JP4880621B2 - 5−フルオロウラシル系抗癌剤に対する感受性を予測する方法 - Google Patents
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Description
本発明の要旨は以下の通りである。
(2)被験者由来の癌細胞におけるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を測定し、コピー数が2以下である場合には被験者の5−フルオロウラシル系抗癌剤に対する感受性が高いと予測し、コピー数が2よりも大きい場合には被験者の5−フルオロウラシル系抗癌剤に対する感受性が低いと予測する(1)記載の方法。
(3)ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数をPCR法又、FISH法、アレイCGH法、DNAマイクロアレイ法及びサザンハイブリダイゼーション法から成る群より選択される少なくとも1つの方法で測定する(1)又は(2)に記載の方法。
(5)ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を測定するための試薬を含む、5−フルオロウラシル系抗癌剤に対する感受性を予測するためのキット。
(6)ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を測定するための試薬が、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の全部又は一部を特異的に増幅することができるオリゴヌクレオチドプライマー又はジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴ若しくはポリヌクレオチドプローブである(5)記載のキット。
(7)配列番号5のDNA配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号6のDNA配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合せからなる一セットのプライマー。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2006‐16367の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
本発明は、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子(以下はDPYDと称すことがある)のコピー数(1細胞に含まれる遺伝子数)を指標として、5−フルオロウラシル系抗癌剤(以下は5-FUと称すことがある)に対する感受性を予測する方法を提供する。
被験者由来の癌細胞におけるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を測定するためには、癌組織や癌細胞を含む、生検体試料、摘出臓器、パラフィン包埋組織標本、血液、髄液、リンパ液、唾液、胃液、膵液、十二指腸液、腸液、便、あるいはそこから得られる培養細胞、培養組織などを用いるとよい。
癌の種類としては、胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、頭頸部癌、悪性リンパ腫、白血病、脳腫瘍、子宮癌、膀胱癌などを挙げることができる。
ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数をPCR法で測定する場合は、以下のような手順で行うとよい。
フェノール・クロロホルム法、遠心カラム法、磁気ビーズ法などを用いて調製された癌細胞のゲノムDNAを鋳型にしてPCRを実施する。PCRについては、ABI7300シークエンスディテクターにおける下記のPCR条件で、QIAGENのQuantiTect SYBR Green PCRキットを用いて実施することができる。すなわち、94℃15分(1サイクル)、94℃20秒、56℃20秒、70℃30秒(45サイクル)である。但し、これらの条件は、実験が再現できる限り、適宜変更できる。その変更した条件で発明が実施される場合も、本発明の範囲に含まれるものとする。ターゲットDNAの定量値は、任意の閾値にPCR産物が到達した時のPCRサイクル数(Ct値)を基に求めることができる。さらに、遺伝子コピー数は癌と正常細胞でのコピー数変化のほとんどないリファレンス配列を用いた定量値により補正することができる。ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数をPCR法で測定する場合には、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の全部又は一部を特異的に増幅することができるオリゴヌクレオチドプライマーを用いるとよい。