratamento do profissional médico.
[0057] O termo “adaptador” se refere a uma sequência de ácido nucleico curta, sintetizada quimicamente que pode ser usada para se ligar à extremidade de uma sequência de ácido nucleico, a fim de facilitar a anexação a uma outra molécula. O adaptador pode ser de fita simples ou fita dupla. Um adaptador pode incorporar uma sequência curta (tipicamente menor que 50 pares de base) usada para amplificação por PCR ou sequenciamento.
[0058] Da maneira aqui usada, uma “alteração” de um gene ou produto de gene (por exemplo, um gene marcador ou produto de gene) se refere à presença de uma mutação ou mutações no gene ou produto de gene, por exemplo, uma mutação que afeta a quantidade ou atividade do gene ou produto de gene, comparado ao gene normal ou tipo selvagem. A alteração genética pode resultar em alterações na quantidade, estrutura, e/ou atividade do gene ou produto de gene em um tecido de câncer ou célula de câncer, comparado à sua quantidade, estrutura e/ou atividade em um tecido ou célula normal ou saudável (por exemplo, um controle). Por exemplo, uma alteração que está associada ao câncer, ou preditiva da capacidade de resposta aos agentes terapêuticos anticâncer, pode apresentar uma sequência alterada de nucleotídeo (por exemplo, uma mutação), sequência de aminoácido, translocação cromossomal, inversão intra-cromossômica, número de cópias, nível de expressão, nível de proteína, atividade de proteína, em um tecido de câncer ou célula de câncer, comparado a um tecido ou célula saudável normal. As mutações exemplares incluem, mas sem limitação, mutações pontuais (por exemplo, silenciosa, sentido trocado, ou sem sentido), eliminações, inserções, inversões, mutações de ligação, duplicações, translocações, rearranjos inter e intra-cromossômicos. As mutações podem estar presentes na região codificante e não codificante do gene. Em certas modalidades, as alterações são associadas a um fenótipo, por exemplo, um fenótipo canceroso (por exemplo, um ou mais de risco de câncer, progressão do câncer, tratamento de câncer ou resistência ao tratamento de câncer). Em uma modalidade, a alteração está associada a um ou mais de: um fator de risco genético para o câncer, um preditor de resposta ao tratamento positivo, um preditor de resposta ao tratamento negativo, um fator de prognóstico positivo, um fator de prognóstico negativo, ou um fator diagnóstico.
[0059] “Isca”, da maneira aqui usada, é um tipo de reagente de captura híbrido que recupera sequências alvo de ácido nucleico por sequenciamento. Uma isca pode ser uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, uma molécula de DNA ou RNA, que pode hibridizar (por exemplo, ser complementar a), e permite por meio disso a captura de um ácido nucleico alvo. Em uma modalidade, uma isca é uma molécula de RNA (por exemplo, um molécula de ocorrência natural ou de RNA modificado); uma molécula de DNA (por exemplo, uma molécula de ocorrência natural ou de DNA modificada), ou uma combinação dos mesmos. Em outras modalidades, uma isca inclui uma entidade de ligação, por exemplo, uma marcação de afinidade, que permite a captura e separação, por exemplo, se ligando a uma entidade de ligação, de um híbrido formado por uma isca e um ácido nucleico hibridizado na isca. Em uma modalidade, uma isca é adequada para hibridização em fase de solução.
[0060] Da maneira aqui usada, “conjunto de isca” se refere a uma ou uma pluralidade de moléculas de isca.
[0061] Os termos “câncer” ou “tumor” são usados indiferentemente e se referem à presença de células que possuem características típicas de células que causam câncer, tais como proliferação não controlada, imortalidade, potencial metastático, crescimento rápido e taxa de proliferação, e certas aspectos morfológicos característicos. Células de câncer são frequentemente na forma de um tumor, mas tais células podem existir sozinhas em um animal, ou podem ser uma célula de câncer não tumorigênica. Da maneira aqui usada, o termo “câncer” inclui cânceres pré-malignos, bem como malignos.
[0062] Os termos “complementar” ou “complementaridade” da maneira aqui usada com referência aos polinucleotídeos (isto é, uma sequência de nucleotídeos tal como um oligonucleotídeo ou um ácido nucleico alvo) se referem às regras de pareamento de base. O complemento de uma sequência de ácido nucleico da maneira aqui usada se refere a um oligonucleotídeo que, quando alinhado com a sequência de ácido nucleico de modo que a extremidade 5' de uma sequência seja pareada com a extremidade 3’ da outra, está em “associação antiparalelo”. Por exemplo, a sequência “5'- A-G-T-3’” é complementar à sequência “3’-T-C-A-5.” Certas bases não encontradas comumente em ácidos nucleicos de ocorrência natural podem ser incluídas nos ácidos nucleicos aqui descritos. Estas incluem, por exemplo, inosina, 7-deazaguanina, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), e ácidos nucleicos peptídicos (PNA). A complementaridade não precisa ser perfeita; duplexos estáveis podem conter pares de bases incompatíveis, degenerativos, ou bases incomparáveis. Os versados na tecnologia de ácido nucleico podem determinar a estabilidade de duplex empiricamente, considerando inúmeras variáveis incluindo, por exemplo, o tamanho do oligonucleotídeo, composição da base e sequência do oligonucleotídeo, concentração iônica e incidência de pares de bases incompatíveis. Uma sequência complementar também pode ser uma sequência de RNA complementar à sequência de DNA, ou sua sequência complementar, e também pode ser um DNAc.
[0063] Da maneira aqui usada, um "controle" é uma amostra alternativa usada em um experimento com propósito de comparação. Um controle pode ser "positivo" ou "negativo." Uma “amostra de ácido nucleico controle” ou “amostra de ácido nucleico de referência”, da maneira aqui usada, se refere a moléculas de ácido nucleico de uma amostra controle ou de referência. Em certas modalidades, a amostra de ácido nucleico de referência ou controle é uma sequência de DNA ou RNA tipo selvagem ou uma não mutada. Em certas modalidades, a amostra de ácido nucleico de referência é purificada ou isolada (por exemplo, é removida de sua condição natural). Em outras modalidades, a amostra de ácido nucleico de referência é de uma amostra não relacionada a tumor, por exemplo, um controle de sangue, um tumor adjacente normal (NAT), ou qualquer outra amostra não cancerosa do mesmo indivíduo ou diferente.
[0064] “Eliminar”, da maneira aqui usada, se refere a determinar a presença de uma mutação ou alteração em um ácido nucleico de interesse em uma amostra. A detecção não exige o método para fornecer 100% de sensibilidade.
[0065] “Gene”, da maneira aqui usada, se refere a uma sequência de DNA que compreende sequências regulatórias e codificantes necessárias para a produção de um RNA, que podem apresentar uma função não codificante (por exemplo, um RNA ribossomal ou de transferência) ou que podem incluir um polipeptídeo ou um precursor de polipeptídeo. O RNA ou polipeptídeo pode ser codificado por uma sequência codificante de tamanho completo ou por qualquer porção da sequência codificante, contanto que a atividade ou função desejada seja mantida. Embora uma sequência dos ácidos nucleicos possa ser mostrada na forma de DNA, os versados na técnica reconhecerão que a sequência de RNA correspondente apresentará uma sequência similar com a timina sendo substituída por uracila, isto é, "T" é substituída por "U."
[0066] O termo “tumor heterogêneo” da maneira aqui usada se refere a um tumor que compreende subpopulações de células com variações moleculares distintas (por exemplo, subclones com genótipos variados). Em algumas modalidades, as células de tumor heterogêneo também podem exibir perfis fenotípicos distintos, incluindo diferenças em morfologia celular, expressão de gene, metabolismo, motilidade, proliferação e potencial metastático. Em algumas modalidades, o grau de heterogeneidade em um tumor pode depender do tecido no qual o tumor se manifesta.
[0067] O termo “hibridiza” da maneira aqui usada se refere a um processo onde duas fitas de ácido nucleico substancialmente complementares (pelo menos cerca de 65% complementar em um intervalo de pelo menos 14 a 25 nucleotídeos, pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 90% complementar) anelam uma na outra em condições adequadamente exigentes para formar um duplex ou heteroduplex por meio da formação de ligações de hidrogênio entre pares de base complementares. As hibridizações são tipicamente e preferivelmente conduzidas com moléculas de ácido nucleico com tamanho de sonda, preferivelmente 15-100 nucleotídeos em tamanho, mais preferivelmente 18-50 nucleotídeos em tamanho. As técnicas de hibridização de ácido nucleico são bem conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Abriga Press, Plainview, N.Y. A hibridização e a intensidade de hibridização (isto é, a intensidade da associação entre os ácidos nucleicos) são influenciadas por tais fatores, como o grau de complementaridade entre os ácidos nucleicos, exigência das condições envolvidas, e o ponto de fusão térmica (Tm) do híbrido formado. Os versados na técnica entendem como estimar e ajustar a exigência das condições de hibridização, de maneira tal que as sequências que apresentam pelo menos um nível desejado de complementaridade hibridizará de maneira estável, enquanto aquelas que apresentam menor complementaridade não hibridizarão. Para exemplos de condições e parâmetros de hibridização, vide, por exemplo, Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Abriga Press, Plainview, N.Y.; Ausubel, F. M. et al. 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N.J. Em algumas modalidades, a hibridização específica ocorre em condições de hibridização exigentes. Um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo (por exemplo, uma sonda ou um iniciador) que é específico para um ácido nucleico alvo poderá “hibridizar” no ácido nucleico alvo em condições adequadas.
[0068] Da maneira aqui usada, os termos “individual”, “paciente” ou “indivíduo” são usados indiferentemente e se referem a um único organismo, um vertebrado, um mamífero, ou um humano. Em uma modalidade preferida, o paciente ou indivíduo único é um humano.
[0069] Da maneira aqui usada, o termo “biblioteca” se refere a uma coleção de sequências de ácido nucleico, por exemplo, uma coleção de ácidos nucleicos derivados de fragmentos genômicos completos, subgenômicos, DNAc, fragmentos de DNAc, RNA, fragmentos de RNA ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, uma porção ou todas as sequências de ácido nucleico da biblioteca compreendem uma sequência adaptadora. A sequência adaptadora pode estar localizada em uma ou ambas as extremidades. A sequência adaptadora pode ser usada, por exemplo, para um método de sequenciamento (por exemplo, um método NGS), para amplificação, para transcrição reversa, ou para clonagem em um vetor.
[0070] A biblioteca pode compreender uma coleção de sequências de ácido nucleico, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de tumor), uma sequência de ácido nucleico de referência, ou uma combinação dos mesmos). Em algumas modalidades, as sequências de ácido nucleico da biblioteca podem ser derivadas de um único indivíduo. Em outras modalidades, uma biblioteca pode compreender sequências de ácido nucleico de mais de um indivíduo (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 ou mais sujeitos). Em algumas modalidades, duas ou mais bibliotecas de diferentes sujeitos podem ser combinadas para formar uma biblioteca com sequências de ácido nucleico de mais de um indivíduo. Em uma modalidade, o indivíduo humano apresenta, ou está risco de apresentar, um câncer ou tumor.
[0071] Uma “sequência de ácido nucleico da biblioteca” se refere a uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, um DNA, RNA, ou uma combinação dos mesmos, que é um elemento de uma biblioteca. Tipicamente, uma sequência de ácido nucleico da biblioteca é uma molécula de DNA, por exemplo, DNA genômico ou DNAc. Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico da biblioteca é fragmentada, por exemplo, DNA genômico cisalhado ou preparada enzimaticamente. Em certas modalidades, as sequências de ácido nucleico da biblioteca compreendem sequência de um indivíduo e sequência não derivada do indivíduo, por exemplo, sequência adaptadora, uma sequência iniciadora, ou outras sequências que pemitem a identificação, por exemplo, sequências em “código de barra”.
[0072] O termo “PCR multiplex” da maneira aqui usada se refere à amplificação de dois ou mais produtos de PCR ou amplicons que são cada qual preparados usando um par de iniciador distinto.
[0073] “Sequenciamento de nova geração ou NGS”, da maneira aqui usada, se refere a qualquer método de sequenciamento que determina a sequência de nucleotídeo de cada molécula individual de ácidos nucleicos (por exemplo, em sequenciamento de molécula única) ou representantes expandidos clonalmente para moléculas individuais de ácido nucleico, em uma maneira paralela de alto rendimento (por exemplo, mais de 103, 104, 105 ou mais moléculas são sequenciadas simultaneamente). Em uma modalidade, a abundância relativa das espécies de ácido nucleico na biblioteca pode ser estimada contando o número relativo de ocorrências de suas sequências relacionadas nos dados gerados pelo experimento de sequenciamento. Os métodos de sequenciamento de nova geração são conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, em Metzker, M. Nature Biotechnology Reviews 11:31-46 (2010).
[0074] Da maneira aqui usada, “oligonucleotídeo” se refere a uma molécula que apresenta uma sequência de bases de ácido nucleico em uma parte principal compreendida principalmente de unidades idênticas de monômero em intervalos definidos. As bases são arranjadas na parte principal de tal maneira que possam se ligar a um ácido nucleico com uma sequência de bases que são complementares às bases do oligonucleotídeo. Os oligonucleotídeos mais comuns apresentam uma parte principal de unidades de fosfato de açúcar. Uma distinção pode ser realizada entre oligodesoxirribonucleotídeos que não apresentam um grupo hidroxila na posição 2’ e oligoribonucleotídeos que apresentam um grupo hidroxila na posição 2’. Os oligonucleotídeos também podem incluir derivados em que o hidrogênio do grupo hidroxila é substituído por grupos orgânicos, por exemplo, um grupo alila. Oligonucleotídeos do método cuja função como iniciadores ou sondas apresentam em geral pelo menos cerca de 10-15 nucleotídeos em comprimento e mais preferivelmente pelo menos cerca de 15 a 25 nucleotídeos em comprimento, embora oligonucleotídeos mais curtos ou mais longos, podem ser usados no método. O tamanho exato dependerá de muitos fatores, que por sua vez dependerá da melhor função ou do uso do oligonucleotídeo. O oligonucleotídeo pode ser gerado de qualquer maneira incluindo, por exemplo, síntese química, replicação de DNA, digestão com endonuclease de restrição de DNA de plasmídeos ou fago, transcrição reversa, PCR, ou uma combinação dos mesmos. O oligonucleotídeo pode ser modificado, por exemplo, por adição de um grupo metila, uma fração de biotina ou digoxigenina, uma marcação fluorescente ou usando nucleotídeos radioativos.
[0075] Da maneira aqui usada, o termo “iniciador” se refere a um oligonucleotídeo que é capaz de agir como um ponto de iniciação de síntese da sequência de ácido nucleico, quando colocado em condições nas quais a síntese de um produto de extensão de iniciador que é complementar a uma fita de ácido nucleico alvo é induzida, isto é, na presença de diferentes trifosfatos de nucleotídeo e uma polimerase em um tampão apropriado (“tampão” inclui pH, concentração iônica, cofatores etc.) e em uma temperatura adequada. Um ou mais dos nucleotídeos do iniciador podem ser modificados, por exemplo, pela adição de um grupo metila, uma fração de biotina ou digoxigenina, uma marcação fluorescente ou usando nucleotídeos radioativos. Uma sequência iniciadora não precisa refletir a sequência exata do molde. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser anexado à extremidade 5‘ do iniciador, com o restante da sequência iniciadora sendo substancialmente complementar à fita. O termo iniciador, da maneira aqui usada, inclui todas as formas de iniciadores que podem ser sintetizadas, incluindo iniciadores de ácido nucleico peptídico, iniciadores de ácido nucleico bloqueado, iniciadores modificados com fosforotioato, iniciadores marcados e similares. O termo “iniciador direto”, da maneira aqui usada, significa um iniciador que anela na fita anti-senso de DNAds. Um “iniciador reverso” anela na fita sentido de DNAds.
[0076] Da maneira aqui usada, “par iniciador” se refere a um par de iniciador direto e reverso (isto é, um par iniciador esquerdo e direito) que pode ser usado junto para amplificar uma dada região de um ácido nucleico de interesse.
