WO2007086351A1 - ５－フルオロウラシル系抗癌剤に対する感受性を予測する方法 - Google Patents

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WO2007086351A1
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fluorouracil
seq
dehydrogenase gene
dna
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PCT/JP2007/050933
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Takashi Kobunai
Akio Ooyama
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Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting susceptibility to 5-fluorouracil anticancer agents.
  • Non-Patent Documents 2 and 3, Patent Document 1 methods for predicting the sensitivity of 5-fluorouracil anticancer agents include measurement of enzyme activity of dihydropyrididine dehydrogenase prepared from cancer cell lines or cancer tissue strength, measurement of the amount of the enzyme by ELISA, or expression of mRNA. Techniques such as quantification of levels (Non-Patent Documents 2 and 3, Patent Document 1) have been tried. However, enzymes or mRNA are subject to degradation when preserving fresh surgical tissue, and the degree of degradation varies from facility to facility, making it difficult to use as a common index for sensitivity prediction. It was. Furthermore, the amount of tissue required for measuring enzyme activity was not feasible with the amount of sample obtained from biopsy materials. In addition, it is difficult to measure mRNA expression level using a paraffin-embedded sample as a material, which is widely used for histopathological diagnosis.
  • Non-thousand references 1 Integrative genomic analyzes identify MITF as a lineage survival onco gene amplified in malignant melanoma: Garraway- LA, et al. Nature (2005) vol.436, 7 July, ppl l7-121
  • Non-patent document 2 Dihydropyrimidine dehydrogenase activity in human peripheral blood mononuclear cells and liver: population characteristics, newly identified dencient pat ients, and clinical implication in 5—fluorouracil chemotherapy: Lu Z, Zhang R, Diasio RB. Cancer Res. 1993 Nov 15 ; 53 (22): 5433— 8
  • Non-Patent Document 3 A role for dihydropyrimidine dehydrogenase and thymidylate synthase in tumour sensitivity to fluorouracil: Beck A, Etienne MC, Cheradame S, Fischel JL, Formento P, Renee N, Milano G. Eur J Cancer. 1994; 30A (10) : 1517-22
  • Patent Document 1 Japanese Translation of Special Publication 2005-508603
  • An object of the present invention is to analyze factors that affect the sensitivity of anticancer agents and to demonstrate their effectiveness.
  • the present inventors comprehensively analyze (data mining) the data used in the above-mentioned paper and the enormous drug susceptibility data, gene expression data, and cell karyotype data accumulated so far in the NCI database. So far, it has been known that it affects the sensitivity of existing anticancer drugs (5-FU anticancer drugs in this example), and the DNA copy number change has been identified. In addition, we verified whether the findings obtained could be generalized with 31 human cancer-derived nude mice subcutaneously transplanted xenograft strains that do not overlap with NCI screening panel cells.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • the number of copies of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene in the cancer cells derived from the subject is measured, and if the copy number is 2 or less, the subject is predicted to be highly sensitive to the 5-fluorouracil anticancer drug, and the copy number is The method according to (1), wherein if the ratio is greater than 2, the subject is predicted to be less sensitive to the 5-fluorouracil anticancer agent.
  • the number of copies of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene is determined from the group consisting of the PCR method, FISH method, array CGH method, DNA microarray method and Southern hybridization method.
  • a kit for predicting susceptibility to a 5-fluorouracil anticancer agent comprising a reagent for measuring the copy number of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene.
  • the reagent for measuring the copy number of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene is specifically hybridized with an oligonucleotide primer or a dihydropyrimidine dehydrogenase gene that can specifically amplify all or part of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene.
  • the kit according to (5) which is an oligo or polynucleotide probe that can be used.
  • a set of primers that also combine the oligonucleotide consisting of the DNA sequence of SEQ ID NO: 5 and the oligonucleotide that also has the DNA sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the present invention it has been shown that changes in the copy number of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene affect the sensitivity to 5-fluorouracil anticancer agents.