このオリゴヌクレオチドプライマーは、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の全領域中、癌細胞に存在しうる他のゲノムDNAには見られない塩基配列を有する領域にハイブリダイズしうるものであるとよい。プライマーのサイズは、望ましくは17〜25塩基程度である。プライマーのTm値は上流プライマーと下流プライマーで揃え、55〜65℃くらいに設定すると良好な結果を得られる傾向がある。プライマー間の相補性が少ないペアを選択し、2つのプライマー同士がアニールしないようにする。特にプライマーダイマーの形成による増幅効率の低下を防ぐため、各プライマーの3'末端同士が3塩基以上連続して相補的にならないように設計する。また、プライマー内の二次構造形成を避けるために、4塩基以上の自己相補配列を含まないようにする。GC含量は40〜60%前後とし、部分的にGCあるいはAT-richにならないようにする。また、プライマーの3'末端と鋳型DNAが安定して結合するように、特にプライマーの3'側がAT-richまたはGC-richにならないように注意する。プライマーの3'末端がGC-richの場合は非特異的産物が生じやすいので、注意が必要である。Tm値については以下の注意が必要である。Tm値とは、二本鎖DNAの50%が一本鎖DNAに解離する温度(melting temperature)のことである。プライマーが鋳型DNAにアニーリングして、伸長反応が始まるためには、アニーリング温度をプライマーのTm値以下に設定する必要がある。しかし、温度を下げすぎると非特異的なアニーリングが起こり、特異的な増幅効率が低下する。いくつかのプライマー対の候補がある場合は、特異性を高くするために、通常、Tm値の高い対を選ぶ。また、プライマー対のそれぞれのTm値が異なる場合は、とりあえず低い方に合わせてアニーリング温度を設定する。上記の留意点に注意してプライマーをデザインした場合、経験的に55〜65℃のアニーリング温度で良好な結果が得られている。しかし、PCR産物がまったく得られない場合は温度をさらに下げ、また非特異的増幅産物が現れる場合は、さらに温度を上げてPCR反応を行うようにする。
Forward primer: 5’-CGGCCCTAGTCTGCCTGTT-3’(配列番号5)
Reverse primer: 5’-GAGTCTGCCAGTGACAAACCCT-3’(配列番号6)
参照ゲノム配列としてLINE-1(癌でも正常でもほとんどコピー数が変わらないと思われるゲノム上に多数存在する配列)を用いるとよい。
Forward primer 5’- AAAGCCGCTCAACTACATGG -3’(配列番号7)
Reverse primer 5’- TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG -3’ (配列番号8)
ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数をFISH法で測定する場合は、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴ又はポリヌクレオチドプローブを用いるとよい。このオリゴ又はポリヌクレオチドプロ−ブは、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の全領域中、癌細胞に存在しうる他のゲノムDNAには見られない塩基配列を有する領域にハイブリダイズしうるものであるとよい。
CGH法(comparative genomic hybridization)法は、蛍光色素を用い、どこの染色体で異常が生じているのかを特定する解析方法でFISH法の一種であるであるが、従来法では分解能が低く、得られたゲノム異常のデータから標的の遺伝子への同定には結びつきにくかった。今回コピー数異常を検出する対象とするゲノム領域は明確になっていることから、以下のCGH法でのコピー異常検出が可能である。すなわち、癌細胞と対照として用いる正常細胞からDNAを抽出し、癌細胞由来のDNAを緑色蛍光色素(FITC)で標識し、正常細胞由来のDNAを赤色蛍光色素(Texas red)で標識する。双方の標識DNAの等量からなる混合溶液を調製しハイブリダイゼーションを行なう。従来法ではハイブリダイズさせる標本として正常のヒトから採取した血液を培養後、細胞分裂を分裂中期で停止させ、細胞膜を露出した状態でスライドガラスに塗末した染色体標本スライドとして用いていたが、多数のクローン化したDNA断片をアレイ化したスライドグラスを用いてCGHを行なうことで(アレイCGH)、ラベルした癌および正常細胞由来DNA由来の蛍光シグナル強度比をもとにアレイ化されたDNA断片に相当する領域の癌DNAコピー数を定量化できる。アレイ化するDNAとして、100kbのヒトゲノム断片をクローン化したBACクローン、BACを鋳型にDOP-PCR法などでクローン化ゲノム断片を増やした産物を使うことができる。
アレイCGH法と同様に、市販のSNP検出用DNAマイクロアレイ(オリゴヌクレオチドアレイまたはcDNAマイクロアレイ)を用いてゲノム特定領域のコピー数の変化を検出することができる。DNAの調製方法、標識方法についてはそれぞれの市販アレイの標準プロトコールを用いることができる。