[0077] Da maneira aqui usada, uma “amostra” se refere a uma substância que está sendo ensaiada pela presença de uma mutação em um ácido nucleico de interesse. Os métodos de processamento para liberar ou de outra forma tornar disponível um ácido nucleico para detecção são bem conhecidos na técnica e podem incluir etapas de manipulação de ácido nucleico. Uma amostra biológica pode ser um fluido corporal ou uma amostra de tecido. Em alguns casos, uma amostra biológica pode consistir ou compreender sangue, plasma, soro, urina, fezes, amostra epidérmica, amostra vaginal, amostra de pele, cotonete de bochecha, esperma, fluido amniótico, células cultivadas, amostra da medula óssea, biópsias de tumor, aspirado e/ou vilosidades coriônicas, células cultivadas e similares. Os tecidos frescos, fixos ou congelados também podem ser usados. Em uma modalidade, a amostra é conservada como uma amostra congelada ou como preparação de tecido impregnado em parafina e fixo em formaldeído ou paraformaldeído (FFPE). Por exemplo, a amostra pode ser impregnada em uma matriz, por exemplo, um bloco FFPE ou uma amostra congelada. As amostras de sangue completo de cerca de 0,5 a 5 mL coletadas com EDTA, ACD ou heparina como anticoagulante são adequadas.
[0078] O termo “sensibilidade,” da maneira aqui usada em relação aos métodos da presente tecnologia, é uma avaliação da capacidade de um método em detectar uma variação de sequência pré-selecionada em uma população de sequências heterogêneas. Um método apresenta uma sensibilidade de S% por variações de F% se, dada uma amostra em que a variação de sequência pré- selecionada está presente como pelo menos F% das sequências na amostra, o método puder detectar a sequência pré-selecionada em uma confiança pré- selecionada de C%, S% do tempo. A título de exemplo, um método apresenta uma sensibilidade de 90% por variações de 5% se, dada uma amostra em que a sequência de variação pré-selecionada está presente como pelo menos 5% das sequências na amostra, o método puder detectar a sequência pré- selecionada em uma confiança pré-selecionada de 99%, 9 das 10 vezes (F=5%; C=99%; S=90%).
[0079] O termo “específico”, da maneira aqui usada, em relação a um oligonucleotídeo iniciador significa que a sequência de nucleotídeo do iniciador apresenta pelo menos 12 bases de identidade de sequência, com uma porção do ácido nucleico a ser amplificada quando o oligonucleotídeo e o ácido nucleico são alinhados. Um oligonucleotídeo iniciador que é específico para um ácido nucleico é um que, nas condições de hibridização ou de lavagem exigentes, é capaz de hibridizar no alvo de interesse e não hibridizar substancialmente nos ácidos nucleicos que não são de interesse. Níveis mais elevados de identidade de sequência são preferidos e incluem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e mais preferivelmente pelo menos 98% de identidade de sequência.
[0080] Da maneira aqui usada, um “tumor sólido” é uma massa anormal de tecido que em geral não contém cistos ou áreas líquidas. Tumores sólidos podem ser benignos ou malignos (câncer). Exemplos de tumores sólidos são sarcomas, carcinomas e linfomas. Um tumor sólido é detectável na base de massa do tumor; por exemplo, por procedimentos tais como varredura CAT, imageamento MR, raios-X, ultrassom ou palpação, e/ou que é detectável em decorrência da expressão de um ou mais antígenos específicos de câncer em uma amostra obtida de um paciente. O tumor não precisa apresentar dimensões mensuráveis.
[0081] Os critérios específicos para determinar o estágio do câncer são dependentes do tipo específico de câncer com base no tamanho do tumor, características histológicas, marcadores de tumor, e outros critérios conhecidos pelos versados na técnica. Em geral, os estágios de câncer podem ser descritos da maneira a seguir: Estágio 0. Carcinoma in situ. Estágio I, Estágio II, e Estágio III. Números mais elevados indicam doença mais invasiva: Tamanho maior do tumor e/ou dispersão do câncer além do órgão no qual é primeiro desenvolvido para os linfonodos e/ou tecidos ou órgãos adjacentes próximos ao local do tumor primário.
[0082] Estágio IV. O câncer se dispersa para tecidos ou órgãos distantes.
[0083] “Especificidade”, da maneira aqui usada, é uma avaliação da capacidade de um método em distinguir uma variação de sequência pré- selecionada que está verdadeiramente ocorrendo dos artefatos de sequenciamento ou outras sequências muito relacionadas. É a capacidade de evitar detecções falso positivas. As detecções falso positivas podem originar de erros introduzidos na sequência de interesse durante a preparação de amostra, erro no sequenciamento, ou sequenciamento acidental de sequências muito relacionadas como pseudo-genes ou elementos de uma família de gene. Um método apresenta uma especificidade de X% se, quando aplicado a um conjunto de amostras de sequências NTotais , em que as sequências Xversadeiras são variações verdadeiras e Xnãoverdadeiras não não variações verdadeiras, o método selecionar pelo menos X% das variações não verdadeiras como sem variação. Por exemplo, um método apresenta uma especificidade de 90% se, quando aplicado a um conjunto de amostras de 1.000 sequências, em que 500 sequências são variações verdadeiras e 500 não são variações verdadeiras, o método selecionar 90% das 500 sequências de variação não verdadeira como sem variação. As especificidades exemplares incluem 90, 95, 98 e 99%.
[0084] O termo “condições de hibridização exigentes” da maneira aqui usada se refere às condições de hibridização pelo menos tão exigentes quanto a seguir: hibridização em 50% de formamida, 5xSSC, NaH2PO4 50 mM, pH 6,8, SDS 0,5%, 0,1 mg/mL de DNA de esperma de salmão sonicado, e solução de Denhart 5x a 42 oC por toda a noite; lavagem com SSC 2x, SDS 0,1% a 45 oC; e lavagem com SSC 0,2x, SDS 0,1% a 45 oC. Em um outro exemplo, condições de hibridização exigentes podem não permitir hibridização de dois ácidos nucleicos que diferem em um intervalo de 20 nucleotídeos contíguos em mais de duas bases.
[0085] Da maneira aqui usada, os termos “sequência alvo” e “sequência de ácido nucleico alvo” se referem a uma sequência específica de ácido nucleico a ser detectada e/ou quantificada na amostra a ser analisada.
[0086] Da maneira aqui usada, os termos "tratar", "tratando" ou "tratamento" se referem a uma ação para obter um resultado clínico benéfico ou desejado incluindo, mas sem limitação, alívio ou melhora de um ou mais sinais ou sintomas de uma doença ou condição (por exemplo, regressão, parcial ou completa), diminuição da extensão da doença, estabilidade (isto é, doença estável, sem piora) da posição da doença, melhora ou atenuação da posição da doença, diminuição da taxa ou tempo de progressão, e remissão (se parcial ou total).
Impacto do perfil de tumor em teraía de grogas alvejadas
[0087] O câncer se tornou o foco para desenvolvimento de droga na última década, com o número de novas drogas anticâncer em desenvolvimento triplicando de 2001 até 2010. Siegel et al., CA Cancer J Clin. 64:9-29 (2014). As taxas de sobrevivência modestas e o elevado grau de efeitos adversos da quimioterapia padrão e tratamento com radiação levou o foco para o desenvolvimento de novas drogas em tratamentos que alvejam moléculas de sinalização específicas ou vias regulatórias completas. A eficiência de muitas drogas alvejadas pode ser influenciada por biomarcadores moleculares, que são agora comumente usados como um auxílio em selecionar pacientes para tratamento.
[0088] Além disso, a heterogeneidade mutacional de tumores sólidos ampliou o escopo das vias de sinalização celular que são alvejadas por novos terapêuticos. Hanahan & Weinberg, Cell 144:646-74 (2011); Fisher et al., British J. Cancer 108:479-485 (2013); Burrella & Swantona, Molecular Oncology 8:1095-1111 (2014). Identificar alterações de via pode conduzir um clínico a utilizar ou não drogas que alvejam as vias afetadas. Além disso, sem ficar preso à teoria, uma sobreposição nas vias regulatórias afetadas entre cânceres pode indicar que biomarcadores aprovados e tratamento com as drogas para um tipo de tumor podem apresentar aplicações clínicas potenciais em outros tipos de tumor. Um exemplo de aplicação satisfatória em um tratamento alvejado simples através de múltiplos tipos de tumor e indicações de biomarcadores é o uso do inibidor de tirosina quinase imatinibe (mesilato de imatinibe). Imatinibe foi desenvolvido originalmente para alvejar c-abl em leucemias mielóides crônicas (CMLs) que carregam o cromossomo Philadelphia (BCR/ABL1), mas suas indicações foram expandidas para incluir o tratamento de certos tumores GIST que carregam mutações KIT ou PDGFRA, bem como melanomas avançados ou metastáticos que carregam mutações KIT. Peng et al., Clinical Pharmacokinetics 44:879-894 (2005); Guo et al., JCO 29:2904-2909 (2011). Dessa maneira, pode existir um benefício potencial para prospecção de perfil de tumores para alvos que podem não ser, no momento, clinicamente acionáveis para um dado tipo de tumor.
[0089] Mutações em proteínas de sinalização “à jusante” também podem causar resistência à droga, cedendo utilidade adicional ao perfil de mutação. Kelloff & Sigman, Nat Rev Drug Discov. 11:201-214 (2012). Os tumores do perfil que exibem resistência adquirida levaram à identificação de mecanismos de resistência. Por exemplo, um paciente com melanoma com resistência adquirida ao inibidor vemurafenib de BRAF foi observado por abrigar uma mutação pontual em MEK1 C121S. Wagle et al., Cancer Discovery 4:61-68 (2014); Narita et al., Mol Cancer Ther. 13:823-832 (2014). MEK1 codifica uma quinase à jusante de BRAF, e acredita-se que a mutação C121S explica a resistência à vemurafenib no caso anteriormente mencionado. Embora nenhuma droga alternativa estivesse disponível no momento, um inibidor MEK1 inédito no desenvolvimento pré-clínico foi relatado recentemente como ativo contra melanoma resistente à vemurafenib que abriga a mutação MEK1 C121S. Wagle et al., J Clin Oncol. 29:30853096 (2011). Casos como este destacam a utilidade potencial de identificar mutações em uma ampla faixa de genes associados ao câncer em pacientes que exibem resistência adquirida, mesmo aqueles que ainda não estavam ligados à resposta terapêutica.
[0090] Pacientes naive em tratamento também apresentam frequentemente mutações simultâneas em genes múltiplos que apresentam implicações no prognóstico ou decisões de tratamento. Por exemplo, mutações simultâneas KRAS e PIK3CA são comumente observadas em cânceres colorretal e de pulmão, e o estado combinatório pode apresentar valor preditivo prognóstico ou de tratamento. Roock et al., Lancet Oncology 12:594-603 (2011); Chaft et al., Mol Cancer Ther. 11; 485 (2012); Janne PA et al., Lancet Oncol. 14:38-47 (2013). As mutações simultâneas PIK3CA em cânceres de pulmão positivos para EGFR foram descritas para ser associadas à resistência aos inibidores de EGFR tirosina quinase(TKIs). Ludovini et al., J. Thoracic Oncology 6:707-715 (2011). Além disso, um estudo recente demonstrou que 20% de cânceres de pulmão positivos para rearranjos ALK abrigam mutações de co-ocorrência em EGFR ou MET, as quais podem ser um fator importante na decisão de tratar com crizotinib. Boland et al., J. Thoracic Oncology 8:574-581 (2013). Assim, o perfil prospectivo de tumores pode auxiliar na seleção de regimes terapêuticos ideais, melhorando por meio disso a probabilidade de um resultado de paciente positivo.
Plataformas NGS
[0091] Em algumas modalidades, sequenciamento paralelo de alto rendimento maciço emprega sequenciamento-por-síntese com terminadores corantes reversíveis. Em outras modalidades, o sequenciamento é realizado por meio de sequenciamento-por-ligação. Ainda em outras modalidades, o sequenciamento é sequenciamento de molécula única. Exemplos de técnicas de sequenciamento de nova geração incluem, mas sem limitação pirossequenciamento, sequenciamento de terminador de corante reversível, sequenciamento SOLiD, sequenciamento semicondutor de íon, sequenciamento de molécula única de Helioscope etc.
[0092] O sistema de sequenciamento com amplicon Ion Torrent™ (Life Technologies, Carlsbad, CA) emprega uma abordagem a base de fluxo que detecta alterações de pH causadas pela liberação de íons hidrogênio durante a incorporação de nucleotídeos não modificados na replicação de DNA. Para uso com este sistema, uma biblioteca de sequenciamento é inicialmente produzida gerando fragmentos de DNA flanqueados por adaptadores de sequenciamento. Em algumas modalidades, estes fragmentos podem ser amplificados por meio de clones em partículas por PCR de emulsão. As partículas com o molde amplificado são então colocadas em um chipe de sequenciamento semicondutor de silício. Durante a replicação, o chipe é inundado por um nucleotídeo após o outro e, se um nucleotídeo complementar a molécula de DNA em um micropoço particular do chipe, então será incorporado. Um próton é liberado naturalmente quando um nucleotídeo é incorporado pela polimerase na molécula de DNA, resultando em uma alteração local detectável de pH. O pH da solução é então alterado neste poço, e é detectado pelo sensor de íon. Se as repetições de homopolímero estiverem presentes na sequência molde, os nucleotídeos múltiplos serão incorporados em um único ciclo. Isto leva a um número correspondente de hidrogênios liberados e um sinal eletrônico proporcionalmente maior.
[0093] O sistema de sequenciamento 454TM GS FLX TM (Roche, Alemanha) emprega uma metodologia de detecção a base de luz em um sistema de pirossequenciamento paralelo em grande escala. O pirossequenciamento usa polimerização de DNA, adicionando uma espécie de nucleotídeo em um período e detectando e quantificando o número de nucleotídeos adicionados em um dado local, através da luz emitida pela liberação de pirofosfatos anexados. Para uso com o sistema 454TM, fragmentos de DNA ligados ao adaptador são fixos às microesferas de captura de DNA pequeno em uma emulsão água-em-óleo, e amplificados por PCR (PCR de emulsão). Cada microesfera ligada ao DNA é colocada em um poço em uma placa de picotitulação e os reagentes do sequenciamento são distribuídos através dos poços da placa. Os quatro nucleotídeos de DNA são adicionados sequencialmente em uma ordem fixa através do dispositivo da placa de picotitulação, durante uma corrida de sequenciamento. Durante o fluxo de nucleotídeo, milhões de cópias de DNA ligadas em cada uma das esferas são sequenciadas em paralelo. Quando um nucleotídeo complementar à fita molde é adicionado a um poço, o nucleotídeo é incorporado na fita de DNA existente, gerando um sinal de luz que é registrado por uma câmara CCD no instrumento.
[0094] A tecnologia de sequenciamento baseia-se em terminadores de corante reversíveis: moléculas de DNA são primeiro anexadas aos iniciadores em uma lâmina e amplificadas de maneira que colônias clonais locais são formadas. Quatro tipos de bases terminadoras reversíveis (bases RT) são adicionados, e nucleotídeos não incorporados são lavados. Ao contrário do pirossequenciamento, o DNA pode ser apenas estendido em um nucleotídeo de cada vez. Uma câmera obtém imagens dos nucleotídeos marcados fluorescentemente, a seguir o corante junto com o bloqueador terminal 3' é removido quimicamente do DNA, permitindo o próximo ciclo.
[0095] O sequenciamento de molécula única da Helicos usa fragmentos de DNA com adaptadores com cauda poliA adicionados, que são anexados na superfície de célula de fluxo. Em cada ciclo, DNA polimerase e uma única espécie de nucleotídeo marcado fluorescentemente são adicionados, resultando em extensão dependente do molde dos duplexes molde com iniciador imobilizado na superfície. As leituras são realizadas pelo sequenciador Helioscope. Após a aquisição de imagens cobrindo o arranjo completo, a clivagem química e liberação da marca fluorescente permite o ciclo subsequente de extensão e imageamento.
