CN107949642A

CN107949642A - 用于筛选实体瘤的组合物和方法

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Publication number: CN107949642A
Application number: CN201580081930.7A
Authority: CN
Inventors: H·桑德; K·曲; J·普兰特斯; F·瓦尔德曼
Original assignee: Quest Diagnostics Investments LLC
Current assignee: Quest Diagnostics Investments LLC
Priority date: 2015-05-27
Filing date: 2015-10-28
Publication date: 2018-04-20
Anticipated expiration: 2035-10-28
Also published as: WO2016190897A1; CA2986685A1; US10689710B2; BR112017025254A2; US11981966B2; US20180142304A1; MX2023001945A; CA3235175A1; BR122023026077A2; US20200385817A1; CN107949642B; MX2017015210A; EP3303610A1; EP3303610A4; CN114807367A; EP3303610B1

Abstract

本技术涉及用于确定诊断患有乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤或肺癌的患者是否受益于使用单独的治疗剂或治疗剂的特定组合的治疗或预测其是否将对所述治疗响应的方法。这些方法基于筛选患者的实体瘤并检测对应于一组特定的癌症相关基因的靶核酸序列的改变。还提供了用于实践该方法的试剂盒。

Description

用于筛选实体瘤的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求保护2015年5月27日提交的美国申请号62/166,996、2015 年10月27日提交的美国申请号62/246,895的优先权和权益，其内容在本文通过引用以其整体并入。

技术领域

本技术涉及用于确定诊断患有乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤或肺癌的患者是否受益于使用单独的治疗剂或与其他治疗剂的特定组合的治疗或预测其是否将对所述治疗响应的方法。这些方法基于筛选患者的实体瘤并检测对应于一组特定的癌症相关基因的靶核酸序列的改变。还提供了用于实践该方法的试剂盒。

背景

提供本技术背景的下述说明简单地作为理解本技术的辅助且并非是对本技术介绍或构成现有技术的承认。

开发伴随诊断具有改善患者治疗效果并消除了保险公司对昂贵但无效的治疗方法进行支付的需要。随着涉及癌症的基因数量持续增长，越来越明显的是，对确定个体患者肿瘤的基因改变的仔细表征通常将有助于确定最佳治疗策略。例如，Foundation提供大型实体瘤筛选面板，其使用DNA 或RNA诱饵文库(例如)询问超过300个癌症相关基因的全部编码序列和28个基因重排。这样的测定需要至少50ng的肿瘤DNA输入。然而，由于肿瘤DNA是从福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织中分离出来的，所以用于这种综合研究的DNA的量通常是有限的且质量差。FFPE过程经常将DNA降解成小片段，并有可能破坏DNA碱基对本身。

TruSight^TMTumor(Illumina公司)是一个现有的基于PCR的NGS肿瘤筛选面板的实例，其询问一组较窄的癌症相关基因(在26个基因内的174个扩增子)，并且需要最少30ng的DNA输入。然而，这种方法需要在生成基于扩增子的文库之前经由定量PCR评估从FFPE肿瘤样品中提取的基因组DNA的质量，因为组织面积和DNA产量都不足以预测文库性能。参见TruSight^TM肿瘤数据表(Illumina公司)；从FFPE样本生成序列库，白皮书(Illumina公司)。

由于肿瘤样品中的细胞在肿瘤之间(肿瘤间异质性)和单独的肿瘤本身内部(肿瘤内异质性)之间可能表现出高度的分子变异这一事实，检测FFPE组织中可行的遗传改变更加复杂。在白血病、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌和妇科癌中已观察到肿瘤异质性。因此，活检中的小部分细胞可能不能代表整个肿瘤块，这可能导致对于给定的遗传改变的假阴性估计·。

肿瘤内异质性也可以至少部分解释为什么最初对癌症药物反应良好的一些患者最终复发，通常是新的肿瘤不再对治疗产生响应。肿瘤内的细胞多样性越高，偶有细胞可能能够适应药物施加的压力类型的风险就越大。对抗癌药物的获得性抗性可能通过各种机制建立(Chong C.&P.,Nat.Med.19: 1389–1400(2013)；Katayama等,Sci.Transl.Med.4(120):120ra17(2012))。例如，尽管抑制了原癌基因，抗性细胞可以开发补偿性信号通路，或“旁路途径”，即重新激活关键的下游增殖和存活信号(Niederst&Engelman,Sci.Signal. 6:re6(2013))。因此，癌细胞的异质性在设计有效的治疗策略中引入重大挑战，特别是当在活检中未检测到特定的基因突变时。

因此，实质上需要更强大和敏感的方法来有效地检测高度异质性肿瘤样品(特别是FFPE组织中)存在的遗传改变。这样的方法将有助于预测个体患者对特定药物治疗方案的响应性以及开始时确定最佳治疗策略。

本发明技术的概述

本文公开的方法和组合物涉及可预测诊断患有乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤或肺癌的受试者对具有治疗方案的响应性的突变的检测。另一方面，本发明技术的方法和组合物可用于为诊断患有乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤或肺癌的受试者选择或设计最佳治疗方案。预期本文公开的方法允许迅速和敏感地检测下述靶核酸序列中的突变：AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、 RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、 KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、 DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1 和PTEN。在一些实施方案中，所述治疗方案包括一种或多种抗HER-2疗法、 PI3K/AKT/mTor通路抑制剂、受体酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)、Notch通路抑制剂、BRAF抑制剂、SMO拮抗剂、ALK/MET抑制剂、ERBB2拮抗剂、FGFR3 拮抗剂和RAF/MEK/ERK抑制剂。

一方面，本发明提供用于在受试者中的多个癌症相关基因中检测至少一种突变的方法，其包括：(a)从获得自所述受试者的福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取基因组DNA；(b)生成包含对应多个癌症相关基因的每一种的扩增子的文库，所述多个癌症相关基因包含AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、 NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、 GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1 和PTEN，其中(i)独立于使用包含与所述多个扩增子中的至少一个互补的核酸序列的诱饵集进行所述文库的生成；和(ii)在生成所述文库前不使用定量 PCR评估自所述福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取的基因组DNA的质量；(c)将接头序列与所述多个扩增子的末端连接；和(d)使用高通量大规模平行测序在多个扩增子的至少一种中检测至少一种突变。

在所述方法的一些实施方案中，多个扩增子通过表1、表2或其组合所公开的至少两个引物对生成。

在所述方法的一些实施方案中，检测到的至少一种突变是EGFR、KRAS、 BRAF、NRAS、ERBB2或PIK3CA中的突变。在一个实施方案中，检测到的至少一种突变选自下组：BRAFV600E、BRAF V600K、BRAF K483Q、BRAF G466V、BRAF G464V、BRAF E501V、BRAF E501K、EGFR△E746_A750、 EGFR R680Q、EGFR G598E、KRAS A146T、KRAS R68M、KRAS L19F、KRAS G12V、KRAS G12D、KRAS G12C、KRAS G13D、KRAS G13C、KRAS G12A、 KRAS G12S、KRAS Q22K、NRASQ61K、NRAS Q61R、NRAS G12R、NRAS G12D、PIK3CA C420R、PIK3CA G106R、PIK3CA R38H、PIK3CA E453K、 PIK3CA H1044R、PIK3CA N1044K、PIK3CA E545K、PIK3CA Q546H、PIK3CAH1047R、PIK3CA H1043L、PIK3CA M1043V、PIK3CA E542K、PIK3CA E542Q、 PIK3CA T1053A、PIK3CA I121V、PIK3CA H1047L、ERBB2L755S、ERBB2 S310Y、ERBB2D769Y、ERBB2S255R、DDR2H92Y、DDR2R31L、DDR2L34P、 DDR2P381R和DDR2K392N。

在所述方法的一些实施方案中，使用11-25ng的从福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取的基因组DNA生成包含对应多个癌症相关基因的每一种的扩增子的文库。

在所述方法的一些实施方案中，使用不多于10ng的从福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取的基因组DNA生成包含对应多个癌症相关基因的每一种的扩增子的文库。

在一些实施方案中，所述高通量大规模平行测序使用下述实施：焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、Helioscope单分子测序、合成测序、连接测序或SMRT^TM测序。

在所述方法的一些实施方案中，接头序列是P5接头、P7接头、P1接头、 A接头或IonXpress^TM条码接头。

此外或可替换地，在一些实施方案中，所述多个扩增子进一步包含特有的索引序列。

在一些实施方案中，所述福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品是异质性肿瘤。在一些实施方案中，5％的所述异质性肿瘤的细胞在所述多个扩增子的至少一种中含有至少一种突变。

在所述方法的一些实施方案中，所述受试者诊断患有乳腺癌、黑色瘤、结肠直肠癌或肺癌。

另一方面，本发明提供选择用于以PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂和至少一种其他作用剂治疗的受试者的方法，其包括：(a)从获得自受试者的福尔马林固定石蜡包埋的样本提取基因组DNA；(b)生成包含对应多个癌症相关基因的每一种的扩增子的文库，所述多个癌症相关基因包含AKT1、ERBB2、 FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、 MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、 FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN，其中(i)独立于使用包含与所述多个扩增子中的至少一个互补的核酸序列的诱饵集进行所述文库的生成；和(ii)在生成所述文库前不使用定量PCR评估自所述福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取的基因组DNA的质量；(c)在所述多个扩增子的至少一个中检测至少一种突变；和(d)如果检测到对应PIK3CA、PIK3R1和PTEN的扩增子的至少一种中的突变和对应NOTCH1、ERBB2、BRAF、PTCH1、SMO、EGFR、KRAS、 DDR2、MAP2K1、FGFR3、NRAS、MET和FBXW7的至少一种中的突变，则选择所述受试者用于使用PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂和至少一种其他作用剂的治疗。

在所述方法的一些实施方案中，中对应PIK3CA的所述扩增子通过选自下组的引物对生成：5’CCTAGTAGAATGTTTACTACCAA3’(SEQ ID NO.:__) and 5’CTGCTTCTTGAGTAACACTT3’(SEQ ID NO.:__)；5’CATGTTCATGCTGTGTATGT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’GCTTCTTTACAAACGTTCAGAA3’(SEQ ID NO.:__)；5’ TCTATGTTCGAACAGGTATCT 3’(SEQ IDNO.:__)和5’ ACTGCTAAACACTAATATAACCTTTG 3’(SEQ ID NO.:__)；5’TTGAAATGTGTTTTATAATTTAGACTAGT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ CCATGAGGTACTGGCC 3’(SEQID NO.:__)；5’ TTGGTGTTACTGGATCAAATC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ TGCTGAACCAGTCAAACT3’(SEQ ID NO.:__)；5’ TATTATTTTATTTTACAGAGTAACAGACTAG 3’(SEQ ID NO.:__)和5’TTTAGCACTTACCTGTGACT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ TGGAATGCCAGAACTACA3’(SEQ ID NO.:__)和5’ GTGGAAGATCCAATCCATTTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ GGAATGAATGGCTGAATTATG 3’(SEQID NO.:__)和5’ GCGGTATAATCAGGAGTTTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ AGTTGGCCTGAATCACTATA3’(SEQ ID NO.:__)和5’ GATGTTACTATTGTGACGATCTC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GTAAGTGTTACTCAAGAAGC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ ATAGGATATTGTATCATACCAATTTCT 3’(SEQID NO.:__)；5’ TCCACAGCTACACCATATAT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ AGCATCAGCATTTGACTTTA3’(SEQ ID NO.:__)；5’ TACACAGACACTCTAGTATCTG 3’(SEQ ID NO.:__)和5’GAAGGTTTGACTGCCATAAA 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ ATGACAAAGAACAGCTCAAA 3’(SEQ IDNO.:__)和5’ GAGATCAGCCAAATTCAGTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ GATGTGTTACAAGGCTTATCTA3’(SEQ ID NO.:__)和5’ GCCTCTTGCTCAGTTTTATC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GAGGCTTTGGAGTATTTCA 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ CTGCTGAGAGTTATTAACAGT 3’(SEQ IDNO.:__)；和5’ GCTTTTGGAGTCCTATTGT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’CACAAACTAGAGTCACACAC 3’(SEQ ID NO.:__)。

在所述方法的一些实施方案中，对应PIK3R1的扩增子通过选自下组的引物对生成：5’GGGTTTTGGGCTGATATTA 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ CCACAGAACTGAAGGTTAAT 3’(SEQ IDNO.:__)；5’ TTATCCATTGAATTTATTTTAATCTTTCTAG 3’(SEQ ID NO.:__)和5’GGGATGTGCGGGTATATT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ GTCTTGCAGTAAGAGATTGT 3’(SEQ IDNO.:__)和5’ TCTTTGCTGTACCGCT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GTTTCTTTTGCCTGCA 3’ (SEQ IDNO.:__)和5’TGGATAAGGTCTGGTTTAATG 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ GCTACAATTCAGGATGAGTTA3’(SEQ ID NO.:__)和5’ TCTTCTGCTATCACCATCTTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’CCATCATGATGAGAAGACAT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ TTGCTGGAGATACATACACT 3’(SEQ IDNO.:__)；5’ GTGGTCACTAAACCTTAAGA 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ GGCTTACCTTAGTGTAAGAG 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ TTTCATCGAGATGGGAAATATG 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ACCTGTTGGTATTTGGATACT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ AGAAGATAATATTGAAGCTGTAGG 3’(SEQ IDNO.:__)和5’ AGAACTCTTATTTTTTAATCTGATTTTCA 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GGACAGCTATTGAAGCATTTA 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ CACAAGAACAAGGGAAACAC 3’(SEQ IDNO.:__)；5’ GCAGGCAGCTGAGTATC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ TCATCCTGAATTGTAGCAATCA 3’(SEQ ID NO.:__)。

在所述方法的一些实施方案中，对应PTEN的扩增子通过选自下组的引物对生成：5’CAGCTTCTGCCATCTCT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ AGCAGCCGCAGAAAT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GTGGCTTTTTGTTTGTTTG 3’(SEQ ID NO.:__)和5’CACTCTAACAAGCAGATAACT 3’(SEQ IDNO.:__)； 5’TACTTGTTAATTAAAAATTCAAGAGTTTT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’CTTAGCCATTGGTCAAGATC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ ACAATCATGTTGCAGCA 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ AAAAACATCAAAAAATAACTTACCTTTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’AGAGGCGCTATGTGTATTA 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ CATGGAAGGATGAGAATTTCA 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GGAAGACAAGTTCATGTACT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ CTGTCCTTATTTTGGATATTTCTC 3’(SEQ IDNO.:__)；5’ ATTAATTAAATATGTCATTTCATTTCTTTTTC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’GCTATCGATTTCTTGATCACA 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ TGAGTCATATTTGTGGGTTTTC 3’(SEQ IDNO.:__)和5’ TGATCAGGTTCATTGTCACTAA 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ TTTGATTGCTGCATATTTCAG3’(SEQ ID NO.:__)和5’TCAAAGCATTCTTACCTTACTAC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’TTTTAAACTTTTCTTTTAGTTGTGC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ ACTCGATAATCTGGATGACT 3’(SEQID NO.:__)；5’ CAATTTAGTGAAATAACTATAATGGAAC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’AGTGCCACTGGTCTATAAT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ CCTGTGAAATAATACTGGTATGT 3’(SEQ IDNO.:__)和5’ CTACTTTGATATCACCACACAC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ TAGAGCGTGCAGATAATGA3’(SEQ ID NO.:__)和5’ TCAACAACCCCCACAAA 3’(SEQ ID NO.:__)；和5’CTTTCTCTAGGTGAAGCTGTA3’(SEQ ID NO.:__)和5’ GGTTCATTCTCTGGATCAGA3’(SEQ IDNO.:__)。

在所述方法的一些实施方案中，所述福尔马林固定石蜡包埋的样本是异质性肿瘤。在一些实施方案中，5％-10％的所述异质性肿瘤的细胞在多个扩增子的至少一种中含有至少一种突变。在其他实施方案中，至少10％的所述异质性肿瘤的细胞在多个扩增子的至少一种中含有至少一种突变。

在所述方法的一些实施方案中，所述PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂选自下组：BKM120、BEZ235、Pictilisib(GDC-0941)、LY294002、CAL-101 (Idelalisib)、GNE-317、PI-3065、HS-173、PI-103、NU7441、GSK2636771、 VS-5584、CZC24832、Duvelisib、TG100-115、A66、YM201636、CAY10505、 GSK1059615、PF-04691502、PIK-75、PIK-93、AS-605240、BGT226、AZD6482、 Voxtalisib、Alpelisib、CUDC-907、IC-87114、Omipalisib、TG100713、Gedatolisib、 CH5132799、PKI-402、BAY 80-6946、TGX-221、XL147、PIK-90、PIK-293、PIK-294、3-甲基腺嘌呤、槲皮素、渥曼青霉素、ZSTK474、AS-252424、 AS-604850、依维莫司和Apitolisib。