サザンハイブリダイゼーション法は核酸の相補性を利用して目的のDNAを検出する古典的な方法である。すなわち癌および正常細胞から調製したゲノムDNAを適当な制限酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動してDNAのサイズに応じて分画する。次にアルカリ変性により1本鎖DNAへの変性を行なった後、ニトロセルロースなどのフィルターに転写し固定化する。このフィルターに対し標的配列を含むDNA断片を放射性同位元素等で標識したプローブを反応させ、目的の遺伝子領域のコピー数の変化を検出することができる。
ヒト腫瘍株ヌードマウス皮下移植系での検証
NCI60プロファイリングデータを深くデータマイニングすることで、5-FUの感受性に影響する遺伝子のコピー数異常を導くことができた。この知見が一般化できるか否かを検証する独立したデータセットとして、in vivoヒト腫瘍株(Xenograft:ヌードマウス皮下移植にて継代されている各種臓器癌由来の31株:6胃癌(AZ-521, SC-2, ST-40, 4-1ST, SC-4, and OCUM-2MD3)、6大腸癌(KM12C, HCT-15, KM20C, COL-1, KM12C/FU, and CO-3)、6乳癌(MC-5, H-31, MC-2, MX-1, MDA-MB-435SHM, and MDA-MD-231)、7肺癌(GT3TKB, LC-11, Lu-99, LX-1, LC-6, Lu-134, and Lu-130)、6膵臓癌(PAN-3, PAN-4, PAN-12, H-48, MIAPaCa-2 and BxPC-3)を用いた。それぞれの入手先を以下に示す。KM12CおよびKM20Cは森川博士(国立癌研究所)より供与された。KM12C/FUはin vivoにてFU耐性を誘導した株である。MDA-MB-435SHMはATCCより購入したcell lineより in vivo にてSCIDマウスの乳腺に移植し、高肺転移株を作成したものである。LX-1,MX-1は井上博士(癌化学療法センター)より、H-31,H48は田口博士(大阪大学)よりそれぞれ供与された。AZ-521およびMDA-MB-231はHumanScienceResearchResourceBank、およびATCCより購入した。HCT-15およびBxPc-3は大日本製薬より購入した。その他の株は実験動物中央研究所より入手した。これらの腫瘍片および細胞懸濁液をヌードマウス(Male BALB/c-nu/nu nude mice 、5 週齢、個体重量 18 to 20 g)(日本クレアより購入)の皮下に移植し、腫瘍体積(0.5 x length x width2)が100-300mm3に到達した時点で、層化無作為割り付け法により腫瘍体積を指標に各試験群に5匹ずつ割り付けた(day 0)。試験開始時の各群の腫瘍体積には有意差が存在しないことを確認した。5-FU系抗癌剤であるUFT, TS-1, 5’-DFUR、Capecitabineをそれぞれの薬剤の至適投与量(MTD)にて2週間経口投与し、抗腫瘍効果を求めた。抗腫瘍効果はday15の時点で薬剤を投与しないコントロールマウスの皮下の腫瘍重量に対し、薬剤を投与したマウスの腫瘍重量がどの程度抑制されたのか、すなわち腫瘍増殖抑制率IR%として下式より求めた。全ての試験は動物実験に関する倫理ガイドラインに従い実施された。
RTV=(治療開始15日目の腫瘍重量)/(治療開始前の腫瘍重量)
IR%=(1−薬剤治療群のRTVの平均 / コントロール群のRTVの平均)x 100
DPYD遺伝子のコピー数を求めるために、以下の配列のプライマーを設計した。
Forward primer 5’-CGGCCCTAGTCTGCCTGTT-3’(配列番号5)
Reverse primer 5’- GAGTCTGCCAGTGACAAACCCT-3’ (配列番号6)
参照ゲノム配列としてLINE-1(癌でも正常でもほとんどコピー数が変わらないと思われるゲノム上に多数存在する配列)を用いた。
Forward primer 5’- AAAGCCGCTCAACTACATGG -3’(配列番号7)
Reverse primer 5’- TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG -3’ (配列番号8)
XenograftのgDNAはQIAAMP DNA mini kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) を用い使用説明書に従い調製した。
ターゲットDNAの定量値は、任意の閾値にPCR産物が到達した時のPCRサイクル数(Ct値)を基に検量線を作成して求めた回帰式より計算された。さらに、遺伝子コピー数は下式により算出された。
(ここで、Tは求めたい腫瘍のDNAでのDPYDまたはLINE-1の定量値、Cは対照として用いたヒト(男)正常組織由来のゲノムDNAでのDPYDまたはLINE-1の定量値である。)
Xenograftのtotal RNAは湿重量20-30mgの組織よりRNeasy (Qiagen Inc., Valencia, CA) を用い使用書に従って調製した。
DPYD
5’-AATGATTCGAAGAGCTTTTGAAGC-3’ (forward primer) (配列番号9)
5’-GTTCCCCGGATGATTCTGG-3’ (reverse primer) (配列番号10)
5’-TGCCCTCACCAAAACTTTCTCTCTTGATAAGGA-3’ (TaqMan probe) (配列番号11),
PCR 増幅サイズ: 108 bp
ACTB
5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’ (forward primer) (配列番号12)
5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’ (reverse primer) (配列番号13)
5’-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-3’ (TaqMan probe) (配列番号14),
PCR 増幅サイズ: 295 bp
GAPD
5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ (forward primer) (配列番号15)
5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ (reverse primer) (配列番号16)
5’-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3’ (TaqMan probe) (配列番号17),
PCR 増幅サイズ: 226 bp
PCR反応条件は50℃2分(1サイクル)、60℃30分(1サイクル)、95℃5分(1サイクル)および94℃20秒、60℃1分、45サイクルである。
ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ酵素活性は次の方法で求めた。すなわち、腫瘍組織を4倍量のhomogenization buffer [20 mM potassium phosphate (pH 8.0) containing 1 mM EDTA and 1 mM β-mercaptoethanol] を加え超音波破砕した。ホモジネートを105,000g、1時間、4℃で遠心し上清を採取した。酵素反応は以下の組成にて実施した。すなわち10 mM potassium phosphate (pH 8.0), 0.5 mM EDTA, 0.5 mMβ-mercaptoethanol, 2 mM dithiothreitol, 5 mM MgCl2, 20 μM [6-14C] 5-FU である。
使用薬剤:UFT, TS-1, Capecitabineは大鵬薬品工業(株)にて合成された。5’-DFURは日本ロッシュ(株)より購入した。[6-14C]-5-FU (1.85 GBq/mmol)はMoravek Biochemicals, Inc. (Brea, CA, USA) より購入した。
NCI60細胞での新しい知見、すなわちDPYD遺伝子のコピー数と5-FUへの感受性との相関が一般的に起こりうる現象なのか否かを検証するために、NCI60細胞株とは重複しない(1株を除く)ヒト癌由来ヌードマウス皮下移植株31株で同様の検討を行った。
31株でのDPYD遺伝子のコピー数を調べると2コピー付近の株が多かったものの0.78-4.4まで幅広く分布した(表1, 図1)。
ヒト腫瘍株ホルマリン固定、パラフィン切片での検証
本発明は、広く臨床的に応用可能でありかつ信頼性の高い抗癌剤感受性予測法を提供できると期待される。その大きな理由の一つに臨床において病理組織検査のため保存されるホルマリン固定パラフィン包埋サンプルを試験材料として利用可能であると考えられる点である。そこで、パラフィン包埋組織標本を材料としてDPD遺伝子コピー数を検出できるか否かをFISH法により検討した。実験材料としてin vivo ヒト腫瘍株(Lu-130、PAN-4)を用いた。パラフィンブロックより5μmに薄切されたスライド標本を、脱パラフィン操作を行い乾燥させた。さらにPBSに5分間浸漬した後、37℃のPepsin/0.1M HCL中でプロテアーゼ処理後、標本をPBSで十分に洗浄し、70%および100%のエタノールで脱水し乾燥させた。
DNAプローブの検証
ヘキストGバンディングを施した染色体標本にプローブをマッピングしたところ、DPD遺伝子の適切なゲノム領域である1p21もしくは1p22付近にマッピングされ、良好なシグナルが検出できた(図6)。