[0096] Sequenciamento por síntese (SBS), como o sequenciamento eletroforético com finalização de corante "estilo antigo", depende da incorporação de nucleotídeos por uma DNA polimerase para determinar a sequência da base. Uma biblioteca de DNA com adaptadores afixados é desnaturada em fitas simples e enxertado em uma célula de fluxo, seguido por amplificação de ponte para formar um arranjo de alta densidade de pontos em um chipe de vidro. Métodos de terminador reversível usa versões reversíveis de terminadores corantes, adicionando um nucleotídeo de cada vez, detectando fluorescência em cada posição pela remoção repetida do grupo de bloqueio para permitir a polimerização de um outro nucleotídeo. O sinal de incorporação de nucleotídeo pode variar com nucleotídeos marcados fluorescentemente, reações de luz direcionadas por fosfato e detecção de íon hidrogênio tem sido usados. Exemplos de plataformas SBS incluem Illumina GA e HiSeq 2000. O sistema de sequenciamento pessoal MiSeq® (Illumina, Inc.) também emprega sequenciamento por síntese com química de terminador reversível.
[0097] Ao contrário do método de sequenciamento por síntese, o método de sequenciamento por ligação usa uma DNA ligase para determinar a sequência alvo. Este método de sequenciamento depende da ligação enzimática de oligonucleotídeos que são adjacentes por meio da complementaridade local em uma fita de DNA molde. Esta tecnologia emprega uma divisão de todos os oligonucleotídeos possíveis de um tamanho fixo, marcados de acordo com a posição sequenciada. Os oligonucleotídeos são anelados e ligados, e a ligação preferencial por DNA ligase para combinar sequências resulta em um sinal de cor e espaço codificado por dinucleotídeo nesta posição (por meio da liberação de uma sonda marcada fluorescentemente que corresponde a um nucleotídeo conhecido, em uma posição conhecida ao longo do oligo). Este método é usado principalmente por sequenciadores da Life Technologies’ SOLiD™. Antes do sequenciamento, o DNA é amplificado por PCR de emulsão. As microesferas resultantes, contendo cada qual apenas cópias da mesma molécula de DNA, são depositadas em um substrato plano sólido.
[0098] O sequenciamento SMRT™ é baseado na abordagem do sequenciamento por síntese. O DNA é sintetizado em recipientes do tipo poço pequeno em guias de onda de modo zero (ZMWs), com as ferramentas de captura localizadas no fundo do poço. O sequenciamento é realizado com o uso de polimerase não modificada (anexada no fundo de ZMW) e nucleotídeos marcados fluorescentemente fluindo livremente na solução. Os poços são construídos de uma maneira que apenas a fluorescência que ocorre no fundo do poço seja detectada. A marca fluorescente é destacada a partir do nucleotídeo em sua incorporação na fita de DNA, levando a uma fita de DNA não modificada. Métodos de triagem de tumor sólido da presente tecnologia
[0099] São aqui descritos métodos e ensaios que são baseados, pelo menos em parte, em um conjunto pré-selecionado de genes que estão associados a um fenótipo canceroso (por exemplo, um ou mais de: risco de câncer, progressão do câncer, resposta ao tratamento de câncer ou resistência ao tratamento de câncer). Tais genes pré-selecionados possibilitam a aplicação de métodos de sequenciamento, particularmente métodos que dependem de sequenciamento paralelo maciço de um grande número de diversos genes, por exemplo, de amostras de tumor ou controle.
[00100] Em uma modalidade, os métodos caracterizados na presente tecnologia são usados em um formato de ensaio multiplex, multi-gene, por exemplo, ensaios que incorporam sinais múltiplos de um grande número de diversas alterações genéticas em um grande número de genes.
[00101] Os métodos da presente tecnologia são baseados no princípio de que avaliar populações de células em uma amostra de tumor, por exemplo, um tumor sólido heterogêneo, quanto a presença de uma ou mais alterações em um conjunto pré-selecionado de genes relacionados ao câncer é usado para determinar se um paciente se beneficiará ou responderá ao tratamento com um agente terapêutico individual, ou uma combinação específica de agentes terapêuticos. Em algumas modalidades do método, o conjunto pré- selecionado de genes relacionados ao câncer corresponde a AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN. Em algumas modalidades do método, a presença de uma ou mais alterações no conjunto pré-selecionado de genes relacionados ao câncer é detectada ensaiando uma pluralidade de amplicons que correspondem ao conjunto pré-selecionado de genes relacionados ao câncer.
[00102] As vantagens dos métodos da presente tecnologia em relação a outros paineis de triagem NGS a base de PCR comparáveis para tumores sólidos são duplicadas. Primeiro, nenhuma avaliação preliminar da qualidade do DNA genômico extraído de tecidos FFPE é exigida, a fim de gerar bibliotecas a base de amplicon altamente uniformes. Segundo, a inserção mínima de DNA exigida para os ensaios de triagem aqui descritos é cerca de três vezes menos que outros painéis de triagem de tumor sólido comparáveis. Por exemplo, a entrada mínima de DNA para os métodos aqui descritos é 10 ng para gerar 231 amplicons que correspondem a 34 genes, ao passo que o protocolo de tumor TruSight™ exige pelo menos 30 ng para gerar 174 amplicons que correspondem a 26 genes.
[00103] A presente descrição fornece métodos para detectar pelo menos uma mutação em uma pluralidade de genes relacionados ao câncer em um indivíduo compreendendo: (a) extrair DNA genômico de uma amostra do tumor FFPE obtido a partir do indivíduo; (b) gerar uma biblioteca compreendendo os amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer, a dita pluralidade de genes relacionados ao câncer compreendendo AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN, em que (i) gerar a dita biblioteca ocorre sem o uso de um conjunto de isca compreendendo sequências de ácido nucleico que são complementares a pelo menos uma da pluralidade de amplicons; e (ii) a qualidade do DNA genômico extraído da amostra do tumor FFPE não é avaliada usando PCR quantitativa antes de gerar a biblioteca; (c) ligar uma sequência adaptadora às extremidades da pluralidade de amplicons; e (d) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons usando sequenciamento paralelo de alto rendimento maciço.
[00104] Em algumas modalidades do método, o indivíduo foi diagnosticado como tendo, é suspeito de ter, ou está em risco de ter câncer de mama, melanoma, câncer colorretal ou câncer de pulmão.
[00105] Em algumas modalidades do método, a pelo menos uma mutação detectada é uma mutação em EGFR, KRAS, BRAF, NRAS, ERBB2 ou PIK3CA. Em uma modalidade, a pelo menos uma mutação detectada é selecionada do grupo que consiste em BRAF V600E, BRAF V600K, BRAF K483Q, BRAF G466V, BRAF G464V, BRAF E501V, BRAF E501K, EGFR ΔE746_A750, EGFR R680Q, EGFR G598E, KRAS A146T, KRAS R68M, KRAS L19F, KRAS G12V, KRAS G12D, KRAS G12C, KRAS G13D, KRAS G13C, KRAS G12A, KRAS G12S, KRAS Q22K, NRAS Q61K, NRAS Q61R, NRAS G12R, NRAS G12D, PIK3CA C420R, PIK3CA G106R, PIK3CA R38H, PIK3CA E453K, PIK3CA H1044R, PIK3CA N1044K, PIK3CA E545K, PIK3CA Q546H, PIK3CA H1047R, PIK3CA H1043L, PIK3CA M1043V, PIK3CA E542K, PIK3CA E542Q, PIK3CA T1053A, PIK3CA I121V, PIK3CA H1047L, ERBB2 L755S, ERBB2 S310Y, ERBB2 D769Y, ERBB2 S255R, DDR2 H92Y, DDR2 R31L, DDR2 L34P, DDR2 P381R e DDR2 K392N.
[00106] Em algumas modalidades do método, a biblioteca compreendendo os amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer aqui descrita é gerada usando não mais que 10 ng de DNA genômico extraído da amostra do tumor FFPE. Em algumas modalidades do método, a biblioteca compreendendo os amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer aqui descrita é gerada usando 11-25 ng de DNA genômico extraído da amostra do tumor FFPE. Em algumas modalidades do método, a biblioteca compreendendo os amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer aqui descrita é gerada usando pelo menos 25 ng de DNA genômico extraído da amostra do tumor FFPE.
[00107] Em algumas modalidades do método, a pluralidade de amplicons é gerada por pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos dez, pelo menos vinte, pelo menos trinta, pelo menos quarenta, pelo menos cinquenta, ou pelo menos cem ou mais pares de iniciadores descritos na tabela 1. Tabela 1: Agrupamento misto de par iniciador 1
[00108] Em algumas modalidades do método, a pluralidade de amplicons é gerada por pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos dez, pelo menos vinte, pelo menos trinta, pelo menos quarenta, pelo menos cinquenta, ou pelo menos cem ou mais pares de iniciadores descritor na tabela 2. Tabela 2: Agrupamento misto de par iniciador 2
[00109] Um outro aspecto dos métodos da presente tecnologia é que os 231 amplicons gerados por seus respectivos pares de iniciador direto e reverso mostrados nas tabelas 1 e 2 mapeiam os genes ou regiões de gene não testados de maneira típica em um dado tipo de tumor. Por exemplo, os genes ou regiões de gene tipicamente testados incluem exons18-21 EGFR, exons 1-2 KRAS, e translocações ALK para câncer de pulmão; exons 1-2 KRAS/NRAS, e exons 9 e 20 PIK3CA para câncer colorretal; exon 15 BRAF, e KIT para melanoma; e KIT e PDGFRa para tumores estromais gastrointestinais.
[00110] Em algumas modalidades, um único iniciador ou um ou ambos iniciadores de um par iniciador compreendem uma sequência adaptadora específica (também referida como um adaptador de sequenciamento) ligada à extremidade 5’ da porção de sequência específica alvo do iniciador. Este adaptador de sequenciamento é um oligonucleotídeo curto de sequência conhecida que pode fornecer um sítio de iniciação tanto para a amplificação quanto para o sequenciamento do ácido nucleico alvo adjacente desconhecido. Como tal, os adaptadores permitem a ligação de um fragmento a uma célula de fluxo para sequenciamento de nova geração. Qualquer sequência adaptadora pode ser incluída em um iniciador usado na presente tecnologia. Em certas modalidades, amplicons que correspondem às regiões específicas de AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN são amplificadas usando iniciadores que contêm um oligonucleotídeo adaptador de sequenciamento para produzir amplicons marcados com adaptador.
[00111] Em outras modalidades, os iniciadores empregados não contêm sequências adaptadoras e os amplicons produzidos são subsequentemente (isto é, após a amplificação) ligados a um oligonucleotídeo adaptador de sequenciamento em uma ou ambas as extremidades dos amplicons. Em algumas modalidades, todos os amplicons diretos (isto é, amplicons estendidos dos iniciadores diretos que hibridizaram com fitas antissenso de um ácido nucleico alvo) contêm a mesma sequência adaptadora. Em algumas modalidades, quando sequenciamento de fita dupla é realizado, todos os amplicons diretos contêm a mesma sequência adaptadora e todos os amplicons reversos (isto é, amplicons estendidos dos iniciadores reversos que hibridizaram com fitas sentido de um segmento alvo) contêm uma sequência adaptadora que é diferente da sequência adaptadora dos amplicons direto. Em algumas modalidades, as sequências adaptadoras compreendem adicionalmente uma sequência de índice (também referida como uma marcação índice, um “código de barra” ou um identificador multiplex (MID)).
[00112] Em algumas modalidades, as sequências adaptadoras são sequências adaptadoras P5 e/ou P7 que são recomendadas para sequenciadores Illumina (MiSeq e HiSeq). Vide, por exemplo, Williams- Carrier et al., Plant J., 63(1):167-77 (2010). Em algumas modalidades, as sequências adaptadoras são sequências adaptadoras de código de barras P1, A, ou Ion Xpress™ que são recomendadas para sequenciadores da Life Technologies. Outras sequências adaptadoras são conhecidas na técnica. Alguns fabricantes recomendam sequências adaptadoras específicas para uso com a tecnologia de sequenciamento particular e maquinaria oferecida.
[00113] Adicionalmente ou alternativamente, em algumas modalidades dos métodos anteriores, amplicons que correspondem a regiões específicas de AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN de mais de uma amostra são sequenciada. Em algumas modalidades, todas as amostras são sequenciadas simultaneamente em paralelo.
[00114] Em algumas modalidades dos métodos anteriores, os amplicons que correspondem às regiões específicas de AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN de pelo menos 1, 5, 10, 20, 30 ou até 35, 40, 45, 48 ou 50 amostras diferentes são amplificadas e sequenciadas usando os métodos aqui descritos.
[00115] Adicionalmente ou alternativamente, em algumas modalidades do método, amplicons derivados de uma única amostra podem compreender uma sequência de índice idêntica que indica a fonte a partir da qual o amplicon é gerado, a sequência de índice para cada amostra que é diferente das sequências de índices de todas outras amostras. Como tal, o uso de sequências de índices permite que amostras múltiplas sejam agrupadas por corrida de sequenciamento e a fonte da amostra seja verificada subsequentemente com base na sequência de índice. Em algumas modalidades, o sistema Access Array™ (Fluidigm Corp., San Francisco, CA) ou o sistema Apollo 324 (Wafergen Biosystems, Fremont, CA) é usado para gerar uma biblioteca de amplicon em código de barrad (indexada) amplificando simultaneamente os ácidos nucleicos das amostras em uma configuração.
[00116] Em algumas modalidades, os amplicons indexados são gerados usando iniciadores (por exemplo, iniciadores diretos e/ou iniciadores reversos) contendo a sequência de índice. Tais iniciadores indexados podem ser incluídos durante a preparação da biblioteca como uma ferramenta de “código de barras” para identificar amplicons específicos que se originam de uma fonte de amostra particular. Quando os iniciadores ligados ao adaptador e/ou indexados são empregados, a sequência adaptadora e/ou sequência de índice são incorporados no amplicon (junto com a sequência iniciadora específica alvo) durante a amplificação. Portanto, os amplicons resultantes são competentes em sequenciamento e não exigem o protocolo tradicional de preparação de biblioteca. Além disso, a presença da marcação índice permite a diferenciação de sequências de múltiplas fontes de amostra.
[00117] Em algumas modalidades, os amplicons podem ser amplificados com iniciadores não ligados ao adaptador e/ou não indexados, e um adaptador de sequenciamento e/ou uma sequência de índice podem ser subsequentemente ligados a uma ou ambas as extremidades de cada um dos amplicons resultantes. Em algumas modalidades, a biblioteca de amplicon é gerada usando uma abordagem de PCR multiplexada.
[00118] Os amplicons indexados de mais de uma fonte de amostra são quantificados individualmente e a seguir agrupados antes do sequenciamento de alto rendimento. Como tal, o uso de sequências de índices permite que amostras múltiplas (isto é, amostras de mais de uma fonte de amostra) sejam agrupadas por corrida de sequenciamento e a fonte de amostra subsequentemente verificada, com base na sequência de índice. “Multiplexação” é o agrupamento de múltiplas bibliotecas marcadas com adaptador e indexadas em uma única corrida de sequenciamento. Quando conjuntos de iniciador indexados são usados, esta capacidade pode ser explorada para estudos comparativos. Em algumas modalidades, bibliotecas de amplicon de até 48 fontes separadas são agrupadas antes do sequenciamento.
[00119] Após a produção de uma biblioteca de amplicon marcada com adaptador e, opcionalmente indexada, os amplicons são sequenciados usando sequenciamento paralelo de alto rendimento maciço (isto é, sequenciamento de nova geração). Métodos para realizar sequenciamento paralelo de alto rendimento maciço são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades do método, o sequenciamento paralelo de alto rendimento maciço é realizado usando pirossequenciamento 454TM GS FLX TM, sequenciamento de terminador de corante reversível, sequenciamento SOLiD, sequenciamento semicondutor de íon, sequenciamento de molécula única de Helioscope, sequenciamento por síntese, sequenciamento por ligação, ou sequenciamento SMRT™. Em algumas modalidades, sequenciamento de alto rendimento paralelo maciço pode ser realizado usando uma abordagem de leitura aprofundada.