  • the present invention can be used to predict the sensitivity of a subject to 5-fluorouracil anticancer agents.
  • This specification includes the contents described in the Japanese Patent Application, Japanese Patent Application No. 2006-16367, and the Z or drawings, which are the basis of the priority of the present application.
  • DPYD copy number distribution in Xenograft31 strain was displayed as a histogram.
  • the vertical axis is frequency and the horizontal axis is DPYD copy number.
  • FIG. 2 DPYD copy number of Xenograft31 strain and susceptibility data to FU anticancer drugs (UFT, TS-1, Capecitabine, 5, DFUR) were normalized, then clustered by Ward method and displayed as HeatMap diagram. It is displayed in grayscale, and the copy number and sensitivity are high! The color is darker!
  • Xenograft31 strain is a 5-FU anticancer agent Based on the ranking of sensitivity to (UFT, TS-l, Capecitabine, 5, -DFUR), the highly sensitive strain (S) is within the 25th percentile from the sensitive strain, and the low sensitivity strain (R) is within the 75th percentile. ), Other groups are grouped with the intermediate strain (N), and the results of a round-robin test with multiplicity taken into account by Tukey-Kramer HSD test are shown as P values.
  • FIG. 4 Plot of the relationship between DPYD copy number and DPYD mRNA expression level of Xenograft31 strain.
  • the horizontal axis shows DPYD copy number and the vertical axis shows mRNA expression level. Correlation coefficient and significance were obtained by Speaman rank correlation.
  • FIG. 5 Plot of the relationship between DPYD copy number and DPYD enzyme activity of Xenograft31 strain.
  • the horizontal axis shows DPYD copy number and the vertical axis shows DPYD enzyme activity level. Correlation coefficient and significance were obtained by Speaman rank correlation.
  • FIG. 7 FISH analysis on a paraffin sample (PAN-4).
  • the present invention uses the number of copies of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene (hereinafter sometimes referred to as DPYD) (the number of genes contained in one cell) as an index, and 5-fluorouracil anticancer agent (hereinafter referred to as 5-FU).
  • DPYD dihydropyrimidine dehydrogenase gene
  • 5-FU 5-fluorouracil anticancer agent
  • dihydropyrimidine dehydrogenase refers to an enzyme (EC 1.3.1.2) that catalyzes the detoxification of 5-fluorouracil having a molecular weight of about lllkDa. This enzyme is a rate-limiting enzyme in the pyrimidine degradation reaction pathway, and is known to have high activity mainly in the liver.
  • the gene sequence information is registered as ReSeq ID: NM-000110 (human), RelSeq ID: NM_170778 (mouse) at the NCBI website (http: www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • the amino acid sequences are registered as NP_00010 1 (human) and NP_740748 (mouse) in the same database.
  • the nucleic acid sequence and amino acid sequence of human-derived dihydropyrimidine dehydrogenase are described in Diasio, RB, et al. J. Clin. Invest. 81 (1), 47-51 (1988).
  • dihydropyrimidine dehydrogenase from mouse Nucleic acid and amino acid sequences are described in Porsin. B. et al., Eur. J. Cancer 39 (6), 822-828 (2003).
  • the copy number of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene in cancer cells derived from a subject is measured, and the copy number is 2 or less, the subject is predicted to be highly sensitive to 5 fluorouracil-based anticancer agents. However, if the copy number is greater than 2, it can be predicted that the subject is less sensitive to 5-fluorouracil anticancer agents.
  • the present invention when it is recognized that the cancer cells are highly sensitive to an antitumor agent, it is predicted that therapeutic effects such as an antitumor effect and a life prolonging effect when the anticancer agent is administered are high. If it is identified as “low sensitivity”, the therapeutic effect is expected to be low. Therefore, the present invention includes a method for predicting the therapeutic effect of a cancer with a 5-fluorouracil anticancer agent using the copy number of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene as an index.