在一个具体的实施方案中，所述受试者诊断为具有HER-2阴性乳腺癌。在所述方法的一些实施方案中，所述至少一种其他作用剂选自下组：Notch 通路抑制剂、BRAF抑制剂、SMO拮抗剂、MET抑制剂和ERBB2拮抗剂。在一些实施方案中，所述Notch通路抑制剂选自下组：FLI-06、LY411575、 Dibenzazepine、RO4929097、化合物E、Z-Leu-Leu-Nle-CHO、SAHM1、TR4 和Semagacestat。在一些实施方案中，所述SMO拮抗剂选自下组：嘌吗啡胺、 Taladegib(LY2940680)、环王巴明、Vismodegib(GDC-0449)、LDE225、 Glasdegib(PF-04449913)、PF-5274857、TAK-441、SANT-1、BMS-833923、 GANT61和IPI-926。

在一些实施方案中，所述ERBB2拮抗剂选自下组：拉帕替尼、卡奈替尼、CP-724,714、AZD8931、AEE788、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 879、Mubritinib 和帕妥珠单抗。在一些实施方案中，所述BRAF抑制剂选自下组：GDC-0879、 SB590885、Encorafenib、RAF265、TAK-632、PLX4720、CEP-32496、AZ628、索拉非尼Tosylate、索拉非尼、维罗非尼(Zelboraf)和达拉非尼(GSK2118436)。

在所述方法的一些实施方案中，所述受试者诊断为具有结肠直肠癌。在其他实施方案中，所述至少一种其他作用剂选自下组：Notch通路抑制剂、 FGFR3拮抗剂和RAF/MEK/ERK抑制剂。在一些实施方案中，所述 RAF/MEK/ERK抑制剂选自下组：维罗非尼(Zelboraf)和达拉非尼 (GSK2118436)、Encorafenib、TAK-632、PLX4720、MLN2480、Cobimetinib (GDC-0973)、MEK 162、RO5126766、GDC-0623、VTX11e、Selumetinib (AZD6244)、PD0325901、曲美替尼(GSK1120212)、U0126-EtOH、PD184352 (CI-1040)、Refametinib、PD98059、BIX02189、Binimetinib、Pimasertib (AS-703026)、SL327、BIX02188、AZD8330、TAK-733、PD318088、SCH772984 和FR 180204。

在一些实施方案中，所述Notch通路抑制剂选自下组：FLI-06、LY411575、Dibenzazepine、RO4929097、化合物E、Z-Leu-Leu-Nle-CHO、SAHM1、TR4 和Semagacestat。在一些实施方案中，所述FGFR3拮抗剂选自下组：BGJ398 (NVP-BGJ398)、AZD4547、LY2874455、多韦替尼双乳酸、多韦替尼、多韦替尼乳酸盐、CH5183284和尼达尼布。

在一个具体的实施方案中，检测到对应对应BRAF、MAP2K1和NRAS的扩增子中的至少一种中的突变和对应FGFR3和SMO的扩增子的至少一种中的突变。在其他实施方案中，将所述受试者诊断为具有黑素瘤。在一些实施方案中，所述至少一种其他作用剂为RAF/MEK/ERK抑制剂、FGFR3拮抗剂、SMO拮抗剂或其组合。

一方面，本发明提供在诊断为具有乳腺癌的HER-2阳性受试者中用于预测对使用抗HER-2疗法的治疗缺乏响应的可能性的方法，其包括：(a)从获得自HER-2阳性受试者的福尔马林固定石蜡包埋的样本提取基因组DNA；(b) 生成包含对应多个癌症相关基因的每一种的扩增子的文库，所述多个癌症相关基因包括：AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、 GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、 STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、 HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN，其中(i)独立于使用包含与所述多个扩增子中的至少一个互补的核酸序列的诱饵集进行所述文库的生成；和(ii)在生成所述文库前不使用定量PCR评估自所述福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取的基因组DNA的质量；(c)在所述多个扩增子的至少一个中检测至少一种突变；和(d)当检测到对应PIK3CA、PIK3R1 和PTEN的扩增子的至少一种中的突变时，将所述HER-2阳性受试者鉴定具有对使用抗HER-2疗法的治疗缺乏响应的可能性。在所述方法的一些实施方案中，所述抗HER-2疗法是曲妥珠单抗或拉帕替尼。

在所述方法的一些实施方案中，对应PIK3CA的扩增子通过选自下组的引物对生成：5’CCTAGTAGAATGTTTACTACCAA 3’(SEQ ID NO.:__)和5’CTGCTTCTTGAGTAACACTT 3’(SEQID NO.:__)；5’ CATGTTCATGCTGTGTATGT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’GCTTCTTTACAAACGTTCAGAA 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ TCTATGTTCGAACAGGTATCT 3’(SEQ IDNO.:__)和5’ ACTGCTAAACACTAATATAACCTTTG 3’(SEQ ID NO.:__)；5’TTGAAATGTGTTTTATAATTTAGACTAGT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ CCATGAGGTACTGGCC 3’(SEQID NO.:__)；5’ TTGGTGTTACTGGATCAAATC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ TGCTGAACCAGTCAAACT3’(SEQ ID NO.:__)；5’TATTATTTTATTTTACAGAGTAACAGACTAG 3’(SEQ ID NO.:__)和5’TTTAGCACTTACCTGTGACT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ TGGAATGCCAGAACTACA 3’(SEQ IDNO.:__)和5’ GTGGAAGATCCAATCCATTTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ GGAATGAATGGCTGAATTATG3’(SEQ ID NO.:__)和5’ GCGGTATAATCAGGAGTTTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’AGTTGGCCTGAATCACTATA 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ GATGTTACTATTGTGACGATCTC 3’(SEQ IDNO.:__)；5’ GTAAGTGTTACTCAAGAAGC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ATAGGATATTGTATCATACCAATTTCT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ TCCACAGCTACACCATATAT 3’(SEQID NO.:__)和5’ AGCATCAGCATTTGACTTTA 3’(SEQ ID NO.:__)；5’TACACAGACACTCTAGTATCTG 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ GAAGGTTTGACTGCCATAAA 3’(SEQ IDNO.:__)；5’ ATGACAAAGAACAGCTCAAA 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ GAGATCAGCCAAATTCAGTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ GATGTGTTACAAGGCTTATCTA 3’(SEQ ID NO.:__)和5’GCCTCTTGCTCAGTTTTATC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ GAGGCTTTGGAGTATTTCA 3’(SEQ IDNO.:__)和5’ CTGCTGAGAGTTATTAACAGT 3’(SEQ ID NO.:__)；和5’ GCTTTTGGAGTCCTATTGT3’(SEQ ID NO.:__)和5’ CACAAACTAGAGTCACACAC 3’(SEQ ID NO.:__)。

在一些实施方案中，当检测到对应PIK3CA、PIK3R1和PTEN的扩增子的至少一种中的突变时，使用曲妥珠单抗emtansine治疗所述HER-2阳性受试者。

在一些实施方案中，所述受试者的HER-2阳性状态通过免疫组化(IHC) 或荧光原位杂交(FISH)测定。

另一方面，本发明提供选择用于以EGFR酪氨酸激酶抑制剂和至少一种其他作用剂治疗的受试者的方法，其包括：(a)从获得自受试者的福尔马林固定石蜡包埋的样本提取基因组DNA；(b)生成包含对应多个癌症相关基因的每一种的扩增子的文库，所述多个癌症相关基因包含AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、 PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、 IDH1、NOTCH1和PTEN，其中(i)独立于使用包含与所述多个扩增子中的至少一个互补的核酸序列的诱饵集进行所述文库的生成；和(ii)在生成所述文库前不使用定量PCR评估自所述福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取的基因组DNA的质量；(c)在所述多个扩增子的至少一个中检测至少一种突变；和(d)如果检测到对应EGFR的扩增子的至少一种中的突变和对应KRAS、 PIK3R1和BRAF的扩增子的至少一种的的突变，则选择所述受试者用于使用 EGFR酪氨酸激酶抑制剂和至少一种其他作用剂的治疗。

在所述方法的一些实施方案中，所述福尔马林固定石蜡包埋的样本示异质性肿瘤。在一些实施方案中，5％-10％的所述异质性肿瘤的细胞含有在多个扩增子的至少一种中的至少一种突变。在其他实施方案中，至少10％的所述异质性肿瘤的细胞含有在多个扩增子的至少一种中的至少一种突变。

在一些实施方案中，所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂是吉非替尼或厄洛替尼。

一方面，本发明提供用于在诊断为具有黑素瘤的受试者中预测对使用维罗非尼的治疗响应性的可能性的方法，其包括：(a)从获得自受试者的福尔马林固定石蜡包埋的样本提取基因组DNA；(b)生成包含对应多个癌症相关基因的每一种的扩增子的文库，所述多个癌症相关基因包含AKT1、ERBB2、 FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、 BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、 MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、 FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN，其中(i)独立于使用包含与所述多个扩增子中的至少一个互补的核酸序列的诱饵集进行所述文库的生成；和(ii)在生成所述文库前不使用定量PCR评估自所述福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取的基因组DNA的质量；(c)在所述多个扩增子的至少一个中检测至少一种突变；和(d)当检测到对应BRAF的扩增子的至少一种中的突变时将所述受试者鉴别为具有至少一种对使用维罗非尼的治疗高的响应可能性，且当检测到对应NRAS的扩增子的至少一种中的突变时将所述受试者鉴别为具有对使用维罗非尼的治疗低的响应可能性。

一方面，本发明提供用于在诊断为具有结肠直肠癌的受试者中预测对使用抗EGFR疗法的治疗响应性的可能性的方法，其包括：(a)从获得自受试者的福尔马林固定石蜡包埋的样本提取基因组DNA；(b)生成包含对应多个癌症相关基因的每一种的扩增子的文库，所述多个癌症相关基因包含AKT1、 ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、 SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、 GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、 EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN，其中(i)独立于使用包含与所述多个扩增子中的至少一个互补的核酸序列的诱饵集进行所述文库的生成；和 (ii)在生成所述文库前不使用定量PCR评估自所述福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取的基因组DNA的质量；(c)在所述多个扩增子的至少一个中检测至少一种突变；和(d)当检测到对应KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA和PTEN 的扩增子的至少一种中的突变时将所述受试者鉴别为对使用抗EGFR疗法的治疗具有低的响应可能性。

附图简述

图1显示了提供本研究中分析的肿瘤样本的121名患者的临床特征。

图2显示了使用含有下述变体的FFPE样本的测定间精密度实验的结果： BRAFG466Y、TP53R175H、DDR2L34P、EGFR E865G、EGFR E866V、TP53 R248W、Notch Q2406△和TP53A159_M160insRA。

图3显示了使用含有下述变体的细胞系的测定间精密度实验的结果： EGFR△E746_A750、EGFR L858R和AKT1E17K。

图4是维恩图，其根据下述肿瘤类型总结了本技术的实体瘤筛选测定法检测到的突变基因：肺癌，结肠直肠癌，黑素瘤和乳腺癌。在可能的情况下在其各自的重叠区域描绘了几种肿瘤类型中突变的基因。

图5显示了具有多个共同发生的突变的肿瘤类型的FFPE样品的百分比 (由本技术的实体肿瘤筛选面板检测)。没有肿瘤样本含有≥5个共同发生的突变。

图6显示了对于(A)所有肿瘤类型、(B)黑素瘤、(C)结肠直肠癌、(D)肺癌和(E)乳腺癌，由本技术的实体肿瘤筛选面板针对每个单独的样本检测到的突变(条形图)。还显示了针对给定肿瘤类型测试的样本的总数。对于每个面板(在所有面板的右侧轴标记)提供了由给定行代表的基因中含有突变的样本的数量。还显示了在同一基因内含有2个突变的样本。图例显示每个样本的临床实验室结果。

图7显示最初筛选ER、PR和HER-2表达的28个乳腺癌肿瘤样品的分子概貌。

发明详述

本公开提供了用于诊断患有乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤或肺癌的患者是否受益于使用单独的治疗剂或治疗剂的特定组合的治疗或预测其是否将对所述治疗响应的方法。这些方法基于筛选患者的实体瘤并使用高度敏感的基于新一代测序(NGS)PCR的测定来检测对应特定癌症相关基因集合的靶核酸序列的改变。还提供了用于实践该方法的试剂盒。

肿瘤的分子概貌在晚期癌症的治疗中变得越来越重要。NGS在癌症研究中被广泛使用，并且由于其能够在单测定中检测多个变体，已经成为临床实验室中有吸引力的诊断技术。

FFPE样本对于几乎所有疑似癌症病例的诊断是不可或缺的，估计有数百万的存档样本可以提供关于疾病进展和治疗的大量分子信息。虽然FFPE技术是下游分子分析的保护组织和便于归档的标准，但是组织在甲醛溶液中的储存导致蛋白质与其他蛋白质和核酸的广泛交联以及核酸片段化。FFPE技术可导致DNA的部分变性，并可能导致DNA碱基对自身的损伤，从而损害 NGS测定的准确性。而且，可用于活检的肿瘤组织量通常是有限的。这些挑战由于在肿瘤样品中观察到的分子异质性的程度而进一步恶化，这使得检测 FFPE组织中可能的遗传改变异常困难。

因此，从FFPE肿瘤样品获得的有限量的高质量DNA不利于使用需要大量输入DNA的大规模实体肿瘤筛选面板(例如对于面板需要 50ng，其询问超过300个癌症相关基因的完整的编码序列和28个基因重排， Foundation)。此外，通常与血液学变体(例如ABL1)相关的癌症相关基因的分析不太可能为基因异质实体肿瘤的靶向治疗策略提供指导。因此，需要更集中的实体肿瘤筛选面板，其提供关于异质性实体肿瘤的准确和临床相关的信息，且在使用来自FFPE样品的输入DNA方面是经济的。

本技术的一个目标是开发高度敏感的实体肿瘤分析面板，其能够同时检测预先选择的一组癌症相关基因的特异性靶向外显子或基因区域中的广泛突变，所述癌症相关基因在实体瘤中当前或可能成为在治疗上起作用的。在一些实施方案中，实体瘤表现为诊断为黑素瘤、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、甲状腺癌、胃肠道间质瘤等的患者。

本公开提供了用于检测传统Sanger测序方法所遗漏的实体瘤(来源于 FFPE组织)中特定的一组癌症相关基因中的可作用的遗传突变的方法。一方面，本技术的方法可用于检测高度异质性肿瘤样品中特定的一组癌症相关基因的遗传改变。此外，本文公开的方法劳动强度较低，需要较少的来自FFPE 样品的DNA输入，并且提供了与其他现有的基于PCR的NGS肿瘤筛选测定相比在特定肿瘤样品(例如，异质性肿瘤)中如何影响不同信号途径的另外的见解。具体而言，本技术的方法筛选34个预选的癌症相关基因内的特定靶区域中的突变，其进而提供FFPE肿瘤样品(例如，异质性肿瘤)的分子概貌的总体概况，而无需事先评估从FFPE肿瘤样品中提取的基因组DNA的质量。

本文公开的方法可用于(a)预测诊断患有乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤或肺癌的受试者对特定治疗剂的响应性，和(b)根据个体受试者肿瘤的性质为受试者选择最佳治疗策略。因此，FFPE过程期间的DNA降解/部分DNA变性和肿瘤异质性似乎不影响本技术的实体瘤筛选测定的敏感性。

定义

如本文所使用的，除非另有说明，或否则从上下文显而易见，指代数字的术语“约”通常认为包括在数字的任一方向(大于或小于)的1％-5％的范围内的数字。

如本文所用，关于核酸序列的术语“扩增”或“扩增”是指增加样品中核酸序列群体代表的方法。核酸扩增方法如PCR、等温方法、滚环方法等是本领域技术人员所熟知的。在扩增反应中体外产生的特定核酸序列的拷贝被称为“扩增子”或“扩增产物”。

如本文所用，术语“可作用的基因改变”是指与下述相关的突变：(1)使用FDA批准的药物的治疗，(2)指导支持的药物治疗，(3)对特定治疗的敏感性或耐受性的指导性指示，(4)正在进行的临床试验，(5)支持对药物治疗的耐药性或敏感性的临床数据，(6)显示对靶向治疗的抗性或敏感性的强有力证据的临床前数据，或(6)可能指导医生的治疗决定的预后含义。