[00120] Em algumas modalidades, os métodos da presente tecnologia são usados na detecção de pelo menos uma mutação em amplicons que correspondem às regiões específicas de AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN em uma amostra do tumor FFPE compreendendo um tumor heterogêneo. Em certas modalidades, 5% das células do tumor heterogêneo abrigam pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons. Em algumas modalidades, cerca de 10% das células do tumor heterogêneo abrigam pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons. Em algumas modalidades, cerca de 25% das células do tumor heterogêneo abrigam pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons. Em algumas modalidades, cerca de 50% das células do tumor heterogêneo abrigam pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons. Em outras modalidades, pelo menos 5% das células do tumor heterogêneo abrigam pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons. Em outras modalidades, pelo menos 10% das células do tumor heterogêneo abrigam pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons. Em outras modalidades, pelo menos 25% das células do tumor heterogêneo abrigam pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons.
Tratamento de tumores sólidos
[00121] São aqui descritos os métodos para determinar se um paciente diagnosticado com câncer de mama, câncer colorretal, melanoma ou câncer de pulmão se beneficiará ou é previsto para ser responsivo ao tratamento com um único agente terapêutico ou uma combinação específica de agentes terapêuticos.
[00122] Em algumas modalidades, o(s) agente(s) terapêutico(s) compreende(m) um ou mais de terapias anti-HER-2, terapias anti-EGFR, inibidores de trajeto PI3K/AKT/mTor, inibidores de quinase, inibidores de trajeto de Notch, inibidores de BRAF, antagonistas de SMO, inibidores de ALK/MET, antagonistas de ERBB2, antagonistas de FGFR3 e inibidores de RAF/MEK/ERK.
[00123] Em certas modalidades, o inibidor de EGFR tirosina quinase é gefitinib ou erlotinib. Em certas modalidades, a terapia anti-EGFR é cetuximab.
[00124] Em algumas modalidades do método, a terapia anti-HER-2 é trastuzumab ou lapatinib.
[00125] Exemplos de inibidores de quinase incluem, mas sem limitação, crizotinib, afatinib, Axitinib, bevacizumab, Bosutinib, Cetuximab, Dasatinib, Erlotinib, Fostamatinib, Gefitinib, Imatinib, Lapatinib, Lenvatinib, Nilotinib, Panitumumab, Pazopanib, Pegaptanib, Ranibizumab, Ruxolitinib, Sorafenib, Sunitinib, Trastuzumab, e Vemurafenib.
[00126] Exemplos de inibidores de BRAF incluem, mas sem limitação, GDC-0879, SB590885, Encorafenib, RAF265, TAK-632, PLX4720, CEP- 32496, AZ628, Sorafenib Tosilato, Sorafenib, Vemurafenib (Zelboraf) e Dabrafenib (GSK2118436).
[00127] Exemplos de inibidores de RAF/MEK/ERK incluem, mas sem limitação, Vemurafenib (Zelboraf) e Dabrafenib (GSK2118436), Encorafenib, TAK-632, PLX4720, MLN2480, Cobimetinib (GDC-0973), MEK 162, RO5126766, GDC-0623, VTX11e, Selumetinib (AZD6244), PD0325901, Trametinib (GSK1120212), U0126-EtOH, PD184352 (CI-1040), Refametinib, PD98059, BIX02189, Binimetinib, Pimasertib (AS-703026), SL327, BIX02188, AZD8330, TAK-733, PD318088, SCH772984, e FR 180204.
[00128] Exemplos de inibidores de trajeto de PI3K/AKT/mTor incluem, mas sem limitação, BKM120, BEZ235, Pictilisib (GDC-0941), LY294002, CAL-101 (Idelalisib), GNE-317, PI-3065, HS-173, PI-103, NU7441, GSK2636771, VS-5584, CZC24832, Duvelisib, TG100-115, A66, YM201636, CAY10505, GSK1059615, PF-04691502, PIK-75, PIK-93, AS- 605240, BGT226, AZD6482, Voxtalisib, Alpelisib, CUDC-907, IC-87114, Omipalisib, TG100713, Gedatolisib, CH5132799, PKI-402, BAY 80-6946, TGX-221, XL147, PIK-90, PIK-293, PIK-294, 3-Metiladenina, Quercetina, Wortmannina, ZSTK474, AS-252424, AS-604850, everolimus, e Apitolisib.
[00129] Exemplos de inibidores de trajeto de Notch incluem, mas sem limitação, FLI-06, LY411575, Dibenzazepina, RO4929097, Composto E, Z- Leu-Leu-Nle-CHO, SAHM1, TR4 e Semagacestat.
[00130] Exemplos de antagonistas de SMO incluem, mas sem limitação, Purmorfamina, Taladegib (LY2940680), Ciclopamina, Vismodegib (GDC-0449), LDE225, Glasdegib (PF-04449913), PF-5274857, TAK-441, SANT-1, BMS-833923, GANT61 e IPI-926.
[00131] Exemplos de antagonistas de ERBB2 incluem, mas sem limitação, Lapatinib, Canertinib, CP-724,714, AZD8931, AEE788, Tyrphostin AG 879, Mubritinib e Pertuzumab.
[00132] Exemplos de antagonistas de FGFR3 incluem, mas sem limitação, BGJ398 (NVP-BGJ398), AZD4547, LY2874455, ácido dilático Dovitinib, Dovitinib, Lactato de Dovitinib, CH5183284 e Nintedanib.
[00133] Exemplos de inibidores de ALK incluem, mas sem limitação, Crizotinib, TAE684, Alectinib, Ceritinib, AP26113, AZD3463 e ASP3026.
[00134] Exemplos de inibidores de MET incluem, mas sem limitação, Crizotinib, PHA-665752, SU11274, SGX-523, BMS-777607, JNJ-38877605, Tivantinib, PF-04217903, MGCD-265, Capmatinib, AMG 208, MK-2461, AMG 458, NVP-BVU972 e Tepotinib.
[00135] O inibidor de BRAF vemurafenib é a terapia alvejada mais comum para melanoma e é usado para tratar tumores positivos para mutação BRAF V600. Além disso, o sequenciamento para mutações KIT também pode ser realizado para avaliar a provável eficiência de tratamento com mesilato de imatinib. Assim, em algumas modalidades, a presente descrição fornece métodos para determinar se um paciente com melanoma é provável de responder ao tratamento com vemurafenib ou inibidores de MEK. São aqui fornecidos também os métodos para determinar se um paciente com melanoma é provável de responder ao tratamento com uma droga que inibe a atividade de PIK3CA ou MET.
[00136] Os espécimes de câncer colorretal são geralmente enviados pra detecção de mutações em genes à jusante de EGFR para identificar tumores com uma baixa probabilidade de resposta às terapias anti-EGFR, tal como cetuximab. As diretrizes NCCN identificam mutações em KRAS, NRAS, ou BRAF como indicadores de ausência de resposta de capacidade para tais terapias, e evidência clínica sugere que mutações PIK3CA e PTEN também são indicadores de resistência. Vide Er T. et al., BioMed Research International 2014:1-8 (2014); Bokemeyer et al., Ann Oncol. 22(7): 1535-46 (2011). Assim, em algumas modalidades, a presente descrição fornece métodos para determinar se um paciente com câncer colorretal é provável de responder ao tratamento com terapia anti-EGFR (por exemplo, cetuximab).
[00137] Em relação aos espécimes de câncer de pulmão, o teste recomendado pela diretriz atual (CAP, IASL, AMP) é priorizar teste para mutações EGFR, que identifica diretamente doentes que respondem ao tratamento com EGFR TKI. Estas diretrizes também estabelecem que espécimes negativos para mutação EGFR podem ser investigados em relação ao teste de rearranjo de ALK para identificar prováveis doentes que respondem ao tratamento com o inibidor de ALK/c-MET crizotinib. O teste para mutação KRAS pode ser usado como um meio para identificar doentes que não respondem ao tratamento com inibidores de EGFR tirosina quinase, tais como gefitinib e erlotinib. Entretanto, isto não é uma regra para um paciente que responde ao tratamento com TKI, uma vez que a inibição de EGFR tirosina quinase por estas drogas é específica para tumores que abrigam mutações do domínio tirosina quinase m EGFR. Em algumas modalidades, a presente descrição fornece métodos para determinar se um paciente com câncer de pulmão é provável de ser responsivo ao tratamento com um EGFR TKI. Em certas modalidades, o inibidor de EGFR tirosina quinase é gefitinib ou erlotinib. São aqui também fornecidos os métodos para determinar se um paciente com câncer de pulmão é provável de ser responsivo ao tratamento com crizotinib. A presente descrição também fornece métodos para determinar se um paciente com câncer de pulmão é provável de ser responsivo ao tratamento com vemurafenib, dabrafenib, dasatinib ou um inibidor de MEK, tal como selumetinib.
[00138] Os biomarcadores clínicos de rotina principais para tratamento alvejado em câncer de mama são amplificação/expressão de gene HER-2 (FISH e/ou IHC) para terapia anti-HER-2 (por exemplo, trastuzumab) e superexpressão de ER/PR para terapia endócrina. Em algumas modalidades, a presente descrição fornece métodos para determinar se um paciente diagnosticado com câncer de mama positivo para HER-2 é provável de ser responsivo ao tratamento com terapias anti-HER-2 ou trastuzumab emtansina. Em algumas modalidades do método, a terapia anti-HER-2 é trastuzumab ou lapatinib. São aqui também fornecidos os métodos para determinar se um paciente diagnosticado com câncer de mama é provável de ser responsivo ao tratamento com inibidores de trajeto PI3K/AKT/mTOR.
[00139] Em um outro aspecto, a presente descrição fornece um método para selecionar um indivíduo para tratamento com um inibidor de trajeto PI3K/AKT/mTor e pelo menos um agente adicional compreendendo: (a) extrair DNA genômico de um espécime embebido em parafina fixada em formalina, obtido a partir do indivíduo; (b) gerar uma biblioteca compreendendo os amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer, a dita pluralidade de genes relacionados ao câncer compreendendo AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN, em que (i) gerar a dita biblioteca procede independentemente do uso de um conjunto de isca compreendendo sequências de ácido nucleico que são complementares a pelo menos uma da pluralidade de amplicons, e (ii) a qualidade do DNA genômico extraído do espécime embebido em parafina fixada em formalina não é avaliada usando PCR quantitativa antes de gerar a biblioteca; (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons; e (d) selecionar o indivíduo para tratamento com um inibidor de trajeto PI3K/AKT/mTor e pelo menos um agente adicional, se uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a PIK3CA, PIK3R1 e PTEN, e uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a NOTCH1, ERBB2, BRAF, PTCH1, SMO, EGFR, KRAS, DDR2, MAP2K1, FGFR3, NRAS, MET, e FBXW7 forem detectadas.
[00140] Em algumas modalidades do método, o pelo menos um agente adicional é selecionado de inibidores de trajeto de Notch, inibidores de BRAF, antagonistas de SMO, inibidores de MET, antagonistas de ERBB2 ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades do método, o pelo menos um agente adicional é selecionado de inibidores de trajeto de Notch, antagonistas de FGFR3, inibidores de RAF/MEK/ERK, ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente adicional são inibidores de RAF/MEK/ERK, antagonistas de FGFR3, antagonistas de SMO ou qualquer combinação destes.
[00141] Em um outro aspecto, a presente descrição fornece um método para selecionar um indivíduo para tratamento com um inibidor de EGFR tirosina quinase e pelo menos um agente adicional compreendendo: (a) extrair DNA genômico de um espécime embebido em parafina fixada em formalina, obtido a partir do indivíduo; (b) gerar uma biblioteca compreendendo os amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer, a dita pluralidade de genes relacionados ao câncer compreendendo AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN, em que (i) gerar a dita biblioteca procede independentemente do uso de um conjunto de isca compreendendo sequências de ácido nucleico que são complementares a pelo menos uma da pluralidade de amplicons, e (ii) a qualidade do DNA genômico extraído do espécime embebido em parafina fixada em formalina não é avaliada usando PCR quantitativa antes de gerar a biblioteca; (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos uma da pluralidade de amplicons; e (d) selecionar o indivíduo para tratamento com um inibidor de EGFR tirosina quinase e pelo menos um agente adicional, se uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a EGFR, e uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a KRAS, PIK3R1 e BRAF forem detectadas.
[00142] Em algumas modalidades do método, o pelo menos um agente adicional é selecionado de inibidores de BRAF, inibidores de RAF/MEK/ERK, inibidores de trajeto de PI3K/AKT/mTor ou qualquer combinação destes.
Kits
[00143] A presente descrição também fornece kits para detectar alterações em sequências alvo de ácido nucleico que correspondem ao conjunto pré-selecionado de genes relacionados ao câncer aqui descrito.
[00144] Kits da presente tecnologia compreendem um ou mais pares de iniciador que hibridizam seletivamente e são usados na amplificação de um ou mais dos genes selecionados do grupo que consiste em AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN.
[00145] Em algumas modalidades, os kits da presente tecnologia compreendem um único par iniciador que hibridiza em uma região ou exon de um único gene selecionado do grupo que consiste em AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN. Em outras modalidades, os kits da presente tecnologia compreendem múltiplos pares de iniciador que hibridizam em uma ou mais regiões ou exons de um único gene selecionado do grupo que consiste em AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN. Em certas modalidades, os kits da presente tecnologia compreendem múltiplos pares de iniciador compreendendo um único par iniciador que hibridiza especificamente em uma região ou exon de um único gene para cada um de AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN. Em certas modalidades, os kits da presente tecnologia compreendem múltiplos pares de iniciador compreendendo mais de um par iniciador que hibridiza em uma ou mais regiões ou exons para cada um de AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN.
[00146] Assim, contempla-se aqui que os kits da presente tecnologia podem compreender pares de iniciador que reconhecem e hibridizam especificamente em uma ou mais regiões ou exons de um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN. Alternativamente, o kit pode compreender pares de iniciador que detectarão uma ou mais mutações selecionadas do grupo que consiste em BRAF V600E, BRAF V600K, BRAF K483Q, BRAF G466V, BRAF G464V, BRAF E501V, BRAF E501K, EGFR ΔE746_A750, EGFR R680Q, EGFR G598E, KRAS A146T, KRAS R68M, KRAS L19F, KRAS G12V, KRAS G12D, KRAS G12C, KRAS G13D, KRAS G13C, KRAS G12A, KRAS G12S, KRAS Q22K, NRAS Q61K, NRAS Q61R, NRAS G12R, NRAS G12D, PIK3CA C420R, PIK3CA G106R, PIK3CA R38H, PIK3CA E453K, PIK3CA H1044R, PIK3CA N1044K, PIK3CA E545K, PIK3CA Q546H, PIK3CA H1047R, PIK3CA H1043L, PIK3CA M1043V, PIK3CA E542K, PIK3CA E542Q, PIK3CA T1053A, PIK3CA I121V, PIK3CA H1047L, ERBB2 L755S, ERBB2 S310Y, ERBB2 D769Y, ERBB2 S255R, DDR2 H92Y, DDR2 R31L, DDR2 L34P, DDR2 P381R e DDR2 K392N.
[00147] Em algumas modalidades, os kits compreendem um ou mais pares de iniciador descritos na tabela 1. Em algumas modalidades, os kits compreendem um ou mais pares de iniciador descritos na tabela 2. Em algumas modalidades, os kits compreendem dois ou mais pares de iniciador descritos na tabela 1 e/ou tabela 2.
[00148] Em algumas modalidades, os kits compreendem adicionalmente tampões, enzimas com atividade de polimerase, enzimas com atividade de polimerase e ausência de atividade de exonuclease 5'^3’, ou tanto atividade de exonuclease 5'^3’ quanto 3’^5', cofatores de enzima tal como magnésio ou manganês, sais, nucleotídeos de extensão de cadeia tais como desoxinucleosídeo trifosfatos (dNTPs), dNTPs modificados, dNTPs resistentes à nuclease ou dNTPs marcados, necessariamente para realizar um ensaio ou reação, tal como amplificação e/ou detecção de alterações em sequências alvo de ácido nucleico que correspondem ao conjunto específico de genes relacionados ao câncer aqui descrito.