  • the number of copies of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene in cancer cells derived from the subject is measured, and if the number of copies is 2 or less, the subject is predicted to have a high therapeutic effect with 5 fluorouracil anticancer drugs, and the copy number is A method of predicting that the therapeutic effect of a 5-fluorouracil anticancer agent in a subject is low when it is greater than 2 is also included.
  • the method of the present invention can be applied not only to humans but also to mammals such as pigs, monkeys, chimpanzees, inu, ushi, rabbits, rats, mice and the like.
  • biopsy samples In order to determine the number of copies of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene in cancer cells derived from subjects, biopsy samples, isolated organs, nophine-embedded tissue specimens, blood, spinal fluid, lymph, saliva, including cancer tissues and cancer cells Gastric juice, spleen fluid, duodenal juice, intestinal fluid, stool, or cultured cells or tissue that can also provide such force can be used.
  • cancer examples include gastric cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, spleen cancer, liver cancer, ovarian cancer, prostate cancer, head and neck cancer, malignant lymphoma, leukemia, brain tumor, uterine cancer, bladder cancer and the like.
  • the copy number of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene can be measured by PCR method, FISH method, array CGH method, DNA microarray method, Southern hybridization method and the like.
  • PCR can be performed using QIAGEN's QuantiTect SYBR Green PCR kit under the following PCR conditions in an ABI7300 sequence detector. That is, 94 minutes 15 minutes (1 cycle), 94 ° C 20 seconds, 56 ° C 20 seconds, 70 ° C 30 seconds (45 cycles). However, these conditions can be changed as appropriate as long as the experiment can be reproduced. Cases in which the invention is implemented under the changed conditions are also included in the scope of the present invention.
  • the quantitative value of the target DNA can be determined based on the number of PCR cycles (Ct value) when the PCR product reaches an arbitrary threshold.
  • the number of gene copies can be corrected by a quantitative value using a reference sequence with almost no copy number change between cancer and normal cells.
  • an oligonucleotide primer that can specifically amplify all or part of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene may be used.
  • the oligonucleotide primer should be capable of hybridizing to a region having a base sequence that is not found in other genomic DNAs that can be present in cancer cells in the entire region of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene.
  • the size of the primer is desirably about 17-25 bases.
  • the primer Tm values are aligned between the upstream primer and the downstream primer and set to 55-65 ° C.
  • the primer in order to prevent a decrease in amplification efficiency due to the formation of a primer dimer, the primer should be designed so that the 3 'ends of each primer do not continuously complement each other.
  • the GC content should be around 40-60% so that it will not partially become GC or AT-rich.
  • the Tm value is as follows: Caution must be taken.
  • the Tm value is the temperature at which 50% of double-stranded DNA is dissociated into single-stranded DNA.
  • the annealing temperature must be set below the Tm value of the primer. However, if the temperature is lowered too much, non-specific annealing occurs and the specific amplification efficiency decreases.
  • the annealing temperature is set to the lower one for the time being.
  • the temperature should be lowered further. If nonspecific amplification products appear, the temperature should be further raised to perform the PCR reaction.
  • Reverse primer 5,-GAGTCTGCCAGTGACAAACCCT- 3 '(SEQ ID NO: 6)
  • LINE-1 as the reference genome sequence (a sequence that exists in large numbers on the genome that appears to have almost the same copy number as cancer or normal).
  • an oligo or polynucleotide probe that can specifically hybridize with the dihydropyrimidine dehydrogenase gene may be used.
  • This oligo or polynucleotide probe should be capable of hybridizing to a region having a base sequence that is not found in other genomic DNAs present in cancer cells in the entire region of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene.
  • a DNA fragment having a target sequence, a PCR product, cDNA, a PAC clone, and a BAC clone can be used.
  • In situ hybridization is a method for confirming the presence and distribution of specific DNA or RNA (nucleic acid) in cells and tissues.
  • the principle is that the probe nucleic acid having a base sequence complementary to a specific nucleic acid in the cell uses the property of specifically forming a complex (hybridization). By labeling (RI) or antigenic substance (hapten), the hybridized part can be identified.
  • FISH Fluorescence in situ hybridization
  • the procedure of the FISH method is exemplified below.
  • the chromosomal specimen may be a slide glass smear of isolated cancer cultured cells, or it may be a slide specimen sliced from a tissue block containing cancer fixed in formalin and embedded in paraffin. Chromosome specimen slides should be hard-unged (fixed) and denatured by formamide treatment to prevent the slide glass from falling off during the hybridization process.
  • the probe DNA is labeled with piotin-dUTP (or dATP), the DNA is heat denatured, and then hybridization with single-stranded DNA is performed.
  • the formed double-stranded DNA of piotin-labeled DNA and genomic DNA is washed with a washing solution mainly composed of SSC buffer and treated with a high-affinity-FITC solution having affinity for piotin. Wash with SSC buffer, add anti-bleaching agent, cover with glass, observe with fluorescent microscope and take a picture.
  • the CGH method is an analysis method that uses fluorescent dyes to identify which chromosomes are abnormal, and is a type of FISH method. It was difficult to identify the target gene. Since the genomic region targeted for detection of copy number anomalies is clear, it is possible to detect copy anomalies using the following CGH method. Specifically, normal cell force DNA used as a cancer cell and a control is extracted, DNA derived from cancer cells is labeled with green fluorescent dye (FITC), and DNA derived from normal cells is labeled with red fluorescent dye (Texas red). . Prepare a mixed solution of equal amounts of both labeled DNAs and perform hybridization. In the conventional method, blood collected from normal humans as a specimen to be hybridized is cultured and then finely divided.
  • FITC green fluorescent dye
  • red fluorescent dye Texas red
  • the cell division was stopped at the mid-phase, and the cell membrane was exposed and used as a chromosome specimen slide smeared on a slide glass.
  • a CGH was prepared using a slide glass on which many cloned DNA fragments were arrayed.
  • the DNA to be arrayed can be a BAC clone obtained by cloning a human genome fragment of lOOkb, or a product obtained by increasing the number of cloned genomic fragments by using the DOP-PCR method with BAC as a saddle type.
  • the Southern and the hybridization method is a classic method for detecting the DNA of interest using the complementarity of nucleic acids. That is, genomic DNA prepared for cancer and normal cell strength is treated with an appropriate restriction enzyme and then subjected to agarose gel electrophoresis and fractionated according to the size of the DNA. Next, after denaturation to single-stranded DNA by alkali denaturation, transfer to a filter such as nitrocellulose and fix. This filter can be reacted with a probe in which a DNA fragment containing the target sequence is labeled with a radioisotope or the like to detect a change in the copy number of the target gene region.
  • the copy number of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene can be measured by any of the methods described above. However, if the copy number of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene is 2 or less, the subject's 5-fluorouracil anticancer drug It can be predicted that the sensitivity is high, and if the copy number is greater than 2, the subject's sensitivity to the 5-fluorouracil anticancer drug is low. If the cancer patient's sensitivity to 5-fluorouracil anticancer drugs can be predicted, it is possible to select appropriate drugs for cancer treatment or to avoid unnecessary medications. Changes to the plan are possible.
  • the method of the present invention predicts the sensitivity to 5-FU anticancer agents using DPYD as an index by using DNA that is not easily degraded as a material, and by using a universal copy and the number of genetic copies. Can be implemented using a standardized index between facilities, and can be easily implemented by using a wide range of samples including paraffin-embedded samples as materials!
  • 5 Fluorouracil anticancer agents include: 5 Fluorouracil, Tegafur, 5, 1 Deoxy-1 5-Fluorouracil, Force Pecitabine (hereinafter sometimes referred to as Capecitabine), UFT (Tegafur and uracil in a molar ratio of 1: 4 Compound)), TS-1 (mixture containing tegafur, gimeracil and oteracil potassium at a molar ratio of 1: 0.4: 1), carmofur, chamafur, sanfural and so on
  • An anticancer agent comprising at least one component selected from the group consisting of force 5-fluoruracil, tegafur, 5, -deoxy 5-fluorouracil and force pecitabine is preferred.
  • the present invention also provides a kit for predicting susceptibility to a 5-fluorouracil anticancer agent, which comprises a reagent for measuring the copy number of a dihydropyrimidine dehydrogenase gene.
  • an oligonucleotide primer capable of specifically amplifying all or part of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene, specifically a dihydropyrimidine dehydrogenase gene
  • examples thereof include oligo or polynucleotide probes that can be hybridized. These primers and probes are as described above.
  • the kit includes other reagents necessary for measuring the copy number of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene, such as Sarako, PCR, FISH, array CGH, DNA microarray, Southern hybridization, etc. Buffers, instructions etc. may be included.
  • the instruction manual should include criteria for predicting susceptibility to 5-fluorouracil anticancer agents.
  • the present invention provides a set of primers that can also combine an oligonucleotide having the DNA sequencing ability of SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide having the DNA sequencing ability of SEQ ID NO: 6.
  • a set of primers that can also combine an oligonucleotide having the DNA sequencing ability of SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide having the DNA sequencing ability of SEQ ID NO: 6.
  • in vivo human tumor strains (Xenograft: 31 strains derived from various organ cancers that have been passaged by nude mouse subcutaneous transplantation: 6 gastric cancer ( AZ-521, SC-2, ST-40, 4-1ST, SC-4, and OCUM-2MD3), 6 colorectal cancer (KM12C, HCT- 15, KM20C, COL- 1, K M12C / FU, and CO- 3), 6 breast cancer (MC-5, H-31, MC-2, MX-1, MDA-MB-435SHM, an d MDA-MD-231), 7 lung cancer (GT3TKB, LC-11, Lu-99, LX-1, LC-6, Lu-134, and Lu-130) and 6 spleen cancers (PAN-3, PAN-4, PAN-12, H-48, MIAPaCa-2 and
  • KM12C and KM20C were provided by Dr. Morikawa (National Cancer Institute)
  • KM12C / FU is a strain that induced FU resistance in vivo MDA-MB-435SHM is ATCC
  • a cell line purchased from a cell line in vivo was transplanted into the mammary gland of an SCID mouse, and a high lung metastasis strain was created.
  • LX- ⁇ , ⁇ - ⁇ was Dr. Inoue (Cancer Chemotherapy Center H-31 and H48 were provided by Dr.
  • AZ-521 and MDA-MB—231 were purchased from HumanScienceResearchResourceBank ⁇ and ATCC HCT—15 and BxPc-3 Purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Other strains were obtained from the Central Institute for Experimental Animals.These tumor pieces and cell suspensions were obtained from nude mice (Male BALB / c-nu / nu nude mice, 5 weeks old, individual). (Weight 18 to 20 g) (purchased from CLEA Japan) and transplanted subcutaneously, and when the tumor volume (0.5 X length x width 2 ) force l00-300mm 3 is reached, the tumor is stratified by randomized allocation.
  • mice Five mice were assigned to each test group using the volume as an index (day 0), and it was confirmed that there was no significant difference in the tumor volume of each group at the start of the study.
  • U a 5-FU anticancer drug FT, TS-1, 5, -DFUR, and Capecitabine were orally administered at the optimal dose (MTD) of each drug for 2 weeks to determine the antitumor effect.
  • the antitumor effect is lower as the tumor weight force S of the mice administered with the drug compared to the subcutaneous tumor weight of the control mice, that is, the degree of suppression of the tumor growth rate, ie IR%, without administration of the drug at dayl5. Obtained from the equation. All tests were conducted according to ethical guidelines for animal experiments.
  • RTV (tumor weight on day 15 of treatment start) I (tumor weight before start of treatment)
  • IR% (1—average of RTV in the drug treatment group) average of RTV in the I control group) X 100
  • primers having the following sequences were designed. Forward primer 5,-CGGCCCTAGTCTGCCTGTT-3, (SEQ ID NO: 5)
  • Reverse primer 5,-GAGTCTGCCAGTGACAAACCCT-3 '(SEQ ID NO: 6) LINE-1 (a large number of sequences present on the genome that seems to have almost the same copy number as cancer or normal) was used as the reference genome sequence.
  • PCR reaction was performed using QIAGEN's QuantiTect SYBR Green PCR kit using an ABI7300 sequence detector under the following PCR conditions. 94 ° C for 15 minutes (1 cycle), 94 ° C for 20 seconds, 56. C20 seconds, 70. C30 seconds (45 cycles).
  • the quantitative value of the target DNA was calculated from a regression equation obtained by creating a calibration curve based on the number of PCR cycles (Ct value) when the PCR product reached an arbitrary threshold. Furthermore, the number of gene copies was calculated by the following formula.
  • T is the quantitative value of DPYD or LINE-1 in the DNA of the tumor to be obtained
  • C is the quantitative value of DPYD or LINE-1 in the genomic DNA from normal human (male) tissue used as a control
  • Xenograft total RNA was prepared from yarn and weave with a wet weight of 20-30 mg using RNeasy (Qiagen Inc., Valencia, CA) according to the instructions.
  • DPYD mRNA was quantified by TaqMan real-time reverse transcribed PCR using TaqMan EZ RT-PCR kit and ABI Prism sequence detector.
  • a standard curve was prepared from a dilution series of MiaPaCa-2 total RNA. GAPD and ACTB were simultaneously quantified as internal standards, and DPYD mRNA level was corrected using the geometric mean of both.
  • PCR primers and TaqMan probe sequences are shown below.
  • PCR reaction conditions are 50 ° C for 2 minutes (1 cycle), 60 ° C for 30 minutes (1 cycle), 95 ° C for 5 minutes (1 cycle), and 94. C20 seconds, 60. C1 minute, 45 cycles.
  • Dihydropyrimidine dehydrogenase enzyme activity was determined by the following method. Specifically, 4 times the amount of homogenization buffer [20 mM potassium phosphate (pH 8.0) containing 1 mM EDTA and 1 mM ⁇ -mercaptoethanol] was added and tumor was disrupted. Homogene The supernatant was collected by centrifugation at 105,000 g for 1 hour at 4 ° C. The enzyme reaction was carried out with the following thread formation.
  • reaction amount 50 ⁇ 1 100 ⁇ M NADPH and 25 ⁇ 1 cell supernatant (reaction amount 50 ⁇ 1) were incubated at 37 ° C for 30 minutes. After completion of the reaction, 5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to thin layer chromatography (Silica gel 60; Merck,
  • Dihydropyrimidine dehydrogenase activity was determined by measuring the sum of both dihydrofluorouracil and 2-fluoro-j8-alanine isolated from [6- 14 C] 5-FU using a liquid scintillation counter.
  • the present invention is expected to provide an anticancer drug sensitivity prediction method that is widely applicable clinically and has high reliability.
  • One of the main reasons is that it is considered that formalin-fixed paraffin-embedded samples preserved for histopathological examination can be used as test materials in clinical practice. Therefore, we examined whether the DPD gene copy number could be detected using norafine-embedded tissue specimens by FISH method.
  • In vivo human tumor strains (Lu-130, PAN-4) were used as experimental materials. Slide mark sliced to 5 m from paraffin block The book was deparaffinized and dried. The sample was further immersed in PBS for 5 minutes and then treated with protease in Pepsin / in. ⁇ HCL at 37 ° C. The specimen was thoroughly washed with PBS, dehydrated with 70% and 100% ethanol, and dried.
  • a probe for detecting the DPD gene was prepared by the following method. Specifically, after a vector (pBeloBACl 1 (Funakoshi)) containing a BAC clone (clone ID: CTD-3236P20 (Open Biosystems)) having a DPD gene region was transferred to E. coli (DH10B (Funakoshi)) