JP5967699B2 - 遺伝子発現解析による大腸がんの病型分類に基づく抗癌剤応答性及び予後の予測方法 - Google Patents
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Description
更に、患者から得たサンプルの遺伝子発現プロファイルからp53遺伝子の変異の有無を検出する方法(特許文献3)や、遺伝子発現プロファイルをクラスター解析することで急性骨髄性白血病の分類、診断、予後を決定する技術(特許文献4)が開発されている。
すなわち、本発明の第一の態様は以下のとおりである。
(1)被験者の大腸癌組織又は大腸癌細胞から得た検体におけるクラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子の発現量を測定する工程と、
(2)前記発現量から得られた各クラスターの個別発現プロファイルと、予め求めた各クラスターの平均発現プロファイルとの間の相関係数を求める工程、及び
(3)クラスターA又はクラスターBのいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに、及び、クラスター1又はクラスター2のいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに当該検体を帰属させる工程からなり、
抗EGFR抗体投薬治療において、クラスターA2 に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間はクラスターB2に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間に比べて長いという基準に基づき、大腸癌患者の抗EGFR抗体に対する応答性を予測する方法。
(1)被験者の大腸癌組織又は大腸癌細胞から得た検体におけるクラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子の発現量を測定する工程と、
(2)前記発現量から得られた各クラスターの個別発現プロファイルと、予め求めた各クラスターの平均発現プロファイルとの間の相関係数を求める工程、及び
(3)クラスターA又はクラスターBのいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに、及び、クラスター1又はクラスター2のいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに当該検体を帰属させる工程からなり、
オキサリプラチン (oxaliplatin: l-OHP)を含む1次治療において、クラスターB1に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間はクラスターA2に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間に比べて長いという基準に基づき、大腸癌患者の抗癌剤に対する応答性を予測する方法。
(1)被験者の大腸癌組織又は大腸癌細胞から得た検体におけるクラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子の発現量を測定する工程と、
(2)前記発現量から得られた各クラスターの個別発現プロファイルと、予め求めた各クラスターの平均発現プロファイルとの間の相関係数を求める工程、及び
(3)クラスターA又はクラスターBのいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに、及び、クラスター1又はクラスター2のいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに当該検体を帰属させる工程からなり、
オキサリプラチン (oxaliplatin: l-OHP)を含む1次治療において、クラスター1に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間はクラスター2に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間に比べて長いという基準に基づき、大腸癌患者の抗癌剤に対する応答性を予測する方法。
上記の各遺伝子又の少なくとも一部の塩基配列の具体例としては、例えば、アジレントテクノロジー社のeArray (https://earray.chem.agilent.com/earray/)のサイトからダウンロードすることができる、各遺伝子の全配列の一部(60塩基配列)を挙げることが出来る。
上記キットには、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート(容器)等が含まれる。
1.研究対象
研究対象は2005年から2010年までに切除不能進行再発大腸癌の診断でがん薬物療法を施行した症例100例である。このうち、90症例を学習セット、10症例を検証セットとして用いた。対象症例は原発巣が切除され、そのFFPE組織が入手可能であることを条件とした。東北大学医学部医学系研究科倫理委員会で承認を受けた「大腸癌の分子診断法に関する研究」(承認番号2008-238)に基づいてインフォームド・コンセントを得た。また、同じく承認を受けた「大腸癌における治療法選択のための分子マーカー開発に関する研究」(承認番号2005-218)の対象症例でヒトゲノム遺伝子解析について包括的同意が得られている症例で、患者の死亡などにより本研究の同意が得られない症例はB群検体として本研究の対象患者に含めた。
手術にて切除された100症例の大腸癌原発巣のFFPE組織を収集し、連結可能匿名化を行った。FFPE組織を、ミクロトームを用いて組織染色用に3μm、RNAまたはDNA抽出用に5μmまたは10μmの厚さに薄切し、病理組織診断用のスライドグラスに貼り付けた。
上記スライドグラス1枚をHE染色し、顕微鏡で腫瘍部分を確認後、未染標本から腫瘍部分を採取した。RNA抽出用として5μmを4枚または10μmを2枚、DNA抽出用として5μmを2枚または10μmを1枚用いた。
マクロダイセクションで採取したFFPE組織からAbsolutely RNA FFPE Kit (Agilent Technologies 社)を用いて、1検体当たり0.5〜10μgのRNAを抽出した。また、QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN 社)を用いて、1検体当たり5〜20μgのDNAを抽出した。
TP53遺伝子のエクソン5、6、7および8、KRAS遺伝子のコドン12、13および61、BRAF遺伝子のコドン600、PIK3CA遺伝子のエクソン9および20に対してDNAダイレクトシークエンス法による遺伝子変異解析を行った。PCRによるDNAの増幅にはTaKaRa EX Taq (タカラバイオ株式会社)を使用した。TP53のPCRプライマーとPCR条件は表1と表2の通りである。その他の遺伝子は添田ら39が報告した方法で解析した。
MLH1タンパク質のIHCは、anti-MLH1 monoclonal antibody (BD bioscience)を用いて東北大学病院病理部で行われた。MLH1はリンパ球などの正常細胞の核が染色されるため、これをポジティブコントロールとして、腫瘍細胞の核が染色されない場合を陰性と診断することとし、病理専門医が診断した。
(1) 全トランスクリプトーム増幅
TransPlex(登録商標)Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (Sigma-Aldrich 社)を用いて、抽出したRNA 150〜300ngをcDNAに逆転写し、PCRで増幅した。QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN 社)を用いて増幅したcDNAを精製した。その結果、6〜15μgのcDNAが得られた。
(2) cDNA標識
Genomic DNA ULS Labeling Kit (Agilent Technologies 社)を用いて、増幅したcDNAを蛍光標識した。cDNA 1.5μgをヌクレアーゼフリー水で溶解して16.5μlとし、ULSTM-CyTM3 Reagent を1.5μl、10×Labeling Solutionを2μl加えて、総量を20μlにした。この反応液を85℃で30分間インキュベーションし、氷上で冷却した。KREApureTM purification column (Genomic DNA ULS Labeling Kitの付属品)で未標識の蛍光色素を除去した。吸光度計を用いて、標識されたcDNAの蛍光色素の取り込み効率を測定し、マイクロアレイへのハイブリダイゼーションに適切な1.5〜3.0%の範囲にあることを確認した。
(3) マイクロアレイのハイブリダイゼーション・洗浄・蛍光シグナルの画像化とシグナルの数値化
Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Technologies 社)を用いてハイブリダイゼーションを行った。標識されたcDNA 19μlに100×Blocking Agentを1.1μl、ヌクレアーゼフリー水を7.9μl、2×HI-RPMを55μl加えて、95℃で3分間インキュベーションし、氷上で冷却した。反応液にAgilent CGH-Block (Genomic DNA ULS Labeling Kitの試薬)を27μl加え、総量を110μlとした。そのうち100μlをWhole Human Genome Oligo Microarray Kit (4×44K) (Agilent Technologies 社)にハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションオーブンを65℃に設定し、10rpmで回転させながら17時間のハイブリダイゼーションを行ったのちに、マイクロアレイをGene Expression Wash Pack (Agilent Technologies 社)のWash Buffer 1で1分間、37℃に加温したWash Buffer 2で1分間洗浄した。Agilent DNA マイクロアレイスキャナ(Agilent Technologies 社)を使用して洗浄したマイクロアレイを画像化した。Agilent Feature Extraction ソフトウェア (Agilent Technologies 社)を使用してマイクロアレイの画像を数値化した。
GeneSpring version 11.5.1 (Agilent Technologies 社)を使用して遺伝子発現のデータ解析を行った。各サンプルのシグナル分布を75パーセンタイルでそろえ、遺伝子発現データの標準化を行った40。その後、各遺伝子のシグナルの中央値が0になるようにベースラインシフトを行った。シグナルがスキャナーで検出できない遺伝子は解析対象から除外した。この結果、44,000遺伝子から40,914遺伝子が採用された。さらにサンプル間でシグナル値変化の大きい遺伝子、すなわちシグナル値のばらつきが大きい遺伝子を抽出するため、シグナル分布の標準偏差が1.0以上となる遺伝子を採用した。結果、40,914遺伝子から25,454遺伝子が抽出された。以後、この25,454遺伝子を統計学的解析の対象とした。教師なし階層クラスター解析は、類似度をピアソン相関係数、クラスター間の距離を最遠距離法に設定して行われた。
症例背景および臨床経過の統計解析にはマイクロソフトエクセルとそのアドインソフトStatMate IV(株式会社アトムス)を使用した。症例背景において有意差検定のためにカイ二乗検定を行った。生存曲線はKaplan-Meier法で作成され、Logrank法にて差の検定を行った。
腫瘍縮小効果の判定にはRECIST ver1.0 (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors; 固形癌の治療効果判定基準)を用い、完全奏効 (Complete Response ; CR)、部分奏効 (Partial Response ; PR)、安定 (Stable Disease ; SD)、増悪 (Progression Disease ; PD)で評価した。奏効率 (Response Rate ; RR)はCRとPR症例の合計を全症例数で割ることで算出された。
治療を開始した日から、画像診断または臨床的に増悪と判定した日までの期間を無増悪生存期間とした。
転移性大腸癌または切除不能進行再発大腸癌として、1次治療を開始した日から、患者が死亡した日までの期間を全生存期間とした。
l-OHP及びCPT-11などの古典的抗がん剤又は抗EGFR抗体薬を含む治療は表3〜7に示されるレジュメに従って実施した。
1.網羅的遺伝子発現データの教師なしクラスター解析
大腸癌細胞又は組織由来の25,454遺伝子を対象とした網羅的遺伝子発現データを用いて教師なしクラスター解析を行った結果、大腸癌は階層的に大きく2つのクラスターに分けられ、それぞれクラスターAとBと名付けた。そして、さらにそれぞれが2つに分かれ、計4つサブグループを形成し、クラスターA1、A2、B1およびB2と名付けた (図8)。
マイクロアレイ解析の結果に基づき、以下に示されるように、クラスターAとBを分ける6,014遺伝子 (クラスターAを特徴づける2,899遺伝子(「クラスターA遺伝子」という)+クラスターBを特徴づける3,115遺伝子(「クラスターB遺伝子」という))と、クラスター1と2を分ける2,174遺伝子 (クラスター1を特徴づける471遺伝子(「クラスター1遺伝子」という)+クラスター2を特徴づける1,703遺伝子(「クラスター2遺伝子」という))を抽出した 。
同様に、検証セットの10例について、学習セットより得られた平均的なクラスターA、B、1及び2を特徴づける上記の全遺伝子セットを用いて、検証セットの10例を4つのクラスターに分類した。
従って、図1〜図7に示された各クラスターへの分類は、以上の結果に基づくものである。
尚、表14〜19には、個別発現プロファイルの実測値の例として、3種類〜20種類より成る各遺伝子セットの中から選択した一つのパターンにおける検証セット(各2例)についての実際の発現シグナル値を示した。
対象患者90人の年齢は36-84歳 (中央値: 64歳)であり、性別は男性57名 (63%)、女性33名 (37%)であった。原発巣は直腸が33人 (37%)と最も多かった。臨床病期はIV期が48人 (53%)と最も多く、次いでIII期が33人 (37%)であった (表103)。各クラスターにおける患者背景について、性別、年齢、原発巣、未分化組織の有無、病期で比較した。クラスターA2は病期において他のクラスターと比較し有意に早期症例が多く認められた (p=0.02)。性別、年齢、原発巣および未分化組織の有無では有意差を認めなかった。また、クラスター間での治療内容には有意差を認めなかった。
分子生物学的背景として、大腸癌の発がんにおいて重要とされるKRAS、BRAF、PI3CAおよびTP53遺伝子の変異を解析した40。また、散発性大腸癌のMSI-HのほとんどはMLH1のプロモーターのメチル化による発現消失が原因とされるため、MLH1の免疫組織染色をMSIの評価のスクリーニングとして代用した41。クラスターA2はKRAS遺伝子野生型症例が有意に多く、クラスターB2はKRAS遺伝子変異型症例が有意に多く認められた (p<0.01) (表103)。BRAF、PIK3CA、TP53遺伝子の変異およびMLH1の発現にはクラスター間に有意差を認めなかった。
クラスター間のOSを比較した。まず、クラスターA1、A2、B1およびB2を比較した場合、全症例を対象とした解析では、有意差を認めなかった (図1a)。KRAS変異の有無による、抗EGFR抗体薬の治療効果のOSへの影響を除くため、KRAS変異の有無に分けて全生存期間の解析を行った。しかし、KRAS野生型、KRAS変異型ともにクラスター間ではOSに有意差を認めなかった (図1b,c)。さらに、クラスターAとB、クラスター1と2で比較してもOSに有意差を認めなかった (図2a,b,c)。
l-OHPを含む1次治療のPFSを比較すると、クラスターB1はA2と比較してPFSが長いことが認められた (p=0.048) (図3a)。また、クラスター1は2よりPFSが長いことが認められた (p=0.017) (図3b)。
CPT-11を含む1次治療のPFSを比較すると、有意差はないもののクラスターAはBよりPFSが長い傾向を認めた (p=0.13) (図4a,b)。
l-OHPまたはCPT-11を含む1次治療のPFSを比較すると、クラスターA1はB2と比較し、有意差は認めないもののクラスターA1で延長する傾向を認めた(P=0.15)(図5a)。また、クラスター1は2と比較し、有意差は認めないもののクラスター1で延長する傾向を認めた(P=0.15)。(図5b)
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Claims (11)
- (1)被験者の大腸癌組織又は大腸癌細胞から得た検体におけるクラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子の発現量を測定する工程と、
(2)前記発現量から得られた各クラスターの個別発現プロファイルと、予め求めた各クラスターの平均発現プロファイルとの間の相関係数を求める工程、及び
(3)クラスターA又はクラスターBのいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに、及び、クラスター1又はクラスター2のいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに当該検体を帰属させる工程からなり、