术语“接头”是指短的、化学合成的核酸序列，其可以用于连接到核酸序列的末端以促进与另一个分子的附接。接头可以是单链或双链的。接头可并入用于PCR扩增或测序的短(通常少于50个碱基对)序列。

如本文所用，基因或基因产物(例如标记基因或基因产物)的“改变”是指在基因或基因产物内存在突变或多个突变，例如与正常或野生型基因相比较影响基因或基因产物的活性的突变。与其在正常或健康组织或细胞(例如，对照)中的量、结构和/或活性相比，基因改变可导致癌组织或癌细胞中基因或基因产物的量、结构和/或活性的改变。例如，与正常的健康组织或细胞相比，在癌症组织或癌细胞中与癌症相关或预测对抗癌治疗剂的响应性的改变可以具有改变的核苷酸序列(例如突变)、氨基酸序列、染色体易位、染色体内翻转、拷贝数、表达水平、蛋白质水平、蛋白质活性。示例性突变包括但不限于点突变(例如沉默、错义或无义)、缺失、插入、倒位、连接突变、复制、易位、染色体间和染色体内重排。基因的编码或非编码区中可以存在突变。在一些实施方案中，改变与表型例如癌症表型(例如癌症风险、癌症进展、癌症治疗或对癌症治疗的抗性中的一种或多种)相关。在一个实施方案中，改变与以下一项或多项相关：癌症遗传风险因子、阳性治疗响应预测因子、阴性治疗响应预测因子、阳性预后因子、阴性预后因子或诊断因子。

如本文所用，“诱饵”是一类获取靶核酸序列用于测序的杂合捕获试剂。诱饵可以是核酸分子，例如DNA或RNA分子，其可以杂交(例如互补)，从而允许捕获靶核酸。在一个实施方案中，诱饵是RNA分子(例如，天然存在的或修饰的RNA分子)；DNA分子(例如，天然存在或修饰的DNA分子)或其组合。在其他实施方案中，诱饵包括结合实体，例如亲和标签，其允许捕获和分离(例如通过与结合实体进行结合)由诱饵和与诱饵杂交的核酸形成的杂交体。在一个实施方案中，诱饵适合溶液相杂交。

如本文所用，“诱饵集合”是指一个或多个诱饵分子。

术语“癌症”或“肿瘤”可互换使用，指存在具有典型致癌细胞特征(例如不受控制的增殖、永生、转移潜能、快速生长和增殖速率以及某些特征性形态学特征)的细胞。癌细胞通常呈肿瘤形式，但这种细胞可以单独存在于动物体内，或者可以是非致瘤性癌细胞。如本文所使用的术语“癌症”包括恶化前的癌症以及恶性癌症。

如本文指代多核苷酸(即，如寡核苷酸或靶核酸的核苷酸序列)所使用的术语“互补”或“互补性”指碱基配对规则。如本文所使用的核酸序列的互补序列指当与核酸序列比对使得一个序列的5'端与另一个序列的3'端配对时处于“反平行结合”的寡核苷酸。例如，序列“5'-A-G-T-3’”与“序列“3’-T-C-A-5”互补。本文所述的核酸中可以包括在天然存在的核酸中不常见的某些碱基。这些包括例如肌苷、7-脱氮鸟嘌呤、锁定核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。互补性不一定是完美的；稳定的双链体可能含有错配的碱基对，退化的或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可以考虑许多变量，包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对的发生率，凭经验确定双链体稳定性。补体序列也可以是与DNA序列或其互补序列互补的RNA 序列，也可以是cDNA。

如本文所用，“对照”是用于比较目的的实验中使用的替代样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。如本文所用，“对照核酸样品”或“参照核酸样品”是指来自对照或参照样品的核酸分子。在一些实施方案中，参照或对照核酸样品是野生型或非突变的DNA或RNA序列。在一些实施方案中，参照核酸样品被纯化或分离(例如，从其天然状态中移除)。在其他实施方案中，参照核酸样品来自非肿瘤样品，例如血液对照，正常相邻肿瘤(NAT)或来自相同或不同受试者的任何其他非癌性样品。

如本文所用的“检测”是指确定样品中感兴趣的核酸中存在突变或改变。检测不要求该方法提供100％的灵敏度。

如本文所用的“基因”是指包含产生可具有非编码功能的RNA(例如，核糖体或转移RNA)或可包含多肽或多肽前体的RNA所必需的调节和编码序列的DNA序列。只要所需的活性或功能被保留，RNA或多肽可以由全长编码序列或编码序列的任何部分编码。尽管可以以DNA的形式显示核酸的序列，但是本领域普通技术人员认识到相应的RNA序列将具有相似的序列，其中胸腺嘧啶由尿嘧啶替换，即以“U”替换“T”。

如本文所用，术语“异质性肿瘤”是指包含具有不同分子变化的细胞亚群(例如具有不同基因型的亚克隆)的肿瘤。在一些实施方案中，异质性肿瘤细胞也可能呈现出不同的表型概貌，包括细胞形态、基因表达、代谢、运动性、增殖和转移潜能的差异。在一些实施方案中，肿瘤内的异质性程度可能取决于肿瘤显现的组织。

本文使用的术语“杂交”指其中两条基本上互补的核酸链(在至少14至 25个核苷酸的一段上至少约65％互补，至少约75％或至少约90％互补)在适当的严格条件下彼此退火以通过在互补碱基对之间形成氢键而形成双链体或异源双链体的过程。杂交通常且优选用探针长度的核酸分子进行，优选长度为15-100个核苷酸，更优选长度为18-50个核苷酸。核酸杂交技术在本领域是公知的。参见例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Plainview，NY。杂交和杂交的强度(即核酸之间的结合强度)受诸如核酸之间的互补性程度，所涉及的条件的严格性以及形成的杂交体的热解链温度(Tm)等因素影响。本领域技术人员知道如何估计和调整杂交条件的严格性，使得具有至少所需水平的互补性的序列将稳定地杂交，而具有较低互补性的序列则不会。对于杂交条件和参数的例子，参见例如Sambrook等人，1989，MolecularCloning：A Laboratory Manual， Second Edition，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y；Ausubel，F.M.等人1994，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Secaucus， N.J。在一些实施方案中，特异性杂交在严格杂交条件下发生。对靶核酸特异的寡核苷酸或多核苷酸(例如，探针或引物)将在合适的条件下与靶核酸“杂交”。

如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”可互换使用并且指单个生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在优选的实施方案中，个体、患者或受试者是人。

如本文所用，术语“文库”指核酸序列的集合，例如衍生自全基因组、亚基因组片段、cDNA、cDNA片段、RNA、RNA片段或其组合的核酸的集合。在一个实施方案中，部分或全部文库核酸序列包含接头序列。接头序列可以位于一端或两端。接头序列可用于例如测序方法(例如，NGS方法)、用于扩增、用于反转录或用于克隆到载体中。

文库可包含核酸序列的集合，例如靶核酸序列(例如肿瘤核酸序列)、参照核酸序列或其组合。在一些实施方案中，文库的核酸序列可以来自单个受试者。在其他实施方案中，文库可以包含来自多于一个受试者(例如，2、3、4、 5、6、7、8、9、10、20、30或更多受试者)的核酸序列。在一些实施方案中，来自不同受试者的两个或更多文库可以结合形成具有来自一个以上受试者的核酸序列的文库。在一个实施方案中，受试者是具有癌症或肿瘤或具有癌症或肿瘤风险的人。

“文库核酸序列”指作为文库成员的核酸分子，例如DNA、RNA或其组合。典型地，文库核酸序列是DNA分子，例如基因组DNA或cDNA。在一些实施方案中，将文库核酸序列片段化的例如剪切或酶制备的基因组DNA。在一些实施方案中，文库核酸序列包含来自受试者的序列和不来自受试者的序列，例如接头序列、引物序列或允许鉴定的其它序列，例如“条码”序列。

本文使用的术语“多重PCR”指扩增两种或多种PCR产物或扩增子，所述PCR产物或扩增子各使用不同的引物对进行引导。

本文使用的“下一代测序或NGS”是指任何测序方法，其确定单个核酸分子的核苷酸序列(例如在单分子测序中)或以高通量平行方式确定克隆扩大的单个核酸分子的代替物的核苷酸序列(例如，大于10³、10⁴、10⁵或更多的分子同时测序)。在一个实施方案中，文库中核酸种类的相对丰度可以通过计数由测序实验产生的数据中其关联序列的出现的相对数目来估计。下一代测序方法在本领域中是已知的，例如Metzker，M.BiotechnologyBiotechnology Reviews 11：31-46(2010)中所述。

如本文所用，“寡核苷酸”是指具有在限定的间隔上主要含有相同单体单元的骨架上的核酸碱基序列的分子。碱基以这样的方式排列在骨架上，使得它们可以与具有与寡核苷酸的碱基互补的碱基序列的核酸结合。最常见的寡核苷酸具有糖磷酸单元的骨架。可以于在2'位没有羟基的寡脱氧核糖核苷酸和在2'位具有羟基的寡核糖核苷酸间做出区分。寡核苷酸还可以包括其中羟基的氢被有机基团取代的衍生物，例如烯丙基。用作引物或探针的方法的寡核苷酸通常至少约10-15个核苷酸长，更优选至少约15-25个核苷酸长，尽管在该方法中可以使用更短或更长的寡核苷酸。确切的大小将取决于许多因素，而这又取决于寡核苷酸的最终功能或使用。寡核苷酸可以以任何方式产生，包括例如化学合成、DNA复制、质粒或噬菌体DNA的限制性内切核酸酶消化、逆转录、PCR或其组合。寡核苷酸可以例如通过添加甲基、生物素或地高辛部分、荧光标签或通过使用放射性核苷酸修饰。

如本文所用，术语“引物”是指寡核苷酸，其当置于诱导与靶核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时能够充当核酸序列合成的起始点，即在不同的三磷酸核苷酸和聚合酶存在下，在合适的缓冲液(“缓冲液”包括pH、离子强度、辅因子等)中并在合适的温度下进行。引物的一个或多个核苷酸可以例如通过添加甲基、生物素或地高辛部分、荧光标签或通过使用放射性核苷酸来修饰。引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，可以将非互补的核苷酸片段连接到引物的5'端，其中引物序列的其余部分与链基本上互补。本文使用的术语引物包括可合成的所有形式的引物，包括肽核酸引物、锁核酸引物、硫代磷酸酯修饰的引物、标记的引物等。如本文所用，术语“正向引物”是指与dsDNA的反义链退火的引物。“反向引物”与dsDNA的正义链退火。

如本文所用，“引物对”指可一起使用以扩增目标核酸的给定区域的正向和反向引物对(即，左侧和右侧引物对)。

如本文所使用的“样品”是指针对感兴趣的核酸中存在突变进行分析的物质。释放或以其他方式提供用于检测的核酸的处理方法在本领域中是公知的，并且可以包括核酸操作的步骤。生物样品可以是体液或组织样品。在一些情况下，生物样品可以包括血液、血浆、血清、尿液、粪便、表皮样品、阴道样品、皮肤样品、脸颊擦拭物、精子、羊水、培养细胞、骨髓样品、肿瘤活检、抽吸物和/或绒毛膜绒毛、培养细胞等。新鲜的、固定的或冷冻的组织也可以使用。在一个实施方案中，将样品保存为冷冻样品或甲醛或多聚甲醛固定的石蜡包埋(FFPE)组织制备物。例如，样品可以嵌入基质中，例如FFPE 块或冷冻样品。用EDTA、ACD或肝素作为抗凝剂收集约0.5至5ml的全血样品是合适的。

如本文使用的指代本发明技术的方法的术语“灵敏度”是方法在异源序列群体中检测预选序列变体的能力的度量。对于F％的变体，如果在给定样品中预选的序列变体作为样品中的序列的至少F％存在，所述方法能够以预选的 C％的置信度、S％的次数检测预选序列。则所述方法对于F％的变体具有S％的灵敏度。举例来说，如果给定样品中预选的变体序列作为样本中的序列的至少5％存在，所述方法可以预选的99％的置信度、10次中的9次检测预选序列，则所述方法对于5％的变体具有90％的灵敏度(F＝5％；C＝99％；S＝90％)。

如本文所用的指代寡核苷酸引物的术语“特异性”指当寡核苷酸和核酸比对时，引物的核苷酸序列与待扩增的核酸的一部分具有至少12个碱基的序列同一性。对核酸特异的寡核苷酸引物是在严格杂交或洗涤条件下能够与感兴趣的靶标杂交并且不与不感兴趣的核酸基本上杂交的寡核苷酸引物。较高水平的序列同一性是优选的，并且包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、更优选至少98％的序列同一性。

如本文所用的“实体瘤”是通常不包含囊肿或液体区域的组织的异常肿块。实体瘤可能是良性的，或恶性的(癌症)。实体瘤的实例是肉瘤、癌和淋巴瘤。基于肿块可检测到实体瘤；例如通过诸如CAT扫描、MR成像、X射线、超声波或触诊的程序，和/或由于可从患者获得的样品中一种或多种癌症特异性抗原的表达而可检测的。肿瘤不需要有可测量的尺寸。

癌症分期的具体标准取决于基于肿瘤大小、组织学特征、肿瘤标志物和本领域技术人员已知的其他标准取决于特定的癌症类型。一般来说，癌症分期可以描述如下：

0期.原位癌

阶段I、阶段II和阶段III.较高的数字表示更广泛的疾病：更大的肿瘤尺寸和/或癌症扩散而超出其最初发展的器官至邻近的淋巴结和/或邻近原发肿瘤位置的组织或器官。

阶段IV.癌症已经蔓延到远处的组织或器官

如本文所用，“特异性”是从测序人工产物或其它紧密相关序列区分真正发生的预选序列变体的方法的能力的量度。是避免假阳性检测的能力。假阳性检测可能是由于在样品制备过程中引入到感兴趣的序列中的错误、测序错误或者密切相关的序列如假基因或基因家族成员的无意测序而引起的。如果当应用于N_Total序列的样本集合，其中X_True序列是真正变异的并且X_Not _true不是真正变体时，所述方法选择至少X％的非真正变体为非变体，则该方法具有X％的特异性。例如，如果将方法应用于1000个序列的样本集合，其中 500个序列是真正变体且500不是真正变体，该反复选择500个非真正变体序列的90％为非变体，则该方法具有90％的特异性。示例性的特异性包括90、 95、98和99％。

如本文所用，术语“严格杂交条件”是指杂交条件至少如下严格：在50％甲酰胺，5×SSC，50mMNaH₂PO₄，pH 6.8，0.5％SDS，0.1mg/mL超声处理的鲑鱼精子DNA中杂交，和5xDenhart溶液在42℃过夜；在45℃用2x SSC、 0.1％SDS洗涤；并在45℃用0.2×SSC、0.1％SDS洗涤。在另一个实例中，严格杂交条件不应允许两个在20个连续核苷酸的一段延伸上超过两个碱基不同的两个核酸的杂交。

如本文所用，术语“靶序列”和“靶核酸序列”是指待分析的样品中待检测和/或定量的特定核酸序列。

如本文所用，术语“治疗”是指获得有益的或期望的临床结果的作用，包括但不限于缓解或改善疾病或病况的的一种或多种征兆或症状(例如部分或完全消退)、减少疾病的程度、稳定(即不恶化，达到稳定的疾病)疾病状态、疾病状态的改善或减轻、减少疾病进展的速率或时间以及缓解(部分或全部)。

肿瘤分析对靶向药物治疗的影响

在过去十年中，癌症已经成为药物开发的焦点，从2001年到2010年，新型癌症药物的开发数量增加了三倍，Siegel等人,CA Cancer J Clin.64:9-29 (2014)。标准化疗和放射治疗的适度存活率和高度的不良反应导致了新药开发集中在针对特定信号分子或整个调控途径的治疗上。许多靶向药物的效力可受到分子生物标志物的影响，分子生物标志物现在通常用作选择治疗的患者的辅助。

此外，实体瘤的突变异质性拓宽了新治疗靶向的细胞信号通路的范围。 Hanahan&Weinberg，Cell 144：646-74(2011)；Fisher等，British J.Cancer 108： 479-485(2013)；Burrella&Swantona，Molecular Oncology 8：1095-1111(2014)。识别通路改变可以引导临床医生朝向或远离针对受影响途径的药物。此外，不希望受理论束缚，癌症中受影响的调控途径的重叠可能表明，针对一种肿瘤类型的经批准的生物标志物和药物治疗可能在其他肿瘤类型中具有潜在的临床应用。在多种肿瘤类型和生物标志物适应症上成功应用的单一靶向治疗的一个实例是使用酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(甲磺酸伊马替尼)。伊马替尼最初是针对含有费城染色体(BCR/ABL1)的慢性粒细胞白血病(CML)中的c-abl 而开发的，但是其适应症已经扩展到包括治疗某些含有KIT或PDGFRA突变的GIST肿瘤以及含有KIT突变的晚期或转移性黑素瘤。Peng等，Clinical Pharmacokinetics 44：879-894(2005)；Guo等人，JCO 29：2904-2909(2011)。因此，前瞻性分析目前临床上可能未作用的肿瘤靶标对于给定肿瘤类型可能是潜在有益的。

“下游”信号蛋白中的突变还可以引起耐药性，为突变分析提供额外的实用性。Kelloff&Sigman,Nat Rev Drug Discov.11:201-214(2012)。分析显示获得性抗性的肿瘤导致鉴定抗性机制。例如，发现对BRAF抑制剂维罗非尼具有获得性抗性的黑素瘤患者在MEK1C121S中含有点突变。Wagle等, Cancer Discovery 4:61-68(2014)；Narita等,MolCancer Ther.13:823-832 (2014)。MEK1编码BRAF下游的激酶，C121S突变在上述情况下被认为导致维罗非尼耐性。尽管当时没有替代药物可用，但是最近报道了一种新颖的临床前研究中的MEK1抑制剂，其对含有MEK1C121S突变的抗维罗非尼黑素瘤具有活性。Wagle等,JClin Oncol.29:3085-3096(2011)。诸如此类的实例突出了在展示获得性耐药的患者中广泛范围的癌症相关基因甚至那些尚未与治疗响应相关的那些基因中鉴定突变的潜在效用。

未经治疗的患者也经常在多个基因中同时发生突变，这可能影响预后或治疗决策。例如，在结肠直肠癌和肺癌中常见KRAS和PIK3CA同时突变，组合状态可能具有预后或治疗预测价值。Roock等,Lancet Oncology 12:594–603(2011)；Chaft等,Mol CancerTher.11；485(2012)；PA等, Lancet Oncol.14:38-47(2013)。EGFR阳性肺癌中的并发PIK3CA突变描述为与对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的抗性有关。Ludovini等,J.Thoracic Oncology 6:707-715(2011)。此外，最近的一项研究表明，20％的ALK重排阳性肺癌在EGFR或MET中存在共同发生的突变，这可能是决定用克里唑替尼治疗的重要因素。Boland等,J.Thoracic Oncology 8:574–581(2013)。因此，前瞻性分析肿瘤将有助于选择最佳的治疗方案，从而提高患者治疗结果阳性的可能性。

NGS平台

在一些实施方案中，高通量，大规模平行测序采用使用可逆染料终止子的合成测序。在其他实施方案中，经由连接测序进行测序。在其他实施方案中，测序是单分子测序。下一代测序技术的实例包括但不限于焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、Helioscope单分子测序等。

Ion Torrent^TM(Life Technologies，Carlsbad，CA)扩增子测序系统采用基于流的方式，其检测在DNA复制中并入未修饰的核苷酸期间由释放氢离子引起的pH变化。为了与该系统一起使用，首先通过产生侧翼为测序接头的DNA 片段来产生测序文库。在一些实施方案中，这些片段可以通过乳液PCR在颗粒上克隆扩增。然后将具有扩增模板的颗粒置于硅半导体测序芯片中。在复制过程中，芯片由一个接一个的核苷酸淹没，如果一个核苷酸与芯片的特定微孔中的DNA分子互补，则其将并入。当核苷酸由聚合酶并入DNA分子中时，质子被天然释放，导致可检测到的pH的局部变化。然后溶液的pH发生改变，并由离子传感器检测到。如果模板序列中存在均聚物重复，则多个核苷酸将在单个循环中并入。这导致相应数量的释放的氢和成比例的更高的电信号。

454TM GS FLX ^TM测序系统(德国Roche)在大规模平行焦磷酸测序系统中采用了基于光的检测方法。焦磷酸测序使用DNA聚合，一次添加一个核苷酸种类，并检测和量化通过释放连接的焦磷酸所发出的光而添加到给定位置的核苷酸数量。为了与454^TM系统一起使用，将接头连接的DNA片段固定在油包水乳液中的小DNA捕获珠上并通过PCR(乳液PCR)扩增。将每个DNA- 结合的珠放置在picotiter板上的孔中，并将测序试剂递送穿过板的孔。在测序运行期间，将四个DNA核苷酸按照固定的顺序依次添加到皮升滴定板装置中。在核苷酸流动期间，平行测序结合到每个珠上的数百万个拷贝的DNA。当将与模板链互补的核苷酸添加到孔中时，将核苷酸并入到现有的DNA链上，产生由仪器中的CCD照相机记录的光信号。

基于可逆染料终止子的测序技术：首先将DNA分子连接至载玻片上的引物并扩增，从而形成局部克隆集落。添加四种类型的可逆终止子碱基(RT-碱基)，并洗掉未并入的核苷酸。与焦磷酸测序不同，DNA一次只能延伸一个核苷酸。照相机拍摄荧光标记的核苷酸图像，然后将染料与末端3'阻断剂一起从DNA中化学除去，从而允许下一个循环。

Helicos的单分子测序使用加入polyA尾接头的DNA片段，其附着在流动细胞表面。在每个循环中，加入DNA聚合酶和单种荧光标记的核苷酸，导致表面固定的引物-模板双链体的模板依赖性延伸。读数由Helioscope序列仪执行。采集平铺整个阵列的图像后，荧光标签的化学切割和释放允许随后的延伸和成像循环。

像“老式”染料终止电泳测序一样，合成测序(SBS)依靠DNA聚合酶并入核苷酸来确定碱基序列。将具有固定接头的DNA文库变性为单链并嫁接至流动细胞，然后进行桥式扩增以在玻璃片上形成高密度斑点阵列。可逆终止子方法使用染料终止子的可逆形式，每次添加一个核苷酸，通过重复除去封闭基团以检测每个位置的荧光以允许另一个核苷酸的聚合。核苷酸并入的信号可以随荧光标记的核苷酸、磷酸盐驱动的光反应和氢离子传感全部被使用而变化。SBS平台的实例包括Illumina GA和HiSeq 2000。个人测序系统(Illumina，Inc.)还采用使用可逆的终止子化学的合成测序法。

与通过合成方法的测序相反，通过连接方法的测序使用DNA连接酶来确定靶序列。该测序方法依赖于在模板DNA链上通过局部互补性将相邻的寡核苷酸酶连接。该技术使用了所有可能的具有固定长度、根据测序位置进行标记的寡核苷酸的分区。将寡核苷酸退火并连接，并且通过DNA连接酶对匹配序列的优先连接导致在该位置的二核苷酸编码的色空间信号(通过释放沿着寡核苷酸对应已知位置处的已知核苷酸的荧光标记的探针)。这种方法主要是由Life Technologies’SOLiD^TM测序仪使用。在测序之前，通过乳液PCR扩增 DNA。将每个仅含有相同DNA分子拷贝的所得珠沉积在固体平面基质上。

SMRT^TM测序是基于合成方式的测序。DNA在零模波导(ZMWs)-小孔状容器中合成，其中捕获工具位于孔底部。使用未修饰的聚合酶(连接到ZMW底部)和在溶液中自由流动的荧光标记的核苷酸进行测序。以这样的方式构建孔，即只检测在孔底部发生的荧光。将荧光标记与其并入DNA链的核苷酸分离，留下未修饰的DNA链。

本发明技术的实体肿瘤筛选方法

本文公开了至少部分基于与癌症表型(例如，癌症风险、癌症进展、癌症治疗响应或对癌症治疗的抗性中的一种或多种)相关的预先选择的一组基因的方法和测定。这样的预选基因允许能够应用测序方法，特别是依赖于大量不同基因(例如来自肿瘤或对照样品)的大规模平行测序的方法。

在一个实施方案中，本技术中所表征的方法用于多重多基因测定形式，例如在大量基因中并入来自大量不同基因改变的多个信号的测定。

本技术的方法基于以下原理：测定肿瘤样品例如异质性实体肿瘤内的细胞群的预选的一组癌症相关基因中一个或多个改变的存在，其可用于确定患者是否将受益于使用单独的治疗剂或特定的治疗剂组合的治疗，或将对所述治疗响应。在所述方法的一些实施方案中，预选的癌症相关基因组合对应于 AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、 PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、 FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、 PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN。在所述方法的一些实施方案中，通过测定对应于预选的一组癌症相关基因的多个扩增子来检测预选的一组癌症相关基因中一个或多个改变的存在。

本技术的方法优于其他用于实体瘤的可比较的基于PCR的NGS筛选模板的优势是双重的。首先，为了产生高度均一的基于扩增子的文库，不需要对从FFPE组织提取的基因组DNA的质量的初步评估。其次，本文公开的筛选测定所需的最小DNA输入比其他可比较的实体肿瘤筛选面板低约三倍。例如，本文公开的方法的最小输入DNA对于生成对应34个基因的231个扩增子为10ng，而TruSight^TM肿瘤方案需要至少30ng用于生成对应26个基因的 174个扩增子。

本发明提供用于在受试者中的多个癌症相关基因中检测至少一种突变的方法，其包括：(a)从获得自所述受试者的福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取基因组DNA；(b)生成包含对应多个癌症相关基因的每一种的扩增子的文库，所述多个癌症相关基因包含AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、 RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、 KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、 DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1 和PTEN，其中(i)独立于使用包含与所述多个扩增子中的至少一个互补的核酸序列的诱饵集进行所述文库的生成；和(ii)在生成所述文库前不使用定量 PCR评估自所述福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取的基因组DNA的质量；(c)将接头序列与所述多个扩增子的末端连接；和(d)使用高通量大规模平行测序在多个扩增子的至少一种中检测至少一种突变。

在所述方法的一些实施方案中，所述受试者已诊断为患有或疑似患有乳腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌或肺癌，或处于患有乳腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌或肺癌的风险。

在所述方法的一些实施方案中，检测到的至少一种突变是EGFR、KRAS、 BRAF、NRAS、ERBB2或PIK3CA中的突变。在一个实施方案中，检测到的至少一种突变选自下组：BRAFV600E、BRAF V600K、BRAF K483Q、BRAF G466V、BRAF G464V、BRAF E501V、BRAF E501K、EGFR△E746_A750、 EGFR R680Q、EGFR G598E、KRAS A146T、KRAS R68M、KRAS L19F、KRAS G12V、KRAS G12D、KRAS G12C、KRAS G13D、KRAS G13C、KRAS G12A、 KRAS G12S、KRAS Q22K、NRASQ61K、NRAS Q61R、NRAS G12R、NRAS G12D、PIK3CA C420R、PIK3CA G106R、PIK3CA R38H、PIK3CA E453K、 PIK3CA H1044R、PIK3CA N1044K、PIK3CA E545K、PIK3CA Q546H、PIK3CAH1047R、PIK3CA H1043L、PIK3CA M1043V、PIK3CA E542K、PIK3CA E542Q、 PIK3CA T1053A、PIK3CA I121V、PIK3CA H1047L、ERBB2L755S、ERBB2 S310Y、ERBB2D769Y、ERBB2S255R、DDR2H92Y、DDR2R31L、DDR2L34P、DDR2P381R和DDR2K392N。

在所述方法的一些实施方案中，使用不超过10ng的来自FFPE肿瘤样品的提取的基因组DNA产生包含对应本文公开的多个癌症相关基因中的每一个的扩增子的文库。在所述方法的一些实施方案中，使用11-25ng来自FFPE 肿瘤样品的提取的基因组DNA产生包含对应本文公开的多个癌症相关基因中的每一个的扩增子的文库。在所述方法的一些实施方案中，使用至少25ng 的来自FFPE肿瘤样品的提取的基因组DNA产生包含对应本文公开的多个癌症相关基因中的每一个的扩增子的文库。

在所述方法的一些实施方案中，多个扩增子通过表1公开的至少两对、至少三对、至少四对、至少五对、至少十对、至少二十对、至少三十对、至少四十对、至少五十对或至少一百对或更多对引物生成。

表1:引物对混合集合1

在所述方法的一些实施方案中，多个扩增子通过表2公开的至少两对、至少三对、至少四对、至少五对、至少十对、至少二十对、至少三十对、至少四十对、至少五十对或至少一百对或更多对引物生成。表2:引物对混合集合2

本技术方法的另一方面在于，由表1和2中所示的其各自的正向和反向引物对产生的231个扩增子与通常在给定肿瘤类型中未检测到的基因或基因区域相对应。例如，通常测试的基因或基因区域包括肺癌的EGFR外显子 18-21、KRAS外显子1-2和ALK易位；结肠直肠癌的KRAS/NRAS外显子1-2 和PIK3CA外显子9和20；黑素瘤的BRAF外显子15和KIT；和胃肠道间质瘤的KIT和PDGFRa。、

在一些实施方案中，引物对的单个引物或一个或两个引物包含连接到引物的靶特异性序列部分的5'末端的特定接头序列(也称为测序接头)。该测序接头是已知序列的短寡核苷酸，其可以为邻接的未知靶核酸的扩增和测序都提供引发位点。如此，接头允许将片段结合到流动的细胞用于下一代测序。任何接头序列都可以包含在本技术中使用的引物中。在一些实施方案中，使用含有寡核苷酸测序接头的引物扩增对应AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、 RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、 KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、 DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1 和PTEN的扩增子产生接头标记的扩增子。

在其他实施方案中，使用的引物不包含接头序列，并且随后(即在扩增之后)将产生的扩增子连接至扩增子的一端或两端上的寡核苷酸测序接头。在一些实施方案中，所有正向扩增子(即从与靶核酸的反义链杂交的正向引物延伸的扩增子)含有相同的接头序列。在一些实施方案中，当进行双链测序时，所有正向扩增子包含相同的接头序列，并且所有反向扩增子(即从与目标片段的正义链杂交的反向引物延伸的扩增子)含有不同于正向扩增子的接头序列的接头序列。在一些实施方案中，接头序列还包括索引序列(也称为索引标签，“条码”或多重识别(MID))。

在一些实施方案中，接头序列是推荐用于Illumina测序仪(MiSeq和HiSeq) 的P5和/或P7接头序列。参见例如Williams-Carrier等,Plant J.,63(1):167-77 (2010)。在一些实施方案中，接头序列是推荐用于Life Technologies测序仪的 P1、A或Ion Xpress^TM条码接头序列。其他接头序列在现有技术中是已知的。一些制造商推荐使用特定的接头序列来配合他们提供的特定测序技术和机器。

另外或可替代地，在上述方法的一些实施方案中，测序来自多于一个样品的对应AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、 KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、 CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN的扩增子。在一些实施方案中，所有的样品同时平行测序。

在上述方法的一些实施方案中，使用本文公开的方法扩增和测序来自至少1、5、10、20、30或至多35、40、45、48或50个不同样品的对应AKT1、 ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、 SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、 GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、 EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN的扩增子。

另外地或可替代地，在所述方法的一些实施方案中，来源于单个样品的扩增子可以进一步包含相同的指示产生扩增子的来源的索引序列，每个样品的索引序列不同于来自所有其他样本的索引序列。因此，索引序列的使用允许每个测序运行将多个样本合并，随后基于索引序列确定样本源。在一些实施方案中，Access Array^TM系统(Fluidigm Corp.，SanFrancisco，CA)或Apollo 324系统(Wafergen Biosystems，Fremont，CA)用于通过在一个设置中同时扩增来自样品的核酸来产生条码化(索引)的扩增子文库。

在一些实施方案中，使用含有索引序列的引物(例如，正向引物和/或反向引物)产生索引扩增子。在文库制备期间，可以包括这样的索引引物作为“条码”工具以鉴定源自特定样品来源的特定扩增子。当采用接头连接和/或索引引物时，接头序列和/或索引序列在扩增过程中并入扩增子(连同靶特异性引物序列)。因此，所得到的扩增子能够测序，并且不需要传统的文库制备方案。此外，索引标签的存在允许区分来自多个样本源的序列。

在一些实施方案中，可以用非接头连接的和/或非索引的引物扩增扩增子，且随后可以将测序接头和/或索引序列连接到每个所得扩增子的一个或两个末端。在一些实施方案中，使用多重PCR的方式产生扩增子文库。

来自多个样品源的索引扩增子被单独量化，然后在高通量测序之前汇集。因此，索引序列的使用允许在每次测序运行中汇集多个样品(即，来自多于一个样品源的样品)，并且随后基于索引序列确定样品源。“多重”是将多个接头标记和索引库汇集成一个测序运行。当使用索引引物集合时，这种能力可以用于比较研究。在一些实施方案中，在测序前汇集来自多达48个不同来源的扩增子文库。

在产生接头标记的和任选地索引的扩增子文库后，使用高通量、大规模平行测序(即，下一代测序)对扩增子进行测序。进行高通量，大规模平行测序的方法是本领域已知的。在所述方法的一些实施方案中，使用454TM GS FLX ^TM焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、 Helioscope单分子测序、合成测序、连接测序或SMRTTM测序进行高通量大规模平行测序。在一些实施方案中，可以使用读取深度的方式来进行高通量大规模平行测序。

在一些实施方案中，本技术的方法可用于检测包含抑制性肿瘤的FFPE 肿瘤样品中对应AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、 GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、 STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、 HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN的特定区域的扩增子中的至少一种突变。在一些实施方案中，5％的异质性肿瘤细胞在多个扩增子中的至少一个中含有至少一种突变。在一些实施方案中，约10％的异质性肿瘤的细胞在多个扩增子中的至少一个中含有至少一种突变。在一些实施方案中，约25％的异质性肿瘤的细胞在多个扩增子中的至少一个中含有至少一种突变。在一些实施方案中，约50％的异质性肿瘤的细胞在多个扩增子中的至少一个中含有至少一种突变。在其他实施方案中，至少5％的异质性肿瘤的细胞在多个扩增子中的至少一个中含有至少一种突变。在其他实施方案中，至少10％的异质性肿瘤的细胞在多个扩增子中的至少一个中含有至少一种突变。在其他实施方案中，至少25％的异质性肿瘤的细胞在多个扩增子中的至少一个中含有至少一种突变。

治疗实体肿瘤

本文公开了用于确定诊断为患有乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤或肺癌的患者是否受益于使用单独的治疗剂或治疗剂的特定组合的治疗或预测其是否将对所述治疗响应的方法。

在一些实施方案中，所述治疗剂包含一种或多种抗HER-2疗法、抗EGFR 疗法、PI3K/AKT/mTor通路抑制剂、激酶抑制剂、Notch通路抑制剂、BRAF抑制剂、SMO拮抗剂、ALK/MET抑制剂、ERBB2拮抗剂、FGFR3拮抗剂和 RAF/MEK/ERK抑制剂。

在一些实施方案中，所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼或厄洛替尼。在一些实施方案中，抗EGFR疗法为西妥昔单抗。

在所述方法的一些实施方案中，抗HER-2疗法是曲妥珠单抗或拉帕替尼。

激酶抑制剂的实例包括但不限于克里唑替尼、阿法替尼、阿西替尼、贝伐单抗、波舒替尼、西妥昔单抗、达沙替尼、厄洛替尼、Fostamatinib、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、Lenvatinib、尼洛替尼、帕尼单抗、帕唑帕尼、培加他尼、兰尼单抗、鲁索利替尼、索拉非尼、舒尼替尼，曲妥珠单抗和维罗非尼。

BRAF抑制剂的实例包括但不限于GDC-0879、SB590885、Encorafenib、 RAF265、TAK-632、PLX4720、CEP-32496、AZ628、索拉非尼甲苯磺酸盐、索拉非尼、维罗非尼(Zelboraf)和达拉非尼(GSK2118436)。

RAF/MEK/ERK抑制剂的实例包括但不限于维罗非尼(Zelboraf)和达拉非尼(GSK2118436)、Encorafenib、TAK-632、PLX4720、MLN2480、Cobimetinib (GDC-0973)、MEK162、RO5126766、GDC-0623、VTX11e、司美替尼(AZD6244)、PD0325901、曲美替尼(GSK1120212)、U0126-EtOH、PD184352 (CI-1040)、Refametinib、PD98059、BIX02189、Binimetinib、Pimasertib (AS-703026)、SL327、BIX02188、AZD8330、TAK-733、PD318088、SCH772984 和FR 180204.

PI3K/AKT/mTor通路抑制剂的实例包括但不限于BKM120、BEZ235、 Pictilisib(GDC-0941)、LY294002、CAL-101(Idelalisib)、GNE-317、PI-3065、 HS-173、PI-103、NU7441、GSK2636771、VS-5584、CZC24832、Duvelisib、 TG100-115、A66、YM201636、CAY10505、GSK1059615、PF-04691502、PIK-75、 PIK-93、AS-605240、BGT226、AZD6482、Voxtalisib、Alpelisib、CUDC-907、 IC-87114、Omipalisib、TG100713、Gedatolisib、CH5132799、PKI-402、BAY 80-6946、TGX-221、XL147、PIK-90、PIK-293、PIK-294、3-甲基腺嘌呤、槲皮素、渥曼青霉素、ZSTK474、AS-252424、AS-604850、依维莫司和 Apitolisib。

Notch通路抑制剂的实例包括但不限于FLI-06、LY411575、二苯并氮杂、RO4929097、化合物E、Z-Leu-Leu-Nle-CHO、SAHM1、TR4和Semagacestat.

SMO拮抗剂的实例包括但不限于嘌吗啡胺、Taladegib(LY2940680)、环王巴明、Vismodegib(GDC-0449)、LDE225、Glasdegib(PF-04449913)、 PF-5274857、TAK-441、SANT-1、BMS-833923、GANT61和IPI-926。

ERBB2拮抗剂的实例包括但不限于拉帕替尼、卡奈替尼、CP-724,714、 AZD8931、AEE788、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 879、Mubritinib和帕妥珠单抗。

FGFR3拮抗剂的实例包括但不限于BGJ398(NVP-BGJ398)、AZD4547、 LY2874455、多韦替尼双乳酸、多韦替尼、多韦替尼乳酸盐、CH5183284和尼达尼布。

ALK抑制剂的实例包括但不限于克里唑蒂尼、TAE684、Alectinib、 Ceritinib、AP26113、AZD3463和ASP3026。

MET抑制剂的实例包括但不限于克里唑蒂尼、PHA-665752、SU11274、 SGX-523、BMS-777607、JNJ-38877605、Tivantinib、PF-04217903、MGCD-265、 Capmatinib、AMG 208、MK-2461、AMG 458、NVP-BVU972和Tepotinib。

BRAF抑制剂维罗非尼是黑素瘤最常见的靶向疗法，用于治疗BRAF V600突变阳性的肿瘤。另外，还可以进行KIT突变的测序以评估用甲磺酸伊马替尼治疗的可能有效性。因此，在一些实施方案中，本公开提供了用于确定黑素瘤患者是否可能响应使用维罗非尼或MEK抑制剂的治疗的方法。本文还提供了用于确定黑素瘤患者是否可能响应使用抑制PIK3CA或MET活性的药物的治疗的方法。

一般提交结肠直肠癌样本用于检测EGFR下游基因的突变，以鉴定对抗 EGFR疗法(例如西妥昔单抗)的响应可能性低的肿瘤。NCCN指南将KRAS、 NRAS或BRAF中的突变鉴定为缺乏对这种治疗的响应的指标，临床证据表明 PIK3CA和PTEN突变也是抗性的指标。参见ErT.等,BioMed Research International 2014:1-8(2014)；Bokemeyer等,Ann Oncol.22(7):1535-46(2011)。因此，在一些实施方案中，本公开提供了用于确定结肠直肠癌患者是否可能对使用抗EGFR疗法(例如西妥昔单抗)的治疗响应的方法。

对于肺癌样本，目前指南推荐的测试(CAP、IASL、AMP)是优先考虑EGFR 突变的检测，其直接识别EGFR TKI响应者。这些指南还指出，EGFR突变阴性样本应该进行ALK重排检测，以确定ALK/c-MET抑制剂克里唑蒂尼可能的响应者。KRAS突变检测可用作鉴定对EGFR酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼和厄洛替尼无响应者的手段。然而，这不适用于TKI响应者，因为这些药物对EGFR酪氨酸激酶的抑制作用对EGFR中含有酪氨酸激酶结构域突变的肿瘤是特异性的。在一些实施方案中，本公开提供了用于确定肺癌患者是否可能对使用EGFR TKI的治疗响应的方法。在一些实施方案中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂是吉非替尼或厄洛替尼。本文还提供了用于确定肺癌患者是否可能对用克里唑蒂尼的治疗响应的方法。本公开还提供了用于确定肺癌患者是否可能响应维罗非尼、达拉菲尼、达沙替尼或MEK抑制剂如司美替尼的治疗的方法。

用于乳腺癌靶向治疗的主要常规临床生物标志物是用于抗HER-2疗法 (例如曲妥珠单抗)的HER-2基因扩增/表达(FISH和/或IHC)和用于内分泌治疗的ER/PR过表达。在一些实施方案中，本公开提供了确定诊断为乳腺癌的 HER-2阳性患者是否可能对用抗HER-2的疗法或曲妥珠单抗emtansine的治疗响应的方法。在所述方法的一些实施方案中，抗HER-2疗法是曲妥珠单抗或拉帕替尼。本文还提供了用于确定被诊断患有乳腺癌的患者是否可能对用 PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂的治疗响应的方法。

另一方面，本公开提供了选择用于使用PI3K/AKT/mTor通路抑制剂和至少一种其他作用剂的治疗的受试者的方法，其包括：(a)从获得自受试者的福尔马林固定石蜡包埋的样本提取基因组DNA；(b)生成包含对应多个癌症相关基因的每一种的扩增子的文库，所述多个癌症相关基因包含AKT1、ERBB2、 FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、 BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、 MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、 FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN，其中(i)独立于使用包含与所述多个扩增子中的至少一个互补的核酸序列的诱饵集进行所述文库的生成；和(ii)在生成所述文库前不使用定量PCR评估自所述福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取的基因组DNA的质量；(c)在所述多个扩增子的至少一个中检测至少一种突变；和(d)如果检测到对应PIK3CA、PIK3R1和PTEN的扩增子的至少一种中的突变和对应NOTCH1、ERBB2、BRAF、PTCH1、SMO、EGFR、KRAS、 DDR2、MAP2K1、FGFR3、NRAS、MET和FBXW7的至少一种中的突变，则选择所述受试者用于使用PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂和至少一种其他作用剂的治疗。

在所述方法的一些实施方案中，所述至少一种另外的试剂选自Notch通路抑制剂、BRAF抑制剂、SMO拮抗剂、MET抑制剂、ERBB2拮抗剂或其任何组合。在所述方法的一些实施方案中，所述至少一种其他作用剂选自Notch 通路抑制剂、FGFR3拮抗剂、RAF/MEK/ERK抑制剂或其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一种其他作用剂是RAF/MEK/ERK抑制剂、FGFR3拮抗剂、SMO拮抗剂或其任何组合。

另一方面，本公开提供了选择用于以EGFR酪氨酸激酶抑制剂和至少一种其他作用剂治疗的受试者的方法，其包括：(a)从获得自受试者的福尔马林固定石蜡包埋的样本提取基因组DNA；(b)生成包含对应多个癌症相关基因的每一种的扩增子的文库，所述多个癌症相关基因包含AKT1、ERBB2、 FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、 MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、 FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN，其中(i)独立于使用包含与所述多个扩增子中的至少一个互补的核酸序列的诱饵集进行所述文库的生成；和(ii)在生成所述文库前不使用定量PCR评估自所述福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取的基因组DNA的质量；(c)在所述多个扩增子的至少一个中检测至少一种突变；和(d)如果检测到对应EGFR的扩增子的至少一种中的突变和对应 KRAS、PIK3R1和BRAF的扩增子的至少一种的的突变，则选择所述受试者用于使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂和至少一种其他作用剂的治疗。

在所述方法的一些实施方案中，所述至少一种其他作用剂选自BRAF抑制剂、RAF/MEK/ERK抑制剂、PI3K/AKT/mTor通路抑制剂或其任何组合。

试剂盒

本公开还提供了用于检测对应本文所述的预选一组癌症相关基因的靶核酸序列中的改变的试剂盒。

本技术的试剂盒包含一个或多个引物对，所述引物对选择性杂交并可用于扩增选自下组的一个或多个基因：AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、 RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、 KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、 DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1 和PTEN。

在一些实施方案中，本技术的试剂盒包含与选自下组的单个基因的区域或外显子杂交的单个引物对：AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、RET、 ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、 PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、 FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN。在其他实施方案中，本技术的试剂盒包含与选自下组的单个基因的一个或多个区域或外显子杂交的多个引物对：AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、 RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、 KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、 DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1 和PTEN。在一些实施方案中，本技术的试剂盒包含多个引物对，其含有与选自下述的单个基因的每一个的区域或外显子特异性杂交的单个引物对： AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、 PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、 FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、 PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN。在一些实施方案中，本技术的试剂盒包含多个引物对，其含有与选自下述的单个基因的一个或多个的区域或外显子杂交的多于一个的引物对：AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、 NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、 GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、 TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1 和PTEN。

因此，本文预期本技术的试剂盒可包含识别和与选自下组的一个或多个基因的一个或多个区域或外显子特异性杂交的引物对：AKT1、ERBB2、 FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、 BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、 MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、 FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN。或者，试剂盒可包含将检测选自下组的一种或多种突变的引物对：BRAF V600E、BRAFV600K、BRAF K483Q、BRAF G466V、BRAF G464V、BRAF E501V、BRAF E501K、EGFR△E746_A750、EGFR R680Q、EGFR G598E、KRAS A146T、KRAS R68M、KRAS L19F、KRAS G12V、KRAS G12D、KRASG12C、KRAS G13D、KRAS G13C、KRAS G12A、 KRAS G12S、KRAS Q22K、NRAS Q61K、NRAS Q61R、NRAS G12R、NRAS G12D、PIK3CA C420R、PIK3CA G106R、PIK3CA R38H、PIK3CA E453K、PIK3CA H1044R、PIK3CA N1044K、PIK3CA E545K、PIK3CA Q546H、PIK3CA H1047R、PIK3CAH1043L、PIK3CA M1043V、PIK3CA E542K、PIK3CA E542Q、 PIK3CA T1053A、PIK3CA I121V、PIK3CA H1047L、ERBB2L755S、ERBB2 S310Y、ERBB2D769Y、ERBB2S255R、DDR2H92Y、DDR2R31L、DDR2L34P、 DDR2P381R和DDR2K392N。

在一些实施方案中，试剂盒包含表1中公开的一个或多个引物对。在一些实施方案中，试剂盒包含表2中公开的一个或多个引物对。在一些实施方案中，试剂盒包含表1和/或表2中公开两个或更多个引物对。

在一些实施方案中，试剂盒进一步包含实施如扩增和/或检测靶核酸序列中的改变(对应本文公开的特定癌症相关基因的集合)的测定或反应所必需的缓冲液、具有聚合酶活性的酶、具有聚合酶活性并且缺乏5'→3'外切核酸酶活性或者5'→3'和3'→5'外切核酸酶活性二者的酶、酶辅因子(如镁或锰、盐)、链延伸核苷酸(如脱氧核苷三磷酸(dNTP)，修饰的dNTP，核酸酶抗性的dNTP 或标记的dNTP)。

在一个实施方案中，本技术的试剂盒进一步包含阳性对照核酸序列和阴性对照核酸序列以确保实验运行期间测定的完整性。试剂盒可进一步包含用于将肿瘤样品中一种或多种本文所述的预先选定的癌症相关基因集合的水平和/或活性与参照核酸样品(例如非肿瘤样品)进行比较的方式。该试剂盒还可包括使用说明书、用于自动分析的软件、容器、包装如旨在用于商业销售等的包装。

本技术的试剂盒还可以包括实施本文公开的任何NGS技术的其他必需试剂。例如，所述试剂盒可进一步包含以下一种或多种：接头序列、条码序列、反应管、连接酶、连接酶缓冲液、洗涤缓冲液和/或试剂、杂交缓冲液和 /或试剂、标记缓冲液和/或试剂和检测手段。通常针对试剂盒预期的特定扩增 /检测技术优化缓冲液和/或试剂。用于使用这些缓冲液和试剂实施程序的不同步骤的方案也可包括在试剂盒中。

本技术的试剂盒可以包括组分，其用于从实体肿瘤测试样品制备核酸以用于随后扩增和/或检测对应于本文公开的特定癌症相关基因集合的靶核酸序列中的改变。这种样品制备组分可用于从组织样品中产生核酸提取物。在上述方法中使用的测试样品将基于如测定形式、检测方法的性质，以及用作待测定的测试样品的特定组织、细胞或提取物的因素而变化。从样品中提取核酸的方法是本领域众所周知的，并且可以容易地适应以获得与所使用的系统相容的样品。用于从测试样品中提取核酸的自动化样品制备系统是可商购的，例如Roche Molecular Systems’COBAS AmpliPrep系统、Qiagen的BioRobot 9600和Applied Biosystems的PRISM^TM6700样品制备系统。

实施例

实施例1：本技术的实体肿瘤筛选NGS测定的设计

最初的实验致力于针对设计更集中，高度敏感的实体肿瘤筛选测定，该得到可以提供对多种实体肿瘤类型的临床相关突变的总体概述，同时使用来自FFPE组织样品(～10ng)的极少量的DNA。根据NCCN指南的建议、实体肿瘤中体细胞突变的流行程度以及实体肿瘤患者通知治疗选择的可能性(表 3)，精心选择了一组34个癌症相关基因。

表3:实体肿瘤筛选面板

在所选择的34个基因中，至少2个(65％)或3个(40％)实体瘤类型 (COSMIC,mycancergenome.org,clinicaltrials.gov)中有许多具有已知或潜在临床意义的突变。而且，这34个基因中有近80％在黑素瘤、肺癌和结肠直肠癌 (结肠直肠癌)至少有1％的病例中发生突变。设计实体肿瘤筛选面板以测定对应于表3中列出的34个基因的特定区域(而不是整个基因的每个外显子)的靶核酸序列中的突变。这些特定靶核酸序列(或扩增子)的选择基于通知治疗决定的可能性、报道的突变频率，已知的热点等。

使用诱饵集合从FFPE样品富集对应于下述的特定区域的靶核酸序列显着低效：AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、 KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、 CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN，因为对于询问的靶核酸序，相比使用PCR扩增所观察到的，捕获实验产生约一半的读数，从而损害了筛选测定的整体灵敏度。

因此，随后的尝试集中于开发完全基于PCR的NGS筛选测定(即，基于扩增子的文库制备，随后为NGS)，以检测对应于下述的特定区域的扩增子中的基因改变：AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、 GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、 STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、 HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN。开发本文所述的多重PCR方法时产生的技术挑战之一是超过100个引物对的最佳选择，所述引物对在单个反应中同时杂交并扩增与本文公开的34种癌症相关基因的特定区域对应的靶核酸序列。实现引物对的适当平衡是一个重要的问题，因为不同引物对的退火效率的差异导致不同扩增子的扩增中的强烈偏差，导致样品中一些扩增子的覆盖度不足，并强烈地降低测定的灵敏度。为了最大化测序能力，所有扩增子中的扩增水平应当相似。此外，大量不同引物的存在导致引物二聚体形成的风险的大大增加，从而减少了重复扩增少量靶核酸的可能性。为考虑用FFPE DNA观察到的片段化，扩增子设计为126-183bp。表1和2中公开了用于本技术方法的优化的一组PCR引物对。

实施例2：本技术的实体肿瘤筛选测定的重复性和分析灵敏度

重复性.通过测试含有已知变体(BRAF G466Y、TP53R175H、DDR2 L34P、EGFRE865G、EGFR E866V、TP53R248W、Notch Q2406△、TP53 A159_M160insRA)的三个临床FFPE样本来评估测序性能的测定间精度，其中三个不同的运行中突变频率范围在4.6％和62.3％。见图2。对于测定间精度，在单次运行中测定了从含有已知变体(2个SNV和1个DEL)的细胞系的三个FFPE样品，其中突变频率在4.8％和43％之间。见图3。

如图2和图3所示，所有预期的低频变异体在测定间和测定内的重复中都检测到。来自所有测试变体的测定间和测定内的变化频率的SD分别为 0.11％至4.5％和0.6％至1.9％，表明本技术的实体肿瘤筛选测定具有高重复性。

分析灵敏度.为了证明该测定法的分析灵敏度，以不同比率将已知突变频率在14％至78％之间的临床FFPE样品与来自FFPE组织的DNA混合，所述DNA在感兴趣区域中不包含突变。临床FFPE样本的混合百分比范围为 2.5％到78.0％。见表4。

表4：肿瘤敏感性分析

*由变体访问未检测到，但在BAM文件中和提供的原始读数中可以看到存在(插入不降解IGV中的for/rev读数)。

未检测到表明变体以＜2％存在或完全不存在。

检测了9个目标区域的变异，其中7个(2个INDEL和5个SNP)在混合样本中检测到5％或接近5％(5％-7％)。在混合样品中未检测到变异＜2.5％。尽管INDEL在混合样品中可检测到5％或接近5％，但观察到的一些缺失的频率往往低于预期(2.5-5％)。因此，基于这些数据，该测定的分析灵敏度定义为对于SNP为5％且对于INDEL为10％。

实施例3：用FFPE样品验证本技术的实体肿瘤筛选测定的效力的方法

该实施例表明本技术的实体瘤筛选测定相对于Sanger测序方法具有改进的覆盖度和灵敏度，并且可以有效地分析几种主要实体肿瘤类型的临床相关基因中的可作用的突变。

患者和样本.这项研究包括提交给加州San Juan Capistrano的QuestDiagnostics Nichols Institute进行肿瘤标志物分析的未鉴定的FFPE样本。每种癌症的诊断均经病理学检查证实。最初收集了133个FFPE样本。由于DNA 产量不足(<10ng)，排除了12个样本，121个肿瘤样本(33个结肠直肠癌、27 个肺癌、31个黑素瘤和30个乳腺癌)被纳入本研究。

提供可用肿瘤样本的121例患者的临床特征如图1所示。每个癌症类型的中位年龄在57-68岁之间。黑素瘤、肺癌和结肠直肠癌样本最常见的组织来源是切除，而大多数乳腺癌样本来自活检。Ⅳ期患者分别占黑素瘤和结肠直肠癌样本的35.5％和27.3％。I期患者占乳腺癌样本的57％。肺癌(37％)和乳腺癌(40％)、结肠直肠癌中度分化(39.4％)中最常见的肿瘤分级标记为“不良分化”；大多数黑素瘤样本没有分级信息(83.9％)。见图1。

DNA提取.通过病理学家分析每个样品的苏木精和伊红染色的载玻片以鉴定富含肿瘤的区域并估计肿瘤分数。在研究中包括在所选区域中含有>25％肿瘤细胞(基于形态学)的FFPE样品。将切片进行人工大分割，使用Roche DNA提取试剂盒(Roche MolecularDiagnostics，Indianapolis，IN)根据肿瘤面积从1至5个10-μm未染色切片提取总DNA。使用Qubit DNAHS测定试剂盒(Life Technologies，Carlsbad，CA)进行DNA定量。选择具有至少10ng DNA 的样品用于NGS分析。在产生基于扩增子的文库之前不进一步评估提取的基因组DNA的质量(即，不使用定量PCR评估提取的基因组DNA的质量)。这是因为较早的比较研究显示，与使用Qubit定量相比，在实施本技术的基于 NGS的方法之前，使用基于qPCR的质量控制方法没有显着改善(数据未显示)。

Ion Torrent PGM文库制备.从每个样品的提取的基因组DNA中产生 PCR扩增子文库。在两个引物集合中使用231个引物对(列在表1和2中)扩增34个基因内的靶向区域。

简言之，以2x10-μL体积进行PCR，每体积含有5至20ng的基因组DNA；表1或表2中列出的正向和反向引物(针对平衡扩增优化的引物浓度)；440μM (每种)dATP、dCTP、dGTP和dTTP；5mM MgCl₂；57mM KCl；和0.6单位的 Gold Polymerase(Celera，Alameda，CA)。在以下条件下在ABI9700热循环仪上进行PCR扩增：

使用Apollo 324系统上的PrepX PGM DNA文库试剂盒将具有允许样品多重复合的索引序列的短延伸的测序接头(Ion Xpress^TMBarcode Adaptors 1-16 Kit,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)连接至扩增子。然后使用Platinum PCR SuperMix HighFidelity在以下条件下对扩增子文库进行缺口翻译：72℃20 分钟1个循环和95℃5分钟1个循环。使用Qubit DNAHS测定试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA)对文库进行定量。

测序模板制备.通过稀释四个患者样品(各自具有如上所述的不同条码) 以平衡浓度并产生10pmol/L的最终工作文库浓度来生成汇集的文库。每个文库集合都含有阳性对照DNA样品，其含有具有已知频率的8个变体(Horizon Diagnostics,Waterbeach,Cambridge,UK)。根据制造商的方案，使用Ion One-Touch 2系统(Life Technologies,Carlsbad,CA)上的Ion OneTouch 2模板试剂盒对每个文库集合进行乳液PCR(E-PCR)。使用Qubit Ion Sphere质量控制试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA)来估计具有扩增的模板DNA的Ion Sphere颗粒(ISP)的百分比。根据制造商的方案，使用IT OneTouch ES(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)上的Ion OneTouch试剂盒来实现ISP的富集。

测序.使用Ion PGM测序试剂盒(Life Technologies，Carlsbad，CA)，根据制造商的说明将富集的ISP在Ion 318芯片上进行测序。

数据分析.使用Ion Torrent Suite软件3.4版(Life Technologies,Carlsbad,CA)比对来自Ion Torrent PGM文库的序列读数。使用自定义参数设置使用Ion Torrent变体访问调用变体。从BAM文件计算指标，包括感兴趣区域(ROI)的覆盖度。读取覆盖度计算为整个ROI的读取次数，其中读取中碱基的平均Q 分数超过Q20。认为具有至少95％的扩增子≥300个读数的平均质量分数为 Q20或更好的样品是成功测序的。对于被认为是真正的序列变体，测序覆盖度至少300个Q20读数或10个变体读数，并且报道至少4％的变异频率是需要的。记录的其他指标包括变异是否在均聚物区域内或与其临近，变异的碱基数目和读取链的偏差。这些变化的指标整合到定制软件应用程序CLS-Mutation-Review中，该应用程序也可以直接访问Integrated Genome Viewer(IGV)，用于比对读取和已识别的变化的聚焦可视化。使用 CLS-Mutation Review应用程序对所有变异进行手动审查。已经从测定验证研究中发现的已知技术问题的群体变异和位置在应用程序中标记以帮助审查。

扩增子覆盖度.对所有121个样本进行了测序。平均而言，所有扩增子的98.6％(范围95-100％，2.63SD)达到>300个读数的最小每扩增子标准，表明对于所有121个样本具有足够的扩增子覆盖度。

Sanger测序.Sanger测序分析通过标准方法进行。测试的特定基因和外显子取决于癌症类型，但包括EGFR、KRAS、HRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、 TP53和KIT。

免疫组化.雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和HER-2免疫组织化学(IHC) 测试使用标准测定进行。当大于1％的肿瘤细胞显示阳性核染色时，将染色的载玻片审查并归类为ER和PR阳性。对于HER-2测定，根据CAP指南将载玻片分类为阴性、可疑或阳性。

FISH.商业试剂盒用于评估HER-2基因扩增(Vysis PathVysion^TMHER-2 DNA ProbeKit；Abbott Laboratories,Des Plaines,IL)、ALK易位(Vysis LSI ALK Break ApartRearrangement Probe Kit；Abbott Laboratories)和ROS1易位 (CytocellROS1Breakapart kit；CytoCell,Compiegne,France)。

实施例4：通过本技术的实体肿瘤筛选测定检测的突变的频率和广度

结果.总体而言，通过本技术的实体肿瘤筛选测定确定，所测试的所有 FFPE样品中的83％(100/121)含有至少一种突变：74％(23/31)的黑素瘤样品； 94％(31/33)的结肠直肠癌；78％(21/27)的肺癌；和83％(25/30)的乳腺癌(图5)。在大多数肿瘤类型，即黑素瘤、肺癌和乳腺癌中观察到单个基因突变。结肠直肠癌是例外，其中FFPE样本在两个或更多基因中含有的突变频率较高。在所有肿瘤类型中很少观察到具有四个或更多基因突变的FFPE样本。

检测了本技术的实体肿瘤筛选面板所测定的62％(21/34)的基因中的突变。这些观察结果支持在本技术的实体肿瘤筛选测定中询问的多个扩增子的选择。在这21种基因中，BRAF、PIK3CA、PIK3R1、PTE和TP53在所有4 种肿瘤类型中都发生突变；在至少三种肿瘤类型中有11种基因突变；17种基因在至少两种肿瘤类型中发生突变(图4)。此外，所有肿瘤中的53％(64/121) 在TP53中含有突变。

唯一发现在特定肿瘤类型中突变的基因是在肺癌中的STK11；在结肠直肠癌中的RET和在乳腺癌中的ERBB2和ERBB4。尽管绝大多数测试的样本只有一个基因突变，但是每个样本中至少有40％的每个肿瘤类型在≥2个基因中有突变，每个样本中有10％到20％的每个肿瘤类型在≥3个基因中有突变。此外，六个样本在同一个基因内有两个不同的突变。这些发现支持对多种实体瘤类型使用单一分子分析测定。

图6A显示了本技术的实体肿瘤筛选面板针对所有肿瘤类型针对每个个体样本检测到的突变。如图6B所示，BRAF是黑素瘤样品中最常见的突变基因(12/31；39％)，包括8个单核苷酸取代的样本(V600E[GTG>GAG]7个， K483Q 1个)和5个具有双核苷酸取代的样本(V600E，GTG>GAA[n＝4]； V600K，GTG>AAG[n＝1])。此外，19％(6/31)的黑素瘤样本具有单核苷酸 NRAS取代(Q61K[n＝2]；Q61R[n＝3]和G12R[n＝1])，其中一个还有两个共同发生的BRAF突变。在黑素瘤样本中，额外突变基因的实例包括 PTEN(13％)、MET和MAP2K1(10％)，PIK3CA和SMO(6％)，以及FGFR3、 PIK3R1、EGFR、IDH1、NOTCH1和FBXW7(3％)的单个实例。在7个(23％) 样品中也发现TP53突变(图6B)。

如图6C所示，KRAS是结肠直肠癌样品中最常见的突变基因(10/33样品； 30％)。该组中所有KRAS突变均为单核苷酸取代(G12V[n＝2]，G12D[n＝2]， G12C[n＝1]，G13D[n＝3]，L19F[n＝1]和A146T[n＝1])。此外，24％(8/33) 的结肠直肠癌样品含有单核苷酸PIK3CA取代(G106R、R38H、E453K、 H1044R、N1044K、E545K、Q546H和C420R各1个)。在33个结肠直肠癌样本(V600E[n＝1]和G466V[n＝1])中的两个(6％)检测到BRAF突变。在结肠直肠癌样本中另外的突变基因的实例包括DDR2、IDH1、NOTCH1、PTCH1、 NRAS、PIK3R1、RET和PTEN。19个样本中也有TP53突变(58％)(图6C)。

如图6D所示，37％(10/27)的肺癌样本中含有单核苷酸KRAS取代。这些包括G12V(n＝4)、G12C(n＝1)、G13C(n＝1)、G12A(n＝1)、G12S(n＝1)、 Q22K(n＝1)和A146T(n＝1)。此外，3例(11.1％)肺癌样品含有EGFR突变 (△E746_A750[n＝2]和R680Q[n＝1])，且3例(11％)含有DDR2突变。27例肺癌样本中有2例(7％)有BRAF突变(G464V和E501V)。一些具有KRAS突变的样本在EGFR、DDR2、BRAF、MET、PIK3CA、PIK3R1、PTCH1和TP53 的至少一种中有共同发生的突变(图6D)。在一个肺癌样本中检测到PTEN突变以及DDR2中的共同发生的突变。只有1例肺癌样本含有STK11突变。TP53 在12例(44％)肺癌样本中也发生突变(图6D)。

如图6E所示，～37％的乳腺癌样本含有PIK3CA突变。其中一个乳腺癌样本有两个共同发生PIK3CA突变(E542Q和H1047R)和NOTCH1中共同发生的突变。两个乳腺癌样本(7％)含有ERBB2突变以及共同发生的PIK3CA突变，其中一个具有两个共同发生的ERBB2点突变(L755S和S310Y)。乳腺癌样本中额外的突变基因的实例包括PTCH1(7％)和PIK3R1、FGFR3、PTEN、ERBB4、 MET、SMO、MAP2K1和NOTCH1(3％)的单个实例。TP53在53％(16/30)的乳腺癌样本中也发生突变(图6E)。

这些结果表明，本技术的实体肿瘤筛选测定可用于检测FFPE组织样品中下述基因的特异性靶外显子或基因区域中广泛的突变：AKT1、ERBB2、 FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、 BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、 MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、 FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN。因此，在组织包埋期间的DNA降解和部分DNA变性，FFPE组织样品的长期储存和潜在的PCR抑制剂在肿瘤样品中的存在似乎不影响本技术的实体肿瘤筛选测定的完整性。

此外，这些结果表明本技术的实体肿瘤筛选测定可用于在诊断患有乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌或黑素瘤的受试者中检测本文公开的多个癌症相关基因中的至少一种突变的方法中。

实施例5：与Sanger测序相比，本技术的实体肿瘤筛选测定具有改进的灵敏度和覆盖广度

本技术实体肿瘤筛选测定与Sanger测序的突变检测的单分析一致性。表 5列出了每个样品订购的Sanger测序测试。

表5:为121个FFPE样本订购的Sanger测序测试完整性

将最初订购的Sanger测序测试的结果与本技术用于肺癌、结肠直肠癌和黑素瘤样品(91个总FFPE样本)的实体肿瘤筛选测定进行比较。乳腺癌样本不包括在这个分析中，因为对于乳腺癌无常规提供的Sanger测序测试。

一些FFPE样本已经订购了多次测试，产生了121个Sanger测序测定结果。121个Sanger测序测定中有24个为突变阳性(20％)且97个为阴性(80％)。相比之下，本技术的实体肿瘤筛选测定在91个FFPE样品中检测到34个突变(28％)，即与最初订购的Sanger测序测定观察到的结果相比，具有10个更多的阳性结果。此外，本技术的实体肿瘤筛选测定检测到了通过Sanger测序鉴定的每个突变。

在所有3种肿瘤类型中发现了Sanger测序测试和本技术的实体肿瘤筛选测定之间的差异。见表6。

表6:Sanger测序测试和本技术的实体肿瘤筛选测定之间的差异

^a双核苷酸突变，未由cobas测试覆盖

^b未由Sanger测序测试覆盖(常规测序)

根据最初的cobas BRAF测试，三个FFPE黑素瘤样品的BRAF突变为阴性，且根据本技术的实体瘤筛选NGS测定为阳性(表6)。三个突变中的两个是BRAF V600E二核苷酸突变(GTG到GAA)，另一个是BRAF K483Q突变。

在三个差异性结肠直肠癌样本中，两个具有非密码子12/13/61KRAS突变，一个具有外显子7PIK3CA突变；在最初的Sanger测序分析中没有覆盖这些突变。见表6。

在四个有差异的肺癌样本中，两个具有EGFR突变且两个具有非密码子 12/13/61KRAS突变；最初的实验室Sanger测序分析未涵盖KRAS突变。参见表6。另外，检测到EGFR外显子19缺失(△E746-A750)证明本技术的实体肿瘤筛选NGS测定比Sanger测序可以更低的等位基因分数检测突变，因此比 Sanger测序更敏感.

结果分析表明，本技术的实体肿瘤筛选NGS测定相对于Sanger测序方法的覆盖广度和灵敏度有所改进。

实施例6：初始Sanger测序测定中未测试的其他基因。

黑素瘤：如图6B所示，本技术的实体瘤筛选NGS测定在20个最初的 BRAF阴性样品的12个中检测到另外22个非BRAF突变(60％)—FBXW7(1)、 MAP2K1(1)、MET(2)、NRAS(6)、NOTCH1(1)、PIK3CA(2)、PIK3R1(1)、 SMO(2)、PTEN(1)和TP53(5)。此外，最初的10例BRAF阳性样本中有7 例含有非BRAF突变—EGFR(1)、FGFR3(1)、IDH1(1)、MAP2K1(2)、MET(1)、 PTEN(3)和TP53(2)。

结肠直肠癌.如图6C所示，本技术的实体肿瘤筛选NGS测定法检测到 24个样品中的22个(91％)突变，所述样品未提交最初的Sanger测序测定或根据最初的Sanger测序测定测试为阴性。这些包括非密码子12/13/61KRAS(2)、 BRAF(3)、PIK3CA(5)、NRAS(1)、RET(1)、PTEN(1)和FGFR3(1)中的突变。根据最初的Sanger测序试验，在8个检测KRAS阳性的样本中，两个含有共同发生的PIK3CA突变，且一个含有共同发生的DDR2突变(图6C)。

肺癌：如图6D所示，根据最初的Sanger测序测定，本技术的实体瘤筛选NGS测定在20个测试为阴性的样本中的10个(50％)中检测到至少一种突变。这些包括KRAS、BRAF、NRAS、DDR2、MET和EGFR中的突变。此外，根据最初的Sanger测序测定，7个样本中的4个(57％)在EGFR、KRAS、BRAF、 PIK3CA或MET中还含有至少一个另外的突变。值得注意的是，ALK重排阳性样本还含有密码子22激活KRAS突变(图6D)。

乳腺癌.将本技术的实体瘤筛选NGS测定用于询问提交用于HER-2、ER 和PR测试的30个乳腺癌样本。见图6E。通过IHC和/或FISH测定30个乳腺癌FFPE样品中28个的HER-2状态。在22个HER-2阴性样本中，11个(50％) 在RTK或PI3K通路基因中包含突变：9个突变在PIK3CA中；2在ERBB2中； 1在PIK3R1中；1在PTEN中；且1个在BRAF中(图7)。值得注意的是，所有含有ERBB2或BRAF突变的HER-2阴性样品也有共同发生的PIK3CA突变 (图7)。6个HER-2阳性样本的其中一个也含有PIK3CA突变。图7显示了 HER-2、ER和PR不同组合的详细突变概况。

实施例7：对治疗选择的影响

该实施例证明了本技术的实体肿瘤筛选NGS测定的更广泛的突变分析提供了超越常规Sanger测序的与治疗选择有关的额外信息。该额外信息作为下述结果来阐明：通常在给定的肿瘤类型中未测试的测序基因或基因区域、鉴定共存基因突变以及本文公开的方法相对于标准Sanger测序的提高的敏感性。

如图6(A)-(E)和图7所示，本技术的实体肿瘤筛选NGS测定可以为提交用于分子测试的大部分FFPE样品提供更完整的分子概貌。例如，76％(92/121) 的测试FFPE样本产生至少一个额外的基因突变，其通过常规Sanger测序未被确定。此外，本技术的方法使得鉴定了16个可作用的突变(黑色素瘤中3 例BRAF，结直肠癌中2例KRAS、2例BRAF和1例NRAS，肺癌中2例EGFR 和6例KRAS)，这些突变未被常规Sanger测序检测到，其很可能影响选择的治疗策略。

此外，由本技术的方法鉴定的多种共同发生的突变可用于改变或设计定制的治疗方案。这些包括考虑替代抗HER-2治疗(例如曲妥珠单抗emtansine)、EGFR TKI(例如吉非替尼)、BRAF抑制剂(例如维罗非尼或达拉非尼)、Src-家族酪氨酸激酶抑制剂(例如达沙替尼)、MEK抑制剂(例如司美替尼)、和/或替代或去除经典的抗HER-2治疗(例如曲妥珠单抗)、ALK/c-MET抑制剂(例如克里唑蒂尼)或抗EGFR治疗(例如西妥昔单抗)。

黑素瘤.BRAF抑制剂维罗非尼是黑素瘤最常见的靶向治疗药物，用于治疗BRAFV600突变阳性的肿瘤。如表5所示，大多数黑素瘤样本(30/31)提交了常规BRAF检测。根据最初的cobas BRAF测试，31个黑素瘤样品中的21 个(68％)测试为阴性。然而，使用本技术的方法，两个阴性样本被鉴定为含有 BRAF V600E的双核苷酸变异，并且可能受益于维罗非尼的治疗。

此外，四个BRAF突变阴性样本确定为含有NRAS中的突变(图6B)。临床研究表明，NRAS突变可能表明对维罗非尼缺乏响应性。Su等,N Engl J Med 366:207-215(2012)。但是，这些突变可能对MEK抑制剂有响应。Ascierto等, Lancet Oncol.14(3):249-56(2013)。

因此，本技术的实体肿瘤筛选NGS测定可用于确定黑素瘤患者是否可能对维罗非尼或MEK抑制剂的治疗响应。

另外还值得注意的是在EGFR、MET、FGFR3、IDH1和/或PTEN中共同发生突变的BRAF阳性样本的高比例。图6B。据预测，这种共同发生的突变将影响对靶向治疗的响应。另外，在BRAF突变阴性样本中检测到一个PIK3CA 和一个MET突变。图6B。因此，本技术的实体瘤筛选NGS测定可用于确定黑素瘤患者是否可能对使用调节PIK3CA或MET活性的药物的治疗响应。

结肠直肠癌.在最初通过Sanger测序测试KRAS、BRAF、NRAS和/或 PIK3CA突变的33个结肠直肠癌样本中，24(73％)个测试为阴性，因此表明对抗EGFR治疗的有利响应。惊人的是，根据Sanger测序检测为阴性的样本中有11例(46％)被鉴定为至少一种EGFR下游基因突变阳性：非密码子12/13/61 KRAS(2)、BRAF(2)、NRAS(1)、PIK3CA(5)或PTEN(1)。因此，本技术的实体瘤筛选NGS测定显示61％的结肠直肠癌样品对抗EGFR疗法缺乏响应性，而常规Sanger测序所预测的为27％。

因此，本技术的实体肿瘤筛选NGS测定法可用于确定结肠直肠癌患者是否可能对使用抗EGFR疗法(例如，西妥昔单抗)的治疗响应。

肺癌.总体而言，至少有37％(10/27)的肺癌FFPE样本含有突变，表明超出常规Sanger测序所提供的靶向治疗响应。如图6D所示，27个肺癌FFPE 样本的初始Sanger测序检测到一个样本中的EGFR突变，四个中的KRAS突变和两个中的ALK重排。剩余的20个样本对于最初测试的所有突变都是阴性的。然而，本技术的实体瘤筛选NGS测定将一个样本(根据常规Sanger测序测试为阴性)鉴定为活化EGFR△E746_A750突变，其具有6％的低变异频率。

因此，本技术的实体瘤筛选NGS测定可用于确定肺癌患者是否可能对使用EGFRTKI的治疗响应。在一些实施方案中，患者具有低肿瘤细胞负荷。

此外，根据常规Sanger测序，一个肺癌FFPE样本测试了ALK重排阳性，由此表明对克里唑蒂尼的有利反应。然而，本技术的实体瘤筛选NGS测定鉴定了KRAS中的活化突变(密码子22)，其与对克唑替尼缺乏响应性相关。

因此，本技术的实体肿瘤筛选NGS测定可用于确定肺癌患者是否可能对使用克里唑蒂尼的治疗响应。

值得注意的是，本技术的方法在根据Sanger测序检测为阴性的20个肺癌样本中鉴定了另外9个(45％)为KRAS、BRAF、MET和DDR2中的改变的阳性。BRAF抑制剂维罗非尼和dabrafenib已被添加到针对含有BRAF突变的样本的NCCN指南“具有针对肺癌中的驱动事件活性的可用靶向作用剂”列表中，Sánchez-Torres等,Transl Lung Cancer Res 2(3):244-250(2013)。此外，目前正在研究达沙替尼用于治疗含有DDR2突变的肿瘤。Bail等,CancerRes. 2014 Oct 27(epub ahead of print)。

因此，本技术的实体肿瘤筛选NGS测定可用于确定肺癌患者是否可能对使用维罗非尼、达拉菲尼、达沙替尼或MEK抑制剂司美替尼的治疗响应。

乳腺癌.30个乳腺癌样本中的28个提交用于HER-2、ER和PR检测。其中，有6例(21％)HER-2阳性，因此可能是曲妥珠单抗治疗的候选(图7)。虽然6例HER-2阳性病例中的5个在ERBB或PI3K通路基因中未显示额外的突变，但本技术的实体肿瘤筛选NGS测定在一个样品中检测到PIK3CA突变。这是显着的，因为HER-2阳性肿瘤中的PIK3CA突变与对常规抗HER-2 疗法(例如曲妥珠单抗和拉帕替尼)缺乏响应性有关。Berns等,Cancer Cell 12:395–402(2007)。然而，曲妥珠单抗emtansine(Kadcyla，Genentech)可能对这类肿瘤的治疗有效，因为同时的PIK3CA突变似乎不会改变这种替代疗法的结果(American Associationfor Cancer Research[AACR]104th Annual Meeting:Abstract LB-63.Presented April8,2013)。

因此，本技术的实体瘤筛选NGS测定法可用于确定诊断为乳腺癌的 HER-2阳性患者是否可能对使用抗HER-2疗法或曲妥珠单抗emtansine的治疗响应。

HER-2阴性乳腺癌样本的一半(11/22)在ERBB和/或PI3K通路基因中含有突变。大多数观察到PIK3CA中的突变，包括包含共同发生的ERBB2或 BRAF突变的亚群(图7)。还观察到PTEN中的突变。PIK3CA和PTEN突变的总体观察频率(分别为37％和3％)与TCGA数据(doi：10.1038/nature11412)一致。

重要的是，含有PIK3CA激酶结构域突变或PTEN功能缺失突变(没有共同发生的BRAF或KRAS突变)的乳腺癌已被证明对使用PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂如依维莫司的治疗响应。Sánchez-Torres等,Transl Lung Cancer Res 2(3):244-250(2013)。预计这些突变将作为指导涉及抗HER-2疗法和 PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂的治疗策略的生物标志物。

因此，本技术的实体肿瘤筛选NGS测定法可用于确定诊断为乳腺癌的患者是否可能对使用PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂的治疗响应。

等价物

本技术不受在本申请中描述的特定实施例的限制，其旨在作为本技术的各个方面的单独阐释。本技术的许多修改和变化可以在不脱离其精神和范围的情况下进行，这对于本领域技术人员是显而易见的。在本技术范围内的功能上等同的方法和装置，除了本文列举的那些外，对于本领域技术人员来说，从前面的描述中将是显而易见的。这样的修改和变化旨在落入本技术的范围内。应该理解，本技术不限于特定的方法、试剂、化合物组合物或生物系统，其当然可以变化。还应该理解，这里使用的术语仅仅是为了描述特定实施例的目的，而不是限制性的。

另外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开还由此就马库什组的任何个体成员或亚组成员进行了描述。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括任何和全部可能的子范围以及子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地识别为充分描述并使相同的范围被分解成至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等等。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员所理解的，所有的语言例如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所列举的数字，并且是指可以随后分解成如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组等等。

本文引用或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物通过引用全文并入，包括所有图和表，只要其不与本说明书的明确教导相矛盾。

Claims

1.用于在受试者中的多个癌症相关基因中检测至少一种突变的方法，其包括：

(a)从获得自所述受试者的福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取基因组DNA；

(b)生成包含对应多个癌症相关基因的每一种的扩增子的文库，所述多个癌症相关基因包含AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN，其中

(i)独立于使用包含与所述多个扩增子中的至少一个互补的核酸序列的诱饵集进行所述文库的生成；和

(ii)在生成所述文库前不使用定量PCR评估自所述福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取的基因组DNA的质量；

(c)将接头序列与所述多个扩增子的末端连接；和

(d)使用高通量大规模平行测序在多个扩增子的至少一种中检测至少一种突变。

2.权利要求1的方法，其中所述多个扩增子通过选自下组的至少两个引物对生成：

3.权利要求1-2任一项的方法，其中所述包含对应多个癌症相关基因的每一个的扩增子的文库使用不多于10ng自福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取的基因组DNA生成。

4.权利要求1-2任一项的方法，其中所述包含对应多个癌症相关基因的每一个的扩增子的文库使用11-25ng自福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品提取的基因组DNA生成。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述高通量大规模平行测序使用下述实施：焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、Helioscope单分子测序、合成测序、连接测序或SMRT^TM测序。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述接头序列是P5接头、P7接头、P1接头、A接头或Ion Xpress^TM条码接头。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述多个扩增子进一步包含特有的索引序列。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品是异质性肿瘤。

9.权利要求8的方法，其中5％的所述异质性肿瘤的细胞在所述多个扩增子的至少一种中含有至少一种突变。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述受试者诊断患有乳腺癌、黑色瘤、结肠直肠癌或肺癌。

11.选择用于使用PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂和至少一种其他作用剂治疗的受试者的方法，其包括：

(a)从获得自所述受试者的福尔马林固定石蜡包埋的样本提取基因组DNA；

(b)生成包含对应所述多个癌症相关基因的每一种的扩增子的文库，所述多个癌症相关基因包含AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN，其中

(c)在所述多个扩增子的至少一个中检测至少一种突变；和

(d)如果检测到对应PIK3CA、PIK3R1和PTEN的扩增子的至少一种中的突变和对应NOTCH1、ERBB2、BRAF、PTCH1、SMO、EGFR、KRAS、DDR2、MAP2K1、FGFR3、NRAS、MET和FBXW7的扩增子的至少一种中的突变，则选择所述受试者用于使用PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂和至少一种其他作用剂的治疗。