ヒト腫瘍株PAN-4およびLu130でのFISH像を図7及び図8に示す。いずれのサンプルにおいても明瞭なシグナルが得られ、かつバックグラウンドの低い良好な画像が得られた。対比染色された核の中で、画像上分離が良好な核を50個以上カウントし、DPD遺伝子の1細胞あたりのコピー数を求めた。 Lu130では2.3 signal / nucleus, PAN-4では1.4 signal / nucleusであった。Real-time PCR法で求めた値(3.1 および 1.5)(実施例1)と同様の傾向を示しFISH法での検出結果が妥当であることが示された。すなわちFISH法でのシグナル値よりLu130におけるDPD遺伝子数は1細胞あたり2コピー以上であり5-FU系抗癌剤の感受性が低いこと、同様にPAN-4では1細胞あたり2コピー以下であることから5-FU系抗癌剤の感受性が高いことが予想された。これらの感受性予測とin vivo抗腫瘍効果の結果(実施例1)はLu-130については4薬剤中4薬剤ともすべて一致し、PAN-4については4薬剤中3薬剤で一致するものであった。
配列番号1は、ヒト由来DPYDのDNA配列を示す。
<配列番号2>
配列番号2は、ヒト由来DPYDのアミノ酸配列を示す。
<配列番号3>
配列番号3は、マウス由来DPYDのDNA配列を示す。
<配列番号4>
配列番号4は、マウス由来DPYDのアミノ酸配列を示す。
<配列番号5>
配列番号5は、DPYD遺伝子のコピー数を求めるために用いたフォワードプライマーのDNA配列を示す。
<配列番号6>
配列番号6は、DPYD遺伝子のコピー数を求めるために用いたリバースプライマーのDNA配列を示す。
<配列番号7>
配列番号7は、参照ゲノム配列LINE-1のコピー数を求めるために用いたフォワードプライマーのDNA配列を示す。
<配列番号8>
配列番号8は、参照ゲノム配列LINE-1のコピー数を求めるために用いたリバースプライマーのDNA配列を示す。
<配列番号9>
配列番号9は、DPYDmRNAを定量するために用いたフォワードプライマーのDNA配列を示す。
<配列番号10>
配列番号10は、DPYDmRNAを定量するために用いたリバースプライマーのDNA配列を示す。
<配列番号11>
配列番号11は、DPYDmRNAを定量するために用いたTaqMan probeのDNA配列を示す。
<配列番号12>
配列番号12は、内部標準としてACTBを定量するために用いたフォワードプライマーのDNA配列を示す。
<配列番号13>
配列番号13は、内部標準としてACTBを定量するために用いたリバースプライマーのDNA配列を示す。
<配列番号14>
配列番号14は、内部標準としてACTBを定量するために用いたTaqMan probeのDNA配列を示す。
<配列番号15>
配列番号15は、内部標準としてGAPDを定量するために用いたフォワードプライマーのDNA配列を示す。
<配列番号16>
配列番号16は、内部標準としてGAPDを定量するために用いたリバースプライマーのDNA配列を示す。
<配列番号17>
配列番号17は、内部標準としてGAPDを定量するために用いたTaqMan probeのDNA配列を示す。
Claims (5)
- ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を指標として、5−フルオロウラシル系抗癌剤に対する癌細胞の感受性を予測する方法。
- 被験者由来の癌細胞におけるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を測定し、コピー数が2以下である場合には被験者の5−フルオロウラシル系抗癌剤に対する感受性が高いと予測し、コピー数が2よりも大きい場合には被験者の5−フルオロウラシル系抗癌剤に対する感受性が低いと予測する請求項1記載の方法。
- ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数をPCR法、FISH法、アレイCGH法、DNAマイクロアレイ法及びサザンハイブリダイゼーション法から成る群より選択される少なくとも1つの方法で測定する請求項1又は2に記載の方法。
- 5−フルオロウラシル系抗癌剤が、5−フルオロウラシル、テガフール、5’−デオキシ−5−フルオロウラシル及びカペシタビンから成る群より選択される少なくとも1つの成分を含む請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を測定するための試薬を含む、5−フルオロウラシル系抗癌剤に対する感受性を予測するためのキットであって、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を測定するための試薬が、配列番号5のDNA配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号6のDNA配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合せからなる一セットのプライマーである前記キット。
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