抗EGFR抗体投薬治療において、クラスターA2 に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間はクラスターB2に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間に比べて長いという基準に基づき、大腸癌患者の抗EGFR抗体に対する応答性を予測する方法。 - (1)被験者の大腸癌組織又は大腸癌細胞から得た検体におけるクラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子の発現量を測定する工程と、
(2)前記発現量から得られた各クラスターの個別発現プロファイルと、予め求めた各クラスターの平均発現プロファイルとの間の相関係数を求める工程、及び
(3)クラスターA又はクラスターBのいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに、及び、クラスター1又はクラスター2のいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに当該検体を帰属させる工程からなり、
オキサリプラチン (oxaliplatin: l-OHP)を含む1次治療において、クラスターB1に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間はクラスターA2に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間に比べて長いという基準に基づき、大腸癌患者の抗癌剤に対する応答性を予測する方法。 - (1)被験者の大腸癌組織又は大腸癌細胞から得た検体におけるクラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子の発現量を測定する工程と、
(2)前記発現量から得られた各クラスターの個別発現プロファイルと、予め求めた各クラスターの平均発現プロファイルとの間の相関係数を求める工程、及び
(3)クラスターA又はクラスターBのいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに、及び、クラスター1又はクラスター2のいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに当該検体を帰属させる工程からなり、
オキサリプラチン (oxaliplatin: l-OHP)を含む1次治療において、クラスター1に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間はクラスター2に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間に比べて長いという基準に基づき、大腸癌患者の抗癌剤に対する応答性を予測する方法。 - クラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子に代えて、それらの各遺伝子集団から、夫々任意に選択した3個以上の遺伝子からなる遺伝子セットを使用することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- クラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子に代えて、それらの各遺伝子集団から、夫々任意に選択した5個以上の遺伝子からなる遺伝子セットを使用することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- クラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子に代えて、それらの各遺伝子集団から、夫々任意に選択した10個以上の遺伝子からなる遺伝子セットを使用することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- クラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子に代えて、それらの各遺伝子集団から、夫々任意に選択した20個以上の遺伝子からなる遺伝子セットを使用することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 検体がホルマリン固定パラフィン包埋 (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded : FFPE)組織である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子の発現量を該遺伝子から転写されたRNAをDNAマイクロアレイにより測定する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- クラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子の各遺伝子集団に含まれる全ての遺伝子について、各遺伝子の塩基配列の少なくとも一部、又は、
これら各遺伝子集団の夫々から任意に選択した、3個、5個、10個若しくは20個から成る各遺伝子セットに含まれる全ての遺伝子について、各遺伝子の塩基配列の少なくとも一部、
から成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法に用いるためのキット。 - ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする、請求項10記載のキット。
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