12.权利要求11的方法，其中对应PIK3CA的扩增子通过选自下组的引物对生成：5’CCTAGTAGAATGTTTACTACCAA3’(SEQ ID NO.:__)和5’CTGCTTCTTGAGTAACACTT 3’(SEQ IDNO.:__)；5’CATGTTCATGCTGTGTATGT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’GCTTCTTTACAAACGTTCAGAA3’(SEQ ID NO.:__)；5’TCTATGTTCGAACAGGTATCT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ACTGCTAAACACTAATATAACCTTTG 3’(SEQ ID NO.:__)；5’TTGAAATGTGTTTTATAATTTAGACTAGT3’(SEQ ID NO.:__)和5’CCATGAGGTACTGGCC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’TTGGTGTTACTGGATCAAATC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’TGCTGAACCAGTCAAACT 3’(SEQ IDNO.:__)；5’TATTATTTTATTTTACAGAGTAACAGACTAG 3’(SEQ ID NO.:__)和5’TTTAGCACTTACCTGTGACT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’TGGAATGCCAGAACTACA3’(SEQ ID NO.:__)和5’GTGGAAGATCCAATCCATTTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GGAATGAATGGCTGAATTATG 3’(SEQ IDNO.:__)和5’GCGGTATAATCAGGAGTTTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’AGTTGGCCTGAATCACTATA3’(SEQ ID NO.:__)和5’GATGTTACTATTGTGACGATCTC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GTAAGTGTTACTCAAGAAGC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ATAGGATATTGTATCATACCAATTTCT 3’(SEQID NO.:__)；5’TCCACAGCTACACCATATAT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’AGCATCAGCATTTGACTTTA3’(SEQ ID NO.:__)；5’TACACAGACACTCTAGTATCTG 3’(SEQ ID NO.:__)和5’GAAGGTTTGACTGCCATAAA3’(SEQ ID NO.:__)；5’ATGACAAAGAACAGCTCAAA3’(SEQ ID NO.:__)和5’GAGATCAGCCAAATTCAGTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GATGTGTTACAAGGCTTATCTA3’(SEQ IDNO.:__)和5’GCCTCTTGCTCAGTTTTATC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GAGGCTTTGGAGTATTTCA3’(SEQID NO.:__)和5’CTGCTGAGAGTTATTAACAGT 3’(SEQ ID NO.:__)；和5’GCTTTTGGAGTCCTATTGT3’(SEQ ID NO.:__)和5’CACAAACTAGAGTCACACAC 3’(SEQ ID NO.:__)。

13.权利要求11-12任一项的方法，其中对应PIK3R1的扩增子通过选自下组的引物对生成：5’GGGTTTTGGGCTGATATTA3’(SEQ ID NO.:__)和5’CCACAGAACTGAAGGTTAAT 3’(SEQ IDNO.:__)；5’TTATCCATTGAATTTATTTTAATCTTTCTAG 3’(SEQ ID NO.:__)和5’GGGATGTGCGGGTATATT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GTCTTGCAGTAAGAGATTGT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’TCTTTGCTGTACCGCT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GTTTCTTTTGCCTGCA3’(SEQ ID NO.:__)和5’TGGATAAGGTCTGGTTTAATG 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GCTACAATTCAGGATGAGTTA3’(SEQ IDNO.:__)和5’TCTTCTGCTATCACCATCTTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’CCATCATGATGAGAAGACAT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’TTGCTGGAGATACATACACT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GTGGTCACTAAACCTTAAGA3’(SEQ ID NO.:__)和5’GGCTTACCTTAGTGTAAGAG 3’(SEQ IDNO.:__)；5’TTTCATCGAGATGGGAAATATG 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ACCTGTTGGTATTTGGATACT3’(SEQ ID NO.:__)；5’AGAAGATAATATTGAAGCTGTAGG 3’(SEQ ID NO.:__)和5’AGAACTCTTATTTTTTAATCTGATTTTCA3’(SEQ ID NO.:__)；5’GGACAGCTATTGAAGCATTTA3’(SEQID NO.:__)和5’CACAAGAACAAGGGAAACAC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GCAGGCAGCTGAGTATC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’TCATCCTGAATTGTAGCAATCA3’(SEQ ID NO.:__)。

14.权利要求11-13任一项的方法，其中对应PTEN的扩增子通过选自下组的引物对生成：5’CAGCTTCTGCCATCTCT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’AGCAGCCGCAGAAAT 3’(SEQ IDNO.:__)；5’GTGGCTTTTTGTTTGTTTG3’(SEQ ID NO.:__)和5’CACTCTAACAAGCAGATAACT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’TACTTGTTAATTAAAAATTCAAGAGTTTT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’CTTAGCCATTGGTCAAGATC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ACAATCATGTTGCAGCA3’(SEQ ID NO.:__)和5’AAAAACATCAAAAAATAACTTACCTTTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’AGAGGCGCTATGTGTATTA3’(SEQID NO.:__)和5’CATGGAAGGATGAGAATTTCA3’(SEQ ID NO.:__)；5’GGAAGACAAGTTCATGTACT3’(SEQ ID NO.:__)和5’CTGTCCTTATTTTGGATATTTCTC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’ATTAATTAAATATGTCATTTCATTTCTTTTTC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’GCTATCGATTTCTTGATCACA3’(SEQ ID NO.:__)；5’TGAGTCATATTTGTGGGTTTTC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’TGATCAGGTTCATTGTCACTAA3’(SEQ ID NO.:__)；5’TTTGATTGCTGCATATTTCAG 3’(SEQ IDNO.:__)和5’TCAAAGCATTCTTACCTTACTAC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’TTTTAAACTTTTCTTTTAGTTGTGC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ACTCGATAATCTGGATGACT 3’(SEQ IDNO.:__)；5’CAATTTAGTGAAATAACTATAATGGAAC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’AGTGCCACTGGTCTATAAT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’CCTGTGAAATAATACTGGTATGT 3’(SEQ IDNO.:__)和5’CTACTTTGATATCACCACACAC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’TAGAGCGTGCAGATAATGA3’(SEQ ID NO.:__)和5’TCAACAACCCCCACAAA3’(SEQ ID NO.:__)；和5’CTTTCTCTAGGTGAAGCTGTA3’(SEQ ID NO.:__)和5’GGTTCATTCTCTGGATCAGA3’(SEQ IDNO.:__)。

15.权利要求11-14任一项的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋的样本是异质性肿瘤。

16.权利要求15的方法，其中5％-10％的所述异质性肿瘤的细胞在多个扩增子的至少一种中含有至少一种突变。

17.权利要求15的方法，其中至少10％的所述异质性肿瘤的细胞在多个扩增子的至少一种中含有至少一种突变。

18.权利要求11-17任一项的方法，其中所述PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂选自下组：BKM120,BEZ235、Pictilisib(GDC-0941)、LY294002、CAL-101(Idelalisib)、GNE-317、PI-3065、HS-173、PI-103、NU7441、GSK2636771、VS-5584、CZC24832、Duvelisib、TG100-115、A66、YM201636、CAY10505、GSK1059615、PF-04691502、PIK-75、PIK-93、AS-605240、BGT226、AZD6482、Voxtalisib、Alpelisib、CUDC-907、IC-87114、Omipalisib、TG100713、Gedatolisib、CH5132799、PKI-402、BAY 80-6946、TGX-221、XL147、PIK-90、PIK-293、PIK-294、3-甲基腺嘌呤、槲皮素、渥曼青霉素、ZSTK474、AS-252424、AS-604850、依维莫司和Apitolisib。

19.权利要求11-18任一项的方法，其中所述受试者诊断为具有HER-2阴性乳腺癌。

20.权利要求19的方法去，其中所述至少一种其他作用剂选自下组：Notch通路抑制剂、BRAF抑制剂、SMO拮抗剂、MET抑制剂和ERBB2拮抗剂。

21.权利要求20的方法，其中所述Notch通路抑制剂选自下组：FLI-06、LY411575、Dibenzazepine、RO4929097、化合物E、Z-Leu-Leu-Nle-CHO、SAHM1、TR4和Semagacestat。

22.权利要求20的方法，其中所述SMO拮抗剂选自下组：嘌吗啡胺、Taladegib(LY2940680)、环王巴明、Vismodegib(GDC-0449)、LDE225、Glasdegib(PF-04449913)、PF-5274857、TAK-441、SANT-1、BMS-833923、GANT61和IPI-926。

23.权利要求20的方法，其中所述ERBB2拮抗剂选自下组：拉帕替尼、卡奈替尼、CP-724,714、AZD8931、AEE788、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 879、Mubritinib和帕妥珠单抗。

24.权利要求20的方法，其中所述BRAF抑制剂选自下组：GDC-0879、SB590885、Encorafenib、RAF265、TAK-632、PLX4720、CEP-32496、AZ628、索拉非尼Tosylate、索拉非尼、维罗非尼(Zelboraf)和达拉非尼(GSK2118436)。

25.权利要求11-18任一项的方法，其中所述受试者诊断为具有结肠直肠癌。

26.权利要求25的方法，其中所述至少一种其他作用剂选自下组：Notch通路抑制剂、FGFR3拮抗剂和RAF/MEK/ERK抑制剂。

27.权利要求26的方法，其中所述RAF/MEK/ERK抑制剂选自下组：维罗非尼(Zelboraf)和达拉非尼(GSK2118436)、Encorafenib、TAK-632、PLX4720、MLN2480、Cobimetinib(GDC-0973)、MEK 162、RO5126766、GDC-0623、VTX11e、Selumetinib(AZD6244)、PD0325901、曲美替尼(GSK1120212)、U0126-EtOH、PD184352(CI-1040)、Refametinib、PD98059、BIX02189、Binimetinib、Pimasertib(AS-703026)、SL327、BIX02188、AZD8330、TAK-733、PD318088、SCH772984和FR 180204。

28.权利要求26的方法，其中所述Notch通路抑制剂选自下组：FLI-06、LY411575、Dibenzazepine、RO4929097、化合物E、Z-Leu-Leu-Nle-CHO、SAHM1、TR4和Semagacestat。

29.权利要求26的方法，其中所述FGFR3拮抗剂选自下组：BGJ398(NVP-BGJ398)、AZD4547、LY2874455、多韦替尼双乳酸、多韦替尼、多韦替尼乳酸盐、CH5183284和尼达尼布。

30.权利要求11-18任一项的方法，其中检测到对应BRAF、MAP2K1和NRAS的扩增子中的至少一种中的突变和对应FGFR3和SMO的扩增子的至少一种中的突变，且其中将所述受试者诊断为具有黑素瘤。

31.权利要求30的方法，其中所述至少一种其他作用剂为RAF/MEK/ERK抑制剂、FGFR3拮抗剂、SMO拮抗剂或其组合。

32.在诊断为具有乳腺癌的HER-2阳性受试者中用于预测对使用抗HER-2疗法的治疗缺乏响应性的可能性的方法，其包括：

(a)从获得自HER-2阳性受试者的福尔马林固定石蜡包埋的样本提取基因组DNA；

(b)生成包含对应多个癌症相关基因的每一种的扩增子的文库，所述多个癌症相关基因包括：AKT1、ERBB2、FOXL2、IDH2、NRAS、RET、ALK、ERBB4、GNA11、KIT、PDGFRA、SMO、BRAF、FBXW7、GNAQ、KRAS、PIK3CA、STK11、CTNNB1、FGFR2、GNAS、MAP2K1、PIK3R1、TP53、DDR2、FGFR3、HRAS、MET、PTCH1、EGFR、FGFR4、IDH1、NOTCH1和PTEN，其中

(c)在所述多个扩增子的至少一个中检测至少一种突变；和

(d)当检测到对应PIK3CA、PIK3R1和PTEN的扩增子的至少一种中的突变时，将所述HER-2阳性受试者鉴定具有对使用抗HER-2疗法的治疗缺乏响应性的可能性。

33.权利要求32的方法，其中所述抗HER-2疗法是曲妥珠单抗或拉帕替尼。

34.权利要求32-33任一项的方法，其中对应PIK3CA的扩增子通过选自下组的引物对生成：5’CCTAGTAGAATGTTTACTACCAA3’(SEQ ID NO.:__)和5’CTGCTTCTTGAGTAACACTT 3’(SEQID NO.:__)；5’CATGTTCATGCTGTGTATGT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’GCTTCTTTACAAACGTTCAGAA3’(SEQ ID NO.:__)；5’TCTATGTTCGAACAGGTATCT 3’(SEQ IDNO.:__)和5’ACTGCTAAACACTAATATAACCTTTG 3’(SEQ ID NO.:__)；5’TTGAAATGTGTTTTATAATTTAGACTAGT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’CCATGAGGTACTGGCC 3’(SEQ IDNO.:__)；5’TTGGTGTTACTGGATCAAATC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’TGCTGAACCAGTCAAACT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’TATTATTTTATTTTACAGAGTAACAGACTAG 3’(SEQ ID NO.:__)和5’TTTAGCACTTACCTGTGACT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’TGGAATGCCAGAACTACA3’(SEQ ID NO.:__)和5’GTGGAAGATCCAATCCATTTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GGAATGAATGGCTGAATTATG 3’(SEQ IDNO.:__)和5’GCGGTATAATCAGGAGTTTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’AGTTGGCCTGAATCACTATA3’(SEQ ID NO.:__)和5’GATGTTACTATTGTGACGATCTC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GTAAGTGTTACTCAAGAAGC 3’(SEQ ID NO.:__)和5’ATAGGATATTGTATCATACCAATTTCT 3’(SEQID NO.:__)；5’TCCACAGCTACACCATATAT 3’(SEQ ID NO.:__)和5’AGCATCAGCATTTGACTTTA3’(SEQ ID NO.:__)；5’TACACAGACACTCTAGTATCTG 3’(SEQ ID NO.:__)和5’GAAGGTTTGACTGCCATAAA3’(SEQ ID NO.:__)；5’ATGACAAAGAACAGCTCAAA3’(SEQ ID NO.:__)和5’GAGATCAGCCAAATTCAGTT 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GATGTGTTACAAGGCTTATCTA3’(SEQ IDNO.:__)和5’GCCTCTTGCTCAGTTTTATC 3’(SEQ ID NO.:__)；5’GAGGCTTTGGAGTATTTCA3’(SEQID NO.:__)和5’CTGCTGAGAGTTATTAACAGT 3’(SEQ ID NO.:__)；和5’GCTTTTGGAGTCCTATTGT3’(SEQ ID NO.:__)和5’CACAAACTAGAGTCACACAC 3’(SEQ ID NO.:__)。

35.权利要求32-34任一项的方法，其中当检测到对应PIK3CA、PIK3R1和PTEN的扩增子的至少一种中的突变时，使用曲妥珠单抗emtansine治疗所述HER-2阳性受试者。

36.权利要求32-35任一项的方法，其中所述受试者的HER-2阳性状态通过免疫组化(IHC)或荧光原位杂交(FISH)测定。

37.选择用于以EGFR酪氨酸激酶抑制剂和至少一种其他作用剂治疗的受试者的方法，其包括：

(a)从获得自受试者的福尔马林固定石蜡包埋的样本提取基因组DNA；

(c)在所述多个扩增子的至少一个中检测至少一种突变；和

(d)如果检测到对应EGFR的扩增子的至少一种中的突变和对应KRAS、PIK3R1和BRAF的扩增子的至少一种的的突变，则选择所述受试者用于使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂和至少一种其他作用剂的治疗。

38.权利要求37的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋的样本示异质性肿瘤。

39.权利要求38的方法，其中5％-10％的所述异质性肿瘤的细胞含有在多个扩增子的至少一种中的至少一种突变。

40.权利要求38的方法，其中至少10％的所述异质性肿瘤的细胞含有在多个扩增子的至少一种中的至少一种突变。

41.权利要求37-40任一项的方法，其中所述EGFR酪氨酸激酶抑制剂是吉非替尼或厄洛替尼。

42.用于在诊断为具有黑素瘤的受试者中预测对使用维罗非尼的治疗响应性的可能性的方法，其包括：

(c)在所述多个扩增子的至少一个中检测至少一种突变；和

(d)当检测到对应BRAF的扩增子的至少一种中的突变时将所述受试者鉴别为具有至少一种对使用维罗非尼的治疗高的响应可能性，且当检测到对应NRAS的扩增子的至少一种中的突变时将所述受试者鉴别为具有对使用维罗非尼的治疗低的响应可能性。