[00149] Em uma modalidade, os kits da presente tecnologia compreendem adicionalmente uma sequência de ácido nucleico controle positiva e uma sequência de ácido nucleico controle negativa para garantir a integridade do ensaio durante corridas experimentais. Um kit pode conter adicionalmente um meio para comparar os níveis e/ou atividade de um ou mais do conjunto pré-selecionado de genes relacionados ao câncer aqui descritos, em uma amostra de tumor, com uma amostra de ácido nucleico de referência (por exemplo, uma amostra não relacionada ao tumor). O kit também pode compreender instruções para uso, software para análise automatizada, recipientes, embalagens tal como embalagem pretendida para venda comercial e similares.
[00150] Os kits da presente tecnologia também podem incluir outros reagentes necessários para realizar qualquer das técnicas NGS aqui descritas. Por exemplo, o kit pode compreender adicionalmente um ou mais de: sequência adaptadoras, código de barra sequências, tubos de reação, ligases, tampões de ligase, tampões e/ou reagentes de lavagem, tampões e/ou reagentes de hibridização, tampões e/ou reagentes de marcação e meios de detecção. Os tampões e/ou reagentes são em geral otimizados para a técnica de amplificação/detecção particular, para a qual o kit é pretendido. Os protocolos para usar estes tampões e reagentes, para realizar diferentes etapas do procedimento, também podem ser incluídos no kit.
[00151] Os kits da presente tecnologia podem incluir componentes que são usados para preparar ácidos nucleicos de uma amostra de teste de tumor sólido para a amplificação e/ou detecção subsequente de alterações em sequências alvo de ácido nucleico que correspondem ao conjunto específico de genes relacionados ao câncer aqui descrito. Tais componentes de preparação de amostra podem ser usados para produzir extratos de ácido nucleico de amostras de tecido. As amostras de teste usadas nos métodos descritos anteriormente variarão com base em fatores, tais como o formato do ensaio, natureza do método de detecção e dos tecidos específicos, células ou extratos usados como a amostra teste a ser avaliada. Métodos de extrair ácidos nucleicos de amostras são bem conhecidos na técnica e podem ser facilmente adaptados para obter uma amostra que é compatível com o sistema utilizado. Os sistemas de preparação de amostra automatizados para extrair ácidos nucleicos de uma amostra de teste são disponíveis comercialmente, por exemplo, sistema Roche Molecular Systems’ COBAS AmpliPrep, Qiagen's BioRobot 9600, e sistemas de preparação de amostra Applied Biosystems' PRISM™ 6700.
EXEMPLOS Exemplo 1: Modelo do ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia
[00152] Os esforços de experimentação inicial foram direcionados para projetar um ensaio de triagem de tumor sólido mais focused e altamente sensível, que pode fornecer uma visão geral das mutações clinicamente relevantes em múltiplos tipos de tumor sólido, usando ao mesmo tempo quantidades muito pequenas de DNA derivadas de amostras de tecido de FFPE (~10 ng). Um conjunto de 34 genes relacionados ao câncer foi cuidadosamente selecionado com base das recomendações da diretriz de NCCN, prevalência de mutações somáticas em tumores sólidos, e potencial para informar a seleção de tratamento em pacientes com tumor sólido (Tabela 3). Tabela 3: Painel de triagem de tumor sólido
[00153] Dos 34 genes selecionados, muitos apresentam mutações com significado clínico conhecido ou potencial em pelo menos 2 (65%) ou 3 (40%) tipos de tumor sólido (COSMIC, mycancergenome.org, clinicaltrials.gov). Além do mais, quase 80% destes 34 genes são mutados em pelo menos 1% dos casos de melanoma, câncer de pulmão e câncer colorretal (câncer colorretal). O painel de triagem de tumor sólido foi projetado para ensaiar mutações em sequências alvo de ácido nucleico que correspondem às regiões específicas dos 34 genes listados na tabela 3 (em vez de cada exon do gene inteiro). A seleção destas sequências alvo particulares de ácido nucleico (ou amplicons) era baseada no potencial para informar as decisões de tratamento, frequência de mutação relatada, pontos de acesso conhecidos etc.
[00154] O uso de conjuntos de isca para enriquecer sequências de ácido nucleico alvo que correspondem às regiões específicas de AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN de amostras de FFPE é significativamente ineficiente, em decorrência de experimentos de captura renderem cerca da metade do número de leituras para as sequências nucleicas alvo pesquisadas, comparado com aqueles observados com amplificação por PCR, comprometendo por meio disso a sensibilidade total do ensaio de triagem.
[00155] Como tal, tentativas subsequentes focaram no desenvolvimento de um ensaio de triagem NGS, que foi totalmente baseado em PCR (isto é, preparação de biblioteca a base de amplicon seguida por NGS), a fim de detectar alterações genéticas em amplicons que correspondem às regiões específicas de AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN. Um dos desafios técnicos que surgiu durante o desenvolvimento do método de PCR multiplex aqui descrito foi a seleção ideal de mais de cem pares de iniciador que hibridizam e amplificam simultaneamente sequências alvo de ácido nucleico, que correspondem às regiões específicas dos 34 genes relacionados ao câncer aqui descritos em uma única reação. Atingir o equilíbrio ideal de pares de iniciador foi uma preocupação significativa, em decorrência de diferenças na eficiência de anelamento de diferentes resultados de pares de iniciador em uma tendência forte na amplificação dos diferentes amplicons, levando à contemplação insuficiente de alguns amplicons em uma amostra, e reduzindo muito a sensibilidade do ensaio. A fim de maximizar o a capacidade de sequenciamento, os níveis de amplificação podem ser similares entre todos os amplicons. Além disso, a presença de um grande número de diferentes iniciadores resulta em um risco muito maior de formação de dímero iniciador, diminuindo a possibilidade de amplificar de maneira reprodutível pequenas quantidades de ácidos nucleicos alvos. Para explicar a fragmentação observada com DNA de FFPE, os amplicons foram determinados como 126183 bp. O conjunto otimizado de pares de iniciador de PCR usados nos métodos da presente tecnologia é descrito nas tabelas 1 e 2.
Exemplo 2: Reprodutibilidade e sensibilidade analítica do ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia
[00156] Reprodutibilidade. A precisão inter-ensaio do desempenho do sequenciamento foi avaliada testando três espécimes clínicos de FFPE contendo variações conhecidas (BRAF G466Y, TP53 R175H, DDR2 L34P, EGFR E865G, EGFR E866V, TP53 R248W, Notch Q2406Δ, TP53 A159_M160insRA), com frequências de mutação variando entre 4,6% e 62,3% em relação a três corridas diferentes. Vide figura 2. Para a precisão do intra-ensaio, três espécimes de FFPE preparados de linhagens celulares que abrigam variações conhecidas (2 SNV e 1 DEL), com frequências de mutação variando entre 4,8% e 43%, foram ensaiados em uma única corrida. Vide figura 3.
[00157] Da maneira mostrada na figura 2 e figura 3, todas as variações de baixa frequência esperadas foram detectadas em inter e intra-ensaios realizados em réplicas. O SD de frequência de variação de inter e intra- ensaios para todas as variações testadas variou de 0,11% a 4,5% e 0,6% a 1,9%, respectivamente, indicando que o ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia é altamente reprodutível.
[00158] Sensibilidade analítica. Para demonstrar a sensibilidade analítica do ensaio, espécimes clínicos de FFPE com frequências de mutação conhecidas que variam entre 14% a 78% foram misturados com DNA de tecido de FFPE que não continham mutações nas regiões de interesse, em diferentes razões. Os espécimes clínicos de FFPE foram misturados em percentuais que variam de 2,5% a 78,0%. Vide tabela 4. Tabela 4: Ensaio de sensibilidade do tumor *Não detectado por Variant Caller, mas visivelmente presente em arquivos BAM e números de leitura bruta fornecidos (inserção não interrompe leituras diretas/reversas em IGV. Não detectado indica variação presente em <2% ou completamente ausente.
[00159] Variações em nove regiões alvo foram detectadas, sete das quais (2 INDELs e 5 SNPs) foram detectadas na amostra mista em 5% ou próximo a este (5%-7%). As variações não foram detectadas na amostra mista em <2m5%. Embora INDELs não fossem detectáveis na amostra mista em 5% ou próximo a este, as frequências observadas de algumas eliminações tenderam a ser menores que a esperada (2,5-5%). Portanto, com base nestes dados, a sensibilidade analítica deste ensaio foi definida como 5% para SNPs e 10% para INDELs.
Exemplo 3: Métodos para validar a eficiência do ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia com amostras de FFPE
[00160] Este exemplo demonstra que o ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia melhorou a amplitude de contemplação e sensibilidade com relação aos métodos de sequenciamento de Sanger, e pode perfilar eficientemente mutações acionáveis em genes clinicamente relevantes em vários tipos do principal tumor sólido.
[00161] Pacientes e espécimes. Este estudo incluiu amostras de FFPE descaracterizadas submetidas ao Quest Diagnostics Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA, para análise do marcador de tumor. O diagnóstico de cada câncer foi confirmado por revisão da patologia. Um total de 133 amostras de FFPE foram inicialmente coletadas. Doze espécimes foram excluídos em decorrência de rendimento insuficiente de DNA (<10 ng) e 121 espécimes de tumor (33 de câncer colorretal, 27 de câncer de pulmão, 31 de melanoma e 30 de câncer de mama) foram incluídos neste estudo.
[00162] As características clínicas dos 121 pacientes que forneceram os espécimes de tumor utilizados são mostradas na figura 1. A idade média dos pacientes para cada tipo de câncer variou entre 57 e 68 anos. A fonte de tecido mais comum para espécimes de melanoma, câncer de pulmão e câncer colorretal foi excisão, enquanto a maioria dos espécimes de câncer de mama foram originados de biópsias. Os pacientes em estágio IV representam 35,5% e 27,3% de melanoma, e espécimes de câncer colorretal, respectivamente. Os pacientes em estágio I representam 57% de espécimes de câncer de mama. As determinações de grau de tumor mais frequentes foram “pouco diferenciadas” em câncer de pulmão (37%) e câncer de mama (40%), e “moderadamente diferenciadas” em câncer colorretal (39.4%); não houve nenhuma informação de classificação disponível para a maioria dos espécimes de melanoma (83,9%). Vide figura 1.
[00163] Extração de DNA. As lâminas coradas com hematoxilina e eosina para cada amostra foram analisadas por um patologista para identificar áreas ricas em tumor, e estimar a fração do tumor. As amostras de FFPE contendo >25% de células de tumor (com base na morfologia) em uma área selecionada foram incluídas no estudo. As seções foram submetidas à macrodissecção manual, e o DNA total foi extraído de um a cinco seções de 10-μm não coradas, dependendo da área do tumor, usando kit de extração de DNA da Roche (Roche Molecular Diagnostics, Indianapolis, IN). A quantificação do DNA foi realizada usando um kit de ensaio Qubit DNA HS (Life Technologies, Carlsbad, CA). Amostras com pelo menos 10 ng de DNA foram selecionadas pra análise NGS. Nenhuma avaliação adicional da qualidade do DNA genômico extraído foi realizada antes de gerar a biblioteca a base de amplicon (isto é, a qualidade do DNA genômico extraído não foi avaliada usando PCR quantitativa). Isto é em decorrência de estudos de comparação anteriores revelarem que não houve nenhuma melhoria significativa em usar métodos de controle de qualidade a base de qPCR, antes de realizar os métodos a base de NGS da presente tecnologia comparado à quantificação Qubit (dados não mostrados).
[00164] Preparação da biblioteca por Ion Torrent PGM. Uma biblioteca de amplicon por PCR foi gerada a partir do DNA genômico extraído de cada amostra. As regiões alvejadas nos 34 genes foram amplificadas usando 231 pares de iniciador (listados nas tabelas 1 e 2) em dois agrupamentos de iniciador.
[00165] Resumidamente, PCR foi realizada em volumes 2x10-μL, cada qual contendo 5 a 20 ng de DNA genômico; iniciadores diretos e reversos listados tanto na tabela 1 quanto 2 (concentrações de iniciador otimizadas por amplificação equilibrada); 440 μM (cada) de dATP, dCTP, dGTP e dTTP; MgCl2 5 mM; KCl 57 mM; e 0,6 unidades de Gold Polimerase (Celera, Alameda, CA). A amplificação por PCR foi realizada em um termociclador ABI9700 nas seguintes condições:
[00166] Os adaptadores de sequenciamento com intervalos curtos de sequências de índice (kit Ion Xpress™ Barcode Adapters 1-16, Life Technologies, Carlsbad, CA) que possibilitam a amostra multiplexar foram ligados aos amplicons usando o kit de biblioteca de DNA PrepX PGM no sistema Apollo 324 (Wafergen Biosystems, Fremont, CA). A biblioteca de amplicon foi então cortada-traduzida usando Platinum PCR SuperMix de alta fidelidade nas seguintes condições: 1 ciclo a 72 °C por 20 minutos e 1 ciclo a 95 °C por 5 minutos. A biblioteca foi quantificada usando o kit de ensaio Qubit DNA HS (Life Technologies, Carlsbad, CA).
[00167] Preparação de molde de sequenciamento. As bibliotecas agrupadas foram criadas diluindo amostras de quatro pacientes (cada uma com código de barras distinto da maneira descrita anteriormente) para equilibrar as concentrações e gerar uma concentração de biblioteca de trabalho final de 10 pmol/L. Cada agrupamento de biblioteca continha uma amostra de DNA controle positivo, que abriga 8 variações com frequências conhecidas (Horizon Diagnostics, Waterbeach, Cambridge, UK). Cada agrupamento de biblioteca foi submetido à PCR de emulsão (E-PCR) usando um kit Ion OneTouch 2 template em um sistema Ion One-Touch 2 (Life Technologies, Carlsbad, CA), de acordo com o protocolo do fabricante. O kit de controle de qualidade Qubit Ion Sphere (Life Technologies, Carlsbad, CA) foi usado para estimar o percentual das partículas de esfera de íon (ISPs) com DNA molde amplificado. O enriquecimento de ISPs foi atingido usando o kit Ion OneTouch no IT OneTouch ES (Life Technologies, Carlsbad, CA), de acordo com o protocolo do fabricante.
[00168] Sequenciamento. ISPs enriquecidas foram submetidas ao sequenciamento em um chipe Ion 318, usando o kit de sequenciamento Ion PGM (Life Technologies, Carlsbad, CA), de acordo com as instruções do fabricante.
[00169] Análise dos dados. As leituras de sequência da biblioteca Ion Torrent PGM foram alinhadas usando o software Ion Torrent Suite versão 3.4 (Life Technologies, Carlsbad, CA). As variações foram denominadas usando o denominador de variação Ion Torrent, usando um conjunto de parâmetros adaptados. As medições foram calculadas a partir dos arquivos BAM, incluindo contemplação para as regiões de interesse (ROI). A contemplação da leitura foi calculada como o número de leituras através de ROI, onde a classificação Q média para bases na leitura excedeu Q20. Amostras com pelo menos 95% de amplicons com >300 leituras com uma pontuação de qualidade média de Q20 ou mais foram consideradas sequenciadas satisfatoriamente. Em relação a uma variação de sequência a ser considerada autêntica, a contemplação do sequenciamento de pelo menos 300 leituras Q20 ou 10 leituras de variação, e uma frequência de variação relatada de pelo menos 4% foram exigidas. Medições adicionais registradas incluíram se a variação ocorreu em regiões de homopolímero ou adjacentes à esta, o número de bases na variação, e as tendências da fita de leitura. As medições para as variações foram integradas em uma aplicação de software personalizado, revisão de mutação CLS, que também pode também acessar diretamente o leitor de genoma integrado (IGV) para visualização focada das leituras alinhadas e variação identificada. Revisão manual de todas as variações foi realizada usando o pedido de revisão de mutação CLS. As variações e posições de população com características técnicas conhecidas, que foram identificadas a partir de estudos de validação do ensaio, foram marcadas no pedido para auxiliar a revisão.
[00170] Contemplação de amplicon. Todos os 121 espécimes foram sequenciados. Em média, 98,6% (faixa de 95-100%, 2,63 SD) de todos os amplicons atendem os critérios mínimos por amplicon de >300 leituras, indicando contemplação adequada de amplicon para todos os 121 espécimes.
[00171] Sequenciamento de Sanger. Os ensaios de sequenciamento de Sanger foram realizados por métodos padrões. Os genes específicos e exons testados dependeram do tipo de câncer, mas incluíram EGFR, KRAS, HRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, TP53, e KIT.
[00172] Imuno-histoquímica. Teste de receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (PR), e de imuno-histoquímica HER-2 (IHC) foram realizados usando ensaios padrões. As lâminas coradas foram revisadas e classificadas como positivas para ER e PR quando >1% de células de tumor exibiram coloração nuclear positiva. Em relação ao ensaio HER-2, as lâminas foram classificadas como negativas, equívocas ou positivas com base nas diretrizes CAP.
[00173] FISH. Kits comerciais foram usados para avaliar a amplificação de gene HER-2 (Kit de sonda de DNA Vysis PathVysion™ HER-2; Abbott Laboratories, Des Plaines, IL), translocação de ALK (Kit de sonda Vysis LSI ALK Break Apart Rearrangement Abbott Laboratories), e translocação de ROS1 (Kit Cytocell ROS1 Breakapart; CytoCell, Compiegne, França).
Exemplo 4: Frequência e amplitude de mutações detectadas pelo ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia
[00174] Resultados. No geral, 83% (100/121) de todos os espécimes de FFPE testados abrigavam pelo menos uma mutação, da maneira determinada pelo ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia: 74% (23/31) de amostras de melanoma; 94% (31/33) de câncer colorretal; 78% (21/27) de câncer de pulmão; e 83% (25/30) em câncer de mama (Figura 5). Uma única mutação no gene foi observada em muitos tipos de tumor, isto é, melanoma, câncer de pulmão e câncer de mama. Câncer colorretal foi a exceção, com uma maior frequência de espécimes de FFPE que abrigam mutações em dois ou mais genes. espécimes de FFPE que abrigam mutações em quatro ou mais genes foram raramente observadas em todos os tipos de tumor.
[00175] Mutações em 62% (21/34) dos genes ensaiados pelo painel de triagem de tumor sólido da presente tecnologia foram detectadas. Estas observações auxiliam a seleção da pluralidade de amplicons que são pesquisados no ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia. Dos 21 genes, BRAF, PIK3CA, PIK3R1, PTEN, e TP53 foram mutados em todos os 4 tipos de tumor; 11 genes foram mutados em pelo menos três tipos de tumor; e 17 genes foram mutados em pelo menos dois tipos de tumor (Figura 4). Além do mais, 53% de todos os tumores (64/121) abrigavam mutações em TP53.
[00176] Os únicos genes que foram observados como mutados em um tipo específico de tumor foram STK11 em câncer de pulmão; RET em câncer colorretal, e ERBB2, e ERBB4 em câncer de mama. Embora a ampla maioria de espécimes testados tenha apresentado uma única mutação no gene, pelo menos 40% de cada tipo de tumor apresentou mutações em >2 genes por espécime, e 10% a 20% de cada tipo de tumor apresentou mutações em >3 genes por espécime. Além disso, seis espécimes abrigaram duas mutações diferentes no mesmo gene. Estes achados auxiliam o uso de um único ensaio de perfil molecular para múltiplos tipos de tumor sólido.
[00177] Figura 6A mostra as mutações detectadas pelo painel de triagem de tumor sólido da presente tecnologia para cada espécime individual, para todos os tipos de tumor. Da maneira mostrada na figura 6B, BRAF foi o gene mais frequentemente mutado em amostras de melanoma (12/31; 39%) e incluiu oito espécimes com substituições de nucleotídeo único (7 em V600E [GTG>GAG] e 1 e K483Q) e 5 com substituições dinucleotídeo (V600E, GTG>GAA [n=4]; V600K, GTG>AAG [n=1]). Adicionalmente, 19% (6/31) das espécimes de melanoma apresentaram substituições NRAS de nucleotídeo único (Q61K [n=2]; Q61R [n=3]; e G12R [n=1]), uma das quais também apresentou duas mutações BRAF de co-ocorrência. Exemplos de genes mutados adicionais nos espécimes de melanoma incluíram PTEN (13%), MET e MAP2K1 (10%), PIK3CA e SMO (6%), e exemplos únicos de FGFR3, PIK3R1, EGFR, IDH1, NOTCH1, e FBXW7 (3%). As mutações TP53 também foram observadas em 7 (23%) amostras (Figura 6B).
[00178] Da maneira mostrada na figura 6C, KRAS foi o gene mais frequentemente mutado em amostras de câncer colorretal (10/33 amostras; 30%). Todas as mutações KRAS neste grupo foram substituições de nucleotídeo único (G12V [n=2], G12D [n=2], G12C [n=1], G13D [n=3], L19F [n=1], e A146T [n=1]). Adicionalmente, 24% (8/33) de amostras de câncer colorretal abrigavam substituições PIK3CA de nucleotídeo único (1 de cada tipo de G106R, R38H, E453K, H1044R, N1044K, E545K, Q546H, e C420R). As mutações BRAF foram detectadas em duas (6%) das 33 amostras de câncer colorretal (V600E [n=1] e G466V [n=1]). Exemplos de genes mutados adicionais nos espécimes câncer colorretal incluíram DDR2, IDH1, NOTCH1, PTCH1, NRAS, PIK3R1, RET, e PTEN. TP53 também foi mutado em 19 (58%) das amostras (Figura 6C).
[00179] Da maneira mostrada na figura 6D, 37% (10/27) dos espécimes de câncer de pulmão abrigaram substituições KRAS de nucleotídeo único. Estes incluíram G12V (n=4), G12C (n=1), G13C (n=1), G12A (n=1), G12S (n=1), Q22K (n=1), e A146T (n=1). Adicionalmente, 3 (11,1%) dos espécimes de câncer de pulmão abrigaram mutações EGFR (ΔE746_A750 [n=2] e R680Q [n=1]) e 3 (11%) continham mutações DDR2. Duas (7%) das 27 amostras de câncer de pulmão apresentaram mutações BRAF (G464V e E501V). Alguns espécimes com mutações KRAS apresentaram mutações de co-ocorrência em pelo menos um de EGFR, DDR2, BRAF, MET, PIK3CA, PIK3R1, PTCH1, e TP53 (Figura 6D). Uma mutação PTEN foi detectada em um espécime de câncer de pulmão junto com uma mutação de co-ocorrência em DDR2. Apenas 1 espécime de câncer de pulmão abrigou uma mutação STK11. TP53 também foi mutado em 12 (44%) dos espécimes de câncer de pulmão (Figura 6D).
[00180] Da maneira mostrada na figura 6E, ~37% dos espécimes de câncer de mama abrigaram mutações PIK3CA. Uma das amostras de câncer de mama apresentou duas mutações PIK3CA de co-ocorrência (E542Q e H1047R) e uma mutação de co-ocorrência em NOTCH1. Dois espécimes de câncer de mama (7%) abrigaram mutações ERBB2 junto com mutações PIK3CA de co-ocorrência, uma das quais apresentou duas mutações pontuais ERBB2 de co-ocorrência (L755S e S310Y). Exemplos de genes mutados adicionais em espécimes de câncer de mama incluíram PTCH1 (7%) e exemplos únicos de PIK3R1, FGFR3, PTEN, ERBB4, MET, SMO, MAP2K1, e NOTCH1 (3%). TP53 também foi mutado em 53% (16/30) dos espécimes de câncer de mama (Figura 6E).
[00181] Estes resultados demonstram que o ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia é usado na detecção de uma ampla faixa de mutações em exons ou regiões de gene especificamente alvejados de AKT1, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1, e PTEN em amostras de tecido de FFPE. Portanto, a degradação de DNA e desnaturação parcial de DNA durante incorporação dos tecidos, armazenamento a longo prazo de amostras de tecido de FFPE e a presença de inibidores de PCR potenciais em amostras de tumor não parecem influenciar a integridade do ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia.
[00182] Adicionalmente, estes resultados demonstram que o ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia é usado em métodos para detectar pelo menos uma mutação na pluralidade de genes relacionados ao câncer aqui descrito, em um indivíduo diagnosticado com câncer de mama, câncer de pulmão, câncer colorretal ou melanoma.
Exemplo 5: O Ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia apresenta melhor sensibilidade e amplitude de contemplação comparado ao sequenciamento de Sanger
[00183] Concordância de único analito de detecção de mutação entre o ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia e sequenciamento de Sanger. A solicitação dos testes de sequenciamento de Sanger para cada espécime é listada na tabela 5. Tabela 5: Testes de sequenciamento de Sanger solicitados inicialmente para os 121 espécimes de FFPE
[00184] Os resultados dos testes de sequenciamento de Sanger inicialmente solicitados foram comparados com o ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia para amostras de câncer de pulmão, câncer colorretal e de melanoma (91 espécimes totais de FFPE). Espécimes de câncer de mama não foram incluídos nesta análise em decorrência de nenhum teste de sequenciamento de Sanger ser oeferecido rotineiramente para câncer de mama.
[00185] Alguns espécimes de FFPE apresentaram múltiplos testes solicitados, rendendo 121 resultados de ensaio de sequenciamento de Sanger. 24 dos 121 ensaios de sequenciamento de Sanger tiveram mutação positiva (20%) e 97 foram negativos (80%). Ao contrário, o ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia detectou 34 mutações nos 91 espécimes de FFPE (28%), isto é, 10 resultados mais positivos, comparado àqueles observados com os ensaios de sequenciamento de Sanger inicialmente solicitados. Adicionalmente, o ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia detectou cada mutação identificada pelo sequenciamento de Sanger.
[00186] Discrepâncias entre os testes de sequenciamento de Sanger e o ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia foram descobertas para todos os 3 tipos de tumor. Vide tabela 6. Tabela 6: Discrepâncias entre os testes de sequenciamento de Sanger e o ensaio de triagem de tumor sólido da presente tecnologia a mutação dinucleotídeo, não contemplada pelo teste de Cobas bnão contemplado (sequenciado rotineiramente) por teste de sequenciamento de Sanger
[00187] Três amostras de melanoma de FFPE foram negativas para mutações BRAF, de acordo com o teste Cobas BRAF inicial e positivas de acordo com o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia (Tabela 6). Duas das três mutações foram mutações de dinucleotídeo BRAF V600E (GTG a GAA) e a outra restante foi uma mutação BRAF K483Q.
[00188] Entre os três espécimes discrepantes de câncer colorretal, dois apresentavam mutações KRAS não códon 12/13/61, e um apresentava uma mutação PIK3CA de exon 7; nenhuma destas mutações foi contemplada nos ensaios iniciais de sequenciamento de Sanger. Vide tabela 6.
[00189] Dos quatro espécimes discrepantes de câncer de pulmão, dois apresentaram mutações EGFR e dois apresentam mutação KRAS não códon 12/13/61; as mutações KRAS não foram contempladas nos ensaios iniciais de sequenciamento de Sanger em laboratório. Vide tabela 6. Adicionalmente, a detecção da eliminação EGFR de exon 19 (ΔE746-A750) demonstra que o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia pode detectar mutações em uma fração alélica menores que no sequenciamento de Sanger, e é assim mais sensível que o sequenciamento de Sanger.
[00190] Uma análise dos resultados indica que o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia apresentou melhor amplitude de contemplação e sensibilidade em relação aos métodos de sequenciamento de Sanger.
Exemplo 6: Genes adicionais não testados nos ensaios iniciais de sequenciamento de Sanger.
[00191] Melanoma: Da maneira mostrada na figura 6B, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia detectou mais 22 mutações não BRAF em 12 das 20 amostras inicialmente BRAF negativas (60%) — FBXW7 (1), MAP2K1 (1), MET (2), NRAS (6), NOTCH1 (1), PIK3CA (2), PIK3R1 (1), SMO (2), PTEN (1) e TP53 (5). Além do mais, sete dos 10 espécimes inicialmente BRAF positivos abrigaram mutações não BRAF— EGFR (1), FGFR3(1), IDH1 (1), MAP2K1 (2), MET (1), PTEN (3), e TP53 (2).
[00192] Câncer colorretal. Da maneira mostrada na figura 6C, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia detectou mutações em 22 (91%) dos 24 espécimes que foram tanto não submetidos quanto testados como negativos, de acordo com os ensaios iniciais de sequenciamento de Sanger. Estas incluíram mutações em não códon 12/13/61 KRAS (2), BRAF (3), PIK3CA (5), NRAS (1), RET (1), PTEN (1), e FGFR3 (1). Dos 8 espécimes que foram testados como positivos para KRAS, de acordo com os testes iniciais de sequenciamento de Sanger, dois abrigavam mutações PIK3CA de co-ocorrência e um abrigou uma mutação DDR2 de co-ocorrência (Figura 6C).
[00193] Câncer de pulmão: Da maneira mostrada na figura 6D, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia detectou pelo menos uma mutação em 10 (50%) dos 20 espécimes que foram testados como negativos, de acordo com os ensaios iniciais de sequenciamento de Sanger. Estas incluem mutações em KRAS, BRAF, NRAS, DDR2, MET, e EGFR. Além disso, quatro (57%) dos sete espécimes que foram positivos de acordo com o ensaio inicial de sequenciamento de Sanger também abrigavam pelo menos uma mutação adicional em EGFR, KRAS, BRAF, PIK3CA, ou MET. Notavelmente, um espécime positivo para o rearranjo ALK também abrigava uma mutação KRAS que ativa o códon 22 (Figura 6D).
[00194] Câncer de mama. O ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia foi usado para pesquisar os 30 espécimes de câncer de mama submetidos aos testes HER-2, ER e PR. Vide figura 6E. A condição HER-2 de vinte e oito dos 30 espécimes de câncer de mama de FFPE foi ensaiado por IHC e/ou FISH. Dos 22 espécimes negativos para HER-2, 11 (50%) abrigavam mutações em genes da via RTK ou PI3K: 9 mutações em PIK3CA; 2 em ERBB2; 1 em PIK3R1; 1 em PTEN; e 1 em BRAF (Figura 7). Notavelmente, todas as amostras negativas para HER-2 que abrigam mutações ERBB2 ou BRAF também apresentavam mutações PIK3CA de co-ocorrência (Figura 7). Um dos seis espécimes positivos para HER-2 também abrigava uma mutação PIK3CA. O perfil de mutação detalhado das diferentes combinações da posição HER-2, ER e PR é mostrado na figura 7.
Exemplo 7: Implicações na seleção de tratamento
[00195] Este exemplo demonstra que o perfil de mutação mais amplo pelo ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia fornece informação adicional relevante à seleção de tratamento além do sequenciamento de Sanger. Esta informação adicional foi elucidada como um resultado de genes ou regiões de gene de sequenciamento testados de maneira não típica em um dado tipo de tumor, identificando mutações de gene de co- ocorrência, e a sensibilidade elevada dos métodos aqui descritos em relação ao sequenciamento de Sanger padrão.
[00196] Da maneira mostrada nas figuras 6 (a)-(E) e figura 7, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia pode fornecer um perfil molecular mais completo para uma proporção significativa de espécimes de FFPE submetidos ao teste molecular. Por exemplo, 76% (92/121) dos espécimes de FFPE testados renderam pelo menos uma mutação de gene adicional que não foi identificado por sequenciamento de Sanger de rotina. Adicionalmente, os métodos da presente tecnologia levaram à identificação de 16 mutações acionáveis (3 BRAF em melanoma, 2 KRAS, 2 BRAF e 1 NRAS em câncer colorretal, 2 EGFR e 6 KRAS em câncer de pulmão) que não foram detectadas por sequenciamento de Sanger de rotina, que provavelmente impactaram na escolha da estratégia de tratamento.
[00197] Além do mais, as várias mutações de co-ocorrência identificadas pelos métodos da presente tecnologia são usadas para alterar ou determinar um regime de tratamento personalizado. Estas incluem consideração de terapias anti-HER-2 alternativas (por exemplo, trastuzumab emtansina), EGFR TKIs (por exemplo, gefitinib), inibidores de BRAF (por exemplo, vemurifenab ou dabrafenib), inibidores de quinase tirosina da família Src (por exemplo, dasatinib), inibidores de MEK (por exemplo, selumetinib), e/ou substituição ou remoção de terapias anti-HER-2 clássicas (por exemplo, trastuzumab), inibidores de ALK/c-MET (por exemplo, crizotinib), ou terapias anti-EGFR (por exemplo, cetuximab).
[00198] Melanoma. O inibidor de BRAF vemurafenib é a terapia alvejada mais comum para melanoma e é usado para tratar tumores positivos para mutação BRAF V600. Da maneira mostrada na tabela 5, a maioria dos espécimes de melanoma (30/31) foi submetida ao teste BRAF de rotina. 21 (68%) das 31 amostras de melanoma foram testadas como negativas, de acordo com o teste inicial de cobas BRAF. Entretanto, dois dos espécimes negativos foram identificados como abrigando variações de nucleotídeo dual de BRAF V600E, usando os métodos da presente tecnologia, e são prováveis de se beneficiar do tratamento com vemurafenib.
[00199] Adicionalmente, quatro espécimes negativos para a mutação BRAF foram identificadas abrigando mutações em NRAS (Figura 6B). Estudos clínicos mostraram que as mutações NRAS podem indicar uma perda de capacidade de resposta ao vemurafenib. Su et al., N Engl J Med 366:207215 (2012). Entretanto, estas mutações podem ser responsivos aos inibidores de MEK. Ascierto et al., Lancet Oncol. 14(3):249-56 (2013).
[00200] Dessa maneira, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia é usado para determinar se um paciente com melanoma é provável de ser responsivo ao tratamento com vemurafenib ou inibidores de MEK.
[00201] Foi também notável a alta proporção de espécimes positivos para BRAF com mutações de co-ocorrência em EGFR, MET, FGFR3, IDH1, e/ou PTEN. Figura 6B. É previsto que tais mutações de co-ocorrência afetarão respostas aos tratamentos alvejados. Além disso, uma mutação PIK3CA e uma MET foram detectadas em espécimes negativos para mutação BRAF. Figura 6B. Dessa maneira, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia é usado para determinar se um paciente com melanoma é provável de ser responsivo ao tratamento com uma droga que modula a atividade de PIK3CA ou MET.
[00202] Câncer colorretal. Dos 33 espécimes de câncer colorretal inicialmente testados por sequenciamento de Sanger para mutações KRAS, BRAF, NRAS, e/ou PIK3CA, 24 (73%) foram testados como negativos, sugerindo assim uma resposta favorável à terapia anti-EGFR. Impressionantemente, 11 (46%) dos espécimes que foram testados como negativos, de acordo com sequenciamento de Sanger, foram identificados como positivos para mutações em pelo menos um dos genes EGFR à jusante: KRAS (2), BRAF (2), NRAS (1), PIK3CA (5), ou PTEN (1) não associado a códon. Assim, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia sugeriu uma perda de capacidade de resposta à terapia anti-EGFR em 61% das amostras de câncer colorretal, ao contrário de 27% previsto por sequenciamento de Sanger de rotina.
[00203] Dessa maneira, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia é usado para determinar se um paciente com câncer colorretal é provável de ser responsivo ao tratamento com terapia anti-EGFR (por exemplo, cetuximab).
[00204] Câncer de pulmão. No total, pelo menos 37% (10/27) dos espécimes de câncer de pulmão de FFPE abrigavam mutações que sugeriam respostas ao tratamento alvejado, além do sequenciamento de Sanger de rotina fornecido. Da maneira mostrada na figura 6D, o sequenciamento de Sanger inicial dos 27 espécimes de câncer de pulmão de FFPE detectou uma mutação EGFR em um espécime, mutações KRAS em quatro, e um rearranjo ALK em dois. Os 20 espécimes restantes foram negativos para todas as mutações inicialmente testadas. Entretanto, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia identificou um espécime (que foi testado como negativo de acordo com sequenciamento de Sanger de rotina) abrigando uma mutação ativa EGFR ΔE746_A750, que apresentava uma frequência de variação abaixo de 6%.
[00205] Dessa maneira, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia é usado para determinar se um paciente com câncer de pulmão é provável de ser responsivo ao tratamento com um EGFR TKI. Em algumas modalidades, o paciente apresenta uma carga de célula de tumor baixa.
[00206] Adicionalmente, um espécime de câncer de pulmão FFPE foi testado como positivo para um rearranjo ALK, de acordo com sequenciamento de Sanger de rotina, sugerindo por meio disso uma resposta favorável ao crizotinib. Entretanto, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia identificou uma mutação ativa em KRAS (códon 22), que foi associada a uma perda de capacidade de resposta ao crizotinib.
[00207] Dessa maneira, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia é usado para determinar se um paciente com câncer de pulmão é provável de ser responsivo ao tratamento com crizotinib.
[00208] Notavelmente, os métodos da presente tecnologia identificaram mais 9 (45%) além dos 20 espécimes de câncer de pulmão que foram testados como negativo, de acordo com sequenciamento de Sanger, como sendo positivos para alterações em KRAS, BRAF, MET e DDR2. Inibidores de BRAF, vemurafenib e dabrafenib, foram adicionados à lista de diretrizes de NCCN “Available Targeted Agents with Activity against Driver Event in Lung Cancer” for specimens harboring BRAF mutations. Sánchez- Torres et al., Transl Lung Cancer Res 2(3):244-250 (2013). Adicionalmente, dasatinib é está sendo atualmente estudado para tratamento de tumores que abrigam mutações DDR2. Bail et al., Cancer Res. 27 de outubro de 2014 (epub antes da impressão).
[00209] Dessa maneira, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia é usado para determinar se um paciente com câncer de pulmão é provável de ser responsivo ao tratamento com vemurafenib, dabrafenib, dasatinib ou o inibidor de MEK selumetinib.
[00210] Câncer de mama. 28 dos 30 espécimes de câncer de mama foram submetidos aos testes HER-2, ER e PR. Destes, seis (21%) foram positivos para HER-2 e, portanto, prováveis candidatos para tratamento com trastuzumab (Figura 7). Embora cinco dos seis casos positivos para HER-2 não tenham mostrado nenhuma mutação adicional em genes da via ERBB ou PI3K, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia detectou uma mutação PIK3CA em uma amostra. Isto é significativo em decorrência das mutações PIK3CA em tumores positivos para HER-2 estarem associados à perda de capacidade de resposta às terapias anti-HER-2 convencionais (por exemplo trastuzumab e lapatinib). Berns et al., Cancer Cell 12:395-402 (2007). Entretanto, trastuzumab emtansina (Kadcyla, Genentech) pode ser eficiente no tratamento de tais tumores, uma vez que mutações PIK3CA simultâneas não parecem alterar o resultado com esta terapia alternativa (American Association for Cancer Research [AACR] 104° encontro Anual: Resumo LB-63. Apresentado em 8 de abril de 2013).
[00211] Dessa maneira, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia é usado para determinar se um paciente positivo para HER-2 diagnosticado com câncer de mama é provável de ser responsivo ao tratamento com terapias anti-HER-2 ou trastuzumab emtansina.
[00212] Metade (11/22) dos espécimes de espécimes de câncer de mama negativos para HER-2 abrigavam mutações em genes da via ERBB e/ou PI3K. Mutações em PIK3CA foram observadas na maioria, incluindo um subconjunto que abrigava mutações ERBB2 ou BRAF de co-ocorrência (Figura 7). Uma mutação em PTEN também foi observada. No geral, as frequências de mutações PIK3CA e PTEN observadas (37% e 3%, respectivamente) são consistentes com os dados TCGA (doi:10.1038/nature11412).
[00213] De maneira importante, demonstrou-se que câncer de mama que abriga mutações no domínio PIK3CA quinase ou mutações com perda de função PTEN (sem nenhuma mutação BRAF ou KRAS de co-ocorrência) responde ao tratamento com inibidores de trajeto PI3K/AKT/mTOR tal como everolimus. Sánchez-Torres et al., Transl Lung Cancer Res 2(3):244-250 (2013). É previsto que estas mutações funcionarão como biomarcadores para guiar estratégias terapêuticas que envolvem terapias anti-HER-2 e inibidores de trajeto PI3K/AKT/mTOR.
[00214] Dessa maneira, o ensaio NGS de triagem de tumor sólido da presente tecnologia é usado para determinar se um paciente diagnosticado com câncer de mama é provável de ser responsivo ao tratamento com inibidores de trajeto PI3K/AKT/mTOR.
EQUIVALENTES
[00215] A presente tecnologia não deve ser limitada em termos das modalidades particulares descritas neste pedido, que são pretendidos como ilustrações simples de aspectos individuais da presente tecnologia. Muitas modificações e variações desta presente tecnologia podem ser realizadas, sem fugir do espírito e escopo, como será evidente aos versados na técnica. Os métodos e aparelhos funcionalmente equivalentes no escopo da presente tecnologia, além daqueles aqui enumerados, serão evidentes aos versados na técnica a partir das descrições precedentes. Pretende-se que tais modificações e variações estejam no escopo da presente tecnologia. Deve-se entender que a presente tecnologia não é limitada a métodos, reagentes, compostos, composições ou sistemas biológicos particulares, que podem certamente variar. Deve-se entender também que a terminologia aqui usada é com o propósito de descrever apenas modalidades particulares, e não deve ser pretendida como limitante.
[00216] Além disso, onde características ou aspectos do descrição são descritos em termos de grupos Markush, os versados na técnica reconhecerão que a descrição também é realizada por meio de termos de qualquer elemento individual ou subgrupo de elementos do grupo Markush.
[00217] Como pode ser entendido pelos versados na técnica, para qualquer e todos os propósitos, particularmente em termos de fornecer uma descrição escrita, todas as faixas aqui descritas também incluem toda e qualquer subfaixa possível, e combinações de subfaixas destas. Qualquer faixa listada pode ser facilmente reconhecida como descrevendo e possibilitando suficientemente a mesma faixa de ser quebrada em pelo menos metades, terços, quartos, quintos, décimos iguais, etc. Como um exemplo não limitante, cada faixa aqui discutida pode ser facilmente quebrada em um terço inferior, terço médio e terço superior, etc. Será entendido também pelos versados na técnica que toda linguagem tal como “até”, “pelo menos”, “maior que”, “menor que” e similares, inclui o número citado e se refere às faixas que podem ser subsequentemente quebradas em subfaixas, da maneira discutida anteriormente. Finalmente, como será entendido pelos versados na técnica, uma faixa inclui cada elemento individual. Assim, por exemplo, um grupo com 1-3 células se refere a grupos com 1, 2 ou 3 células. Similarmente, um grupo com 1-5 células se refere a grupos com 1, 2, 3, 4 ou 5 células, e assim por diante.
[00218] Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios e publicações aqui referidos ou citados são incorporados pela referência em sua íntegra, incluindo todas as figuras e tabelas, na medida em que não sejam inconsistentes com os preceitos explícitos desta especificação.

Claims (42)

1. Método para detecção de pelo menos uma mutação em uma pluralidade de genes relacionados ao câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende (a) extrair DNA genômico a partir de uma amostra de tumor embebida em parafina fixada em formalina obtida do indivíduo; (b) gerar uma coleção compreendendo amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer, dito pluralidade de genes relacionados ao câncer compreendendo AKTI, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNALL, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STKLL, CTNNBL, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1 e PTEN, em que (i) gerar dita coleção procede independentemente do uso de um conjunto de isca compreendendo sequências de ácido nucleico que são complementares a pelo menos um da pluralidade de amplicons; e (ii) a qualidade do DNA genômico extraído da amostra de tumor embebida em parafina fixada em formalina não é acessado usando PCR quantitativo antes de gerar a coleção; (c) ligar uma sequência adaptadora às extremidades da pluralidade de amplicons; e (d) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos um da pluralidade de amplicons usando sequenciamento paralelo de alto rendimento maciço.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de amplicons é gerada por pelo menos dois pares de iniciadores selecionados a partir do grupo que consiste em:
3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a coleção compreende amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer é gerada usando não mais do que 10 ng de DNA genômico extraído da amostra de tumor embebida em parafina fixada em formalina.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a coleção compreende amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer é gerada usando 11 a 25 ng de DNA genômico extraído da amostra de tumor embebida em parafina fixada em formalina.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o sequenciamento paralelo de alto rendimento maciço é realizado usando pirossequenciamento, sequenciamento de terminador de corante reversível, sequenciamento SOLiD, sequenciamento semicondutor de íon, sequenciamento de molécula única de Helioscope, sequenciamento por síntese, sequenciamento por ligação ou sequenciamento SMRT™.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a sequência adaptadora é um adaptador P5, adaptador P7, adaptador PI, adaptador A, ou adaptador de código de barras Ion Xpress™.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de amplicons compreende adicionalmente uma sequência única de índice.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a amostra de tumor embebida em parafina fixada em formalina é um tumor heterogênio.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que 5% das células do tumor heterogênio abriga pelo menos uma mutação em pelo menos um da pluralidade de amplicons.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado com câncer de mama, melanoma, câncer colorretal ou câncer de pulmão.
11. Método para selecionar um indivíduo para tratamento com um inibidor de trajeto de PBK/AKT/MTOR e pelo menos um agente adicional, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) extrair DNA genômico de um espécime embebido em parafina fixado em formalina obtido do indivíduo; (b) gerar uma coleção compreendendo amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer, dita pluralidade de genes relacionados ao câncer compreendendo AKTI, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1 e PTEN, em que (i) gerar dita coleção procede independentemente do uso de um conjunto de isca compreendendo sequências de ácido nucleico que são complementares a pelo menos um da pluralidade de amplicons, e (ii) a qualidade do DNA genômico extraído do espécime embebido em parafina fixado em formalina não é avaliada usando PCR quantitativo antes de gerar a coleção; (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos um da pluralidade de amplicons; e (d) selecionar o indivíduo para tratamento com um inibidor do trajeto de PBK/AKT/MTOR e pelo menos um agente adicional, se uma mutação em pelo menos um dos amplicons correspondendo a PIK3CA, PIK3R1 e PTEN e uma mutação em pelo menos um dos amplicons correspondendo a NOTCH1, ERBB2, BRAF, PTCHL, SMO, EGFR, KRAS, DDR2, MAP2K1, FGFR3, NRAS, MET e FBXW7 for detectada.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que os amplicons que correspondem a PIK3CA são gerados por um par de iniciadores selecionado a partir do grupo que consiste em 5' CCTAGTAGAATGTTTACTACCAA 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' CTGCTTCTTGAGTAACACTT 3' (SEQ ID NO.:_); 5' CATGTTCATGCTGTGTATGT 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' GCTTCTTTACAAACGTTCAGAA 3' (SEQ ID NO.:_); 5' TCTATGTTCGAACAGGTATCT 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' ACTGCTAAACACTAATATAACCTTTG 3' (SEQ ID N0.:_); 5' TTGAAATGTGTTTTATAATTTAGACTAGT 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' CCATGAGGTACTGGCC 3' (SEQ ID N0.:_); 5' TTGGTGTTACTGGATCAAATC 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' TGCTGAACCAGTCAAACT 3' (SEQ ID N0.:_); 5' TATTATTTTATTTTACAGAGTAACAGACTAG 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' TTTAGCACTTACCTGTGACT 3' (SEQ ID N0.:_); 5' TGGAATGCCAGAACTACA 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' GTGGAAGATCCAATCCATTTT 3' (SEQ ID N0.:_); 5' GGAATGAATGGCTGAATTATG 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' GCGGTATAATCAGGAGTTTT 3' (SEQ ID N0.:_); 5' AGTTGGCCTGAATCACTATA 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' GATGTTACTATTGTGACGATCTC 3' (SEQ ID N0.:_); 5' GTAAGTGTTACTCAAGAAGC 3 ' (SEQ ID N0.:_) e 5' ATAGGATATTGTATCATACCAATTTCT 3' (SEQ ID N0.:_); 5' TCCACAGCTACACCATATAT 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' AGCATCAGCATTTGACTTTA 3' (SEQ ID N0.:_); 5' TACACAGACACTCTAGTATCTG 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' GAAGGTTTGACTGCCATAAA 3' (SEQ ID N0.:_); 5' ATGACAAAGAACAGCTCAAA 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' GAGATCAGCCAAATTCAGTT 3' (SEQ ID N0.:_); 5' GATGTGTTACAAGGCTTATCTA 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' GCCTCTTGCTCAGTTTTATC 3' (SEQ ID N0.:_); 5' GAGGCTTTGGAGTATTTCA 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' CTGCTGAGAGTTATTAACAGT 3' (SEQ ID N0.:_); e 5' GCTTTTGGAGTCCTATTGT 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' CACAAACTAGAGTCACACAC 3' (SEQ ID N0.:_).
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, caracterizado pelo fato de que os amplicons que correspondem a PIK3R1 são gerados por um par de iniciadores selecionado a partir do grupo que consiste em 5' GGGTTTTGGGCTGATATTA 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' CCACAGAACTGAAGGTTAAT 3' (SEQ ID NO.:_); 5' TTATCCATTGAATTTATTTTAATCTTTCTAG 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' GGGATGTGCGGGTATATT 3' (SEQ ID NO.:_); 5' GTCTTGCAGTAAGAGATTGT 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' TCTTTGCTGTACCGCT 3' (SEQ ID NO.:_); 5' GTTTCTTTTGCCTGCA 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' TGGATAAGGTCTGGTTTAATG 3' (SEQ ID NO.:_); 5' GCTACAATTCAGGATGAGTTA 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' TCTTCTGCTATCACCATCTTT 3' (SEQ ID NO.:_); 5' CCATCATGATGAGAAGACAT 3 ' (SEQ ID NO.:_) e 5' TTGCTGGAGATACATACACT 3' (SEQ ID N0.:_); 5' GTGGTCACTAAACCTTAAGA 3 ' (SEQ ID N0.:_) e 5' GGCTTACCTTAGTGTAAGAG 3' (SEQ ID N0.:_); 5' TTTCATCGAGATGGGAAATATG 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' ACCTGTTGGTATTTGGATACT 3' (SEQ ID N0.:_); 5' AGAAGATAATATTGAAGCTGTAGG 3' (SEQ ID N0.:__) e 5' AGAACTCTTATTTTTTAATCTGATTTTCA 3' (SEQ ID N0.:_); 5' GGACAGCTATTGAAGCATTTA 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' CACAAGAACAAGGGAAACAC 3 ' (SEQ ID N0.:_); 5' GCAGGCAGCTGAGTATC 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' TCATCCTGAATTGTAGCAATCA 3' (SEQ ID N0.:_).
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que os amplicons que correspondem a PTEN são gerados por um par de iniciadores selecionado a partir do grupo que consiste em 5' CAGCTTCTGCCATCTCT 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' AGCAGCCGCAGAAAT 3' (SEQ ID NO.:_); 5' GTGGCTTTTTGTTTGTTTG 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' CACTCTAACAAGCAGATAACT 3' (SEQ ID NO.:_); 5' TACTTGTTAATTAAAAATTCAAGAGTTTT 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' CTTAGCCATTGGTCAAGATC 3' (SEQ ID NO.:_); 5' ACAATCATGTTGCAGCA 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' AAAAACATCAAAAAATAACTTACCTTTT 3' (SEQ ID NO.:_); 5' AGAGGCGCTATGTGTATTA 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' CATGGAAGGATGAGAATTTCA 3' (SEQ ID NO.:_); 5' GGAAGACAAGTTCATGTACT 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' CTGTCCTTATTTTGGATATTTCTC 3' (SEQ ID NO.:_); 5' ATTAATTAAATATGTCATTTCATTTCTTTTTC 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' GCTATCGATTTCTTGATCACA 3' (SEQ ID NO.:_); 5' TGAGTCATATTTGTGGGTTTTC 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' TGATCAGGTTCATTGTCACTAA 3' (SEQ ID NO.:_); 5' TTTGATTGCTGCATATTTCAG 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' TCAAAGCATTCTTACCTTACTAC 3' (SEQ ID NO.:_); 5' TTTTAAACTTTTCTTTTAGTTGTGC 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' ACTCGATAATCTGGATGACT 3 ' (SEQ ID NO.:_); 5' CAATTTAGTGAAATAACTATAATGGAAC 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' AGTGCCACTGGTCTATAAT 3' (SEQ ID NO.:_); 5' CCTGTGAAATAATACTGGTATGT 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' CTACTTTGATATCACCACACAC 3' (SEQ ID NO.:_); 5' TAGAGCGTGCAGATAATGA 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' TCAACAACCCCCACAAA 3' (SEQ ID NO.:_); e 5' CTTTCTCTAGGTGAAGCTGTA 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' GGTTCATTCTCTGGATCAGA 3' (SEQ ID N0.:_).
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que o espécime embebido em parafina fixado em formalina é um tumor heterogênio.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que 5% a 10% das células do tumor heterogênio abriga pelo menos uma mutação em pelo menos um da pluralidade de amplicons.
17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos 10% das células do tumor heterogênio abriga pelo menos uma mutação em pelo menos um da pluralidade de amplicons.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizado pelo fato de que o inibidor do trajeto de PBK/AKT/MTOR é selecionado a partir do grupo que consiste em BKM120, BEZ235, Pictilisib (GDC-0941), LY294002, CAL-101 (Idelalisib), GNE-317, PI-3065, HS-173, PI-103, NU7441, GSK2636771, VS-5584, CZC24832, Duvelisib, TG100-115, A66, YM201636, CAY10505, GSK1059615, PF- 04691502, PIK-75, PIK-93, AS-605240, BGT226, AZD6482, Voxtalisib, Alpelisib, CUDC-907, IC-87114, Omipalisib, TGI 00713, Gedatolisib, CH5132799, PKI-402, BAY 80-6946, TGX-221, XL 147, PIK-90, PIK-293, PIK-294, 3-Metiladenina, Quercetina, Wortmannina, ZSTK474, AS-252424, AS-604850, everolimus e Apitolisib.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado como tendo câncer de mama HER-2 negativo.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em inibidores do trajeto de Notch, inibidores de BRAF, antagonistas de SMO, inibidores de MET e antagonistas de ERBB2.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que os inibidores do trajeto de Notch são selecionados a partir do grupo que consiste em FLI-06, LY411575, Dibenzazepine, RO4929097, Composto E, Z-Leu-Leu-Nle-CHO, SAHM1, TR4 e Semagacestat.
22. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que os antagonistas de SMO são selecionados a partir do grupo que consiste em Purmorphamine, Taladegib (LY2940680), Ciclopamina, Vismodegib (GDC-0449), LDE225, Glasdegib (PF-04449913), PF-5274857, TAK-441, SANT-1, BMS-833923, GANT61 e IPI-926.
23. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que os antagonistas de ERBB2 são selecionados a partir do grupo que consiste em Lapatinib, Canertinib, CP-724,714, AZD8931, AEE788, Tyrphostin AG 879, Mubritinib e Pertuzumab.
24. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que os inibidores de BRAF são selecionados a partir do grupo que consiste em GDC-0879, SB590885, Encorafenib, RAF265, TAK-632, PLX4720, CEP-32496, AZ628, Sorafenib Tosylate, Sorafenib, Vemurafenib (Zelboraf) e Dabrafenib (GSK2118436).
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado como tendo câncer colorretal.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em inibidores do trajeto de Notch, antagonistas de FGFR3 e inibidores de RAF/MEK/ERK.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que os inibidores de RAF/MEK/ERK são selecionados a partir do grupo que consiste em Vemurafenib (Zelboraf) e Dabrafenib (GSK2118436), Encorafenib, TAK-632, PLX4720, MLN2480, Cobimetinib (GDC-0973), MEK 162, R05126766, GDC-0623, VTX1 le, Selumetinib (AZD6244), PD0325901, Trametinib (GSK1120212), U0126-EtOH, PD 184352 (CI- 1040), Refametinib, PD98059, BIX02189, Binimetinib, Pimasertib (AS-703026), SL327, BIX02188, AZD8330, TAK- 733, PD318088, SCH772984 e FR 180204.
28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que os inibidores do trajeto de Notch são selecionados a partir do grupo que consiste em FLI-06, LY411575, Dibenzazepine, RO4929097, Composto E, Z-Leu-Leu-Nle-CHO, SAHM1, TR4 e Semagacestat.
29. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que os antagonistas de FGFR3 são selecionados a partir do grupo que consiste em BGJ398 (NVP-BGJ398), AZD4547, LY2874455, ácido dilático Dovitinib, Dovitinib, Dovitinib Lactato, CH5183284 e Nintedanib.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18, caracterizado pelo fato de que uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a BRAF, MAP2K1 e NRAS e uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a FGFR3 e SMO são detectadas e em que o indivíduo é diagnosticado como tendo melanoma.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente adicional é inibidores de RAF/MEK/ERK, antagonistas de FGFR3, antagonistas de SMO ou uma combinação dos mesmos.
32. Método para prever a probabilidade da falta de capacidade de resposta ao tratamento com uma terapia anti-HER-2 em um indivíduo com HER-2 positivo diagnosticado como tendo câncer de mama, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) extrair DNA genômico de um espécime embebido em parafina fixado em formalina obtido do indivíduo com HER-2 positivo; (b) gerar uma coleção compreendendo amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer, dita pluralidade de genes relacionados ao câncer compreendendo AKTI, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNA11, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1 e PTEN, em que (i) gerar dita coleção procede independentemente do uso de um conjunto de isca compreendendo sequências de ácido nucleico que são complementares a pelo menos um da pluralidade de amplicons, e (ii) a qualidade do DNA genômico extraído do espécime embebido em parafina fixado em formalina não é avaliada usando PCR quantitativo antes de gerar a coleção; (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos um da pluralidade de amplicons; e (d) identificar o indivíduo com HER-2 positivo como tendo uma probabilidade de falta de capacidade de resposta ao tratamento com uma terapia de anti-HER-2, quando uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a PIK3CA, PIK3R1 e PTEN é detectada.
33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a terapia anti-HER-2 é trastuzumab ou lapatinib.
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 33, caracterizado pelo fato de que os amplicons que correspondem a PIK3CA são gerados por um par de iniciadores selecionados a partir do grupo que consiste em 5' CCTAGTAGAATGTTTACTACCAA 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' CTGCTTCTTGAGTAACACTT 3' (SEQ ID NO.:_); 5' CATGTTCATGCTGTGTATGT 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' GCTTCTTTACAAACGTTCAGAA 3' (SEQ ID NO.:_); 5' TCTATGTTCGAACAGGTATCT 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' ACTGCTAAACACTAATATAACCTTTG 3' (SEQ ID NO.:_); 5' TTGAAATGTGTTTTATAATTTAGACTAGT 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' CCATGAGGTACTGGCC 3' (SEQ ID NO.:_); 5' TTGGTGTTACTGGATCAAATC 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' TGCTGAACCAGTCAAACT 3' (SEQ ID NO.:_); 5' TATTATTTTATTTTACAGAGTAACAGACTAG 3' (SEQ ID NO.:_) e 5' TTTAGCACTTACCTGTGACT 3' (SEQ ID N0.:_); 5' TGGAATGCCAGAACTACA 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' GTGGAAGATCCAATCCATTTT 3' (SEQ ID N0.:_); 5' GGAATGAATGGCTGAATTATG 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' GCGGTATAATCAGGAGTTTT 3' (SEQ ID N0.:_); 5' AGTTGGCCTGAATCACTATA 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' GATGTTACTATTGTGACGATCTC 3' (SEQ ID N0.:_); 5' GTAAGTGTTACTCAAGAAGC 3 ' (SEQ ID N0.:_) e 5' ATAGGATATTGTATCATACCAATTTCT 3' (SEQ ID N0.:_); 5' TCCACAGCTACACCATATAT 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' AGCATCAGCATTTGACTTTA 3' (SEQ ID N0.:_); 5' TACACAGACACTCTAGTATCTG 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' GAAGGTTTGACTGCCATAAA 3' (SEQ ID N0.:_); 5' ATGACAAAGAACAGCTCAAA 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' GAGATCAGCCAAATTCAGTT 3' (SEQ ID N0.:_); 5' GATGTGTTACAAGGCTTATCTA 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' GCCTCTTGCTCAGTTTTATC 3' (SEQ ID N0.:_); 5' GAGGCTTTGGAGTATTTCA 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' CTGCTGAGAGTTATTAACAGT 3' (SEQ ID N0.:_); e 5' GCTTTTGGAGTCCTATTGT 3' (SEQ ID N0.:_) e 5' CACAAACTAGAGTCACACAC 3' (SEQ ID N0.:_).
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34, caracterizado pelo fato de que o indivíduo com HER-2 positivo é tratado com trastuzumab emtansina, quando uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a PIK3CA, PIK3R1 e PTEN é detectada.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 35, caracterizado pelo fato de que o status de HER-2 positivo do indivíduo é ensaiado por imuno-histoquímica (IHC) ou hibridação fluorescente IN SITU (FISH).
37. Método para selecionar um indivíduo para tratamento com um inibidor de EGFR tirosina quinase e pelo menos um agente adicional, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) extrair DNA genômico de um espécime embebido em parafina fixado em formalina obtida do indivíduo; (b) gerar uma coleção compreendendo amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer, dita pluralidade de genes relacionados ao câncer compreendendo AKTI, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNALL, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STK11, CTNNB1, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1 e PTEN, em que (i) gerar dita coleção procede independentemente do uso de um conjunto de isca compreendendo sequências de ácido nucleico que são complementares a pelo menos um da pluralidade de amplicons, e (ii) a qualidade do DNA genômico extraído do espécime embebido em parafina fixado em formalina não é avaliada usando PCR quantitativo antes de gerar a coleção; (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos um da pluralidade de amplicons; e (d) selecionar o indivíduo para tratamento com um inibidor de EGFR tirosina quinase e pelo menos um agente adicional, se uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a EGFR e uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a KRAS, PIK3R1 e BRAF forem detectadas.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o espécime embebido em parafina fixado em formalina é um tumor heterogênio.
39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que 5% a 10% das células do tumor heterogênio abriga pelo menos uma mutação em pelo menos um da pluralidade de amplicons.
40. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que pelo menos 10% das células do tumor heterogênio abriga pelo menos uma mutação em pelo menos um da pluralidade de amplicons.
41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 40, caracterizado pelo fato de que o inibidor de EGFR tirosina quinase é gefitinib ou erlotinib.
42. Método para prever a probabilidade de capacidade de resposta ao tratamento com vemurafenib em um indivíduo diagnosticado como tendo melanoma, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) extrair DNA genômico de um espécime embebido em parafina fixado em formalina obtida do indivíduo; (b) gerar uma coleção compreendendo amplicons que correspondem a cada um da pluralidade de genes relacionados ao câncer, dita pluralidade de genes relacionados ao câncer compreendendo AKTI, ERBB2, FOXL2, IDH2, NRAS, RET, ALK, ERBB4, GNALL, KIT, PDGFRA, SMO, BRAF, FBXW7, GNAQ, KRAS, PIK3CA, STKLL, CTNNBL, FGFR2, GNAS, MAP2K1, PIK3R1, TP53, DDR2, FGFR3, HRAS, MET, PTCH1, EGFR, FGFR4, IDH1, NOTCH1 e PTEN, em que (i) gerar dita coleção procede independentemente do uso de um conjunto de isca compreende sequências de ácido nucleico que são complementares a pelo menos um da pluralidade de amplicons, e (ii) a qualidade do DNA genômico extraído do espécime embebido em parafina fixado em formalina não é avaliada usando PCR quantitativo antes de gerar a coleção; (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos um da pluralidade de amplicons; e (d) identificar o indivíduo como tendo pelo menos um de uma alta probabilidade de capacidade de resposta ao tratamento com vemurafenib quando uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a BRAF é detectada e uma baixa probabilidade de capacidade de resposta ao tratamento com vemurafenib quando uma mutação em pelo menos um dos amplicons que correspondem a NRAS é detectada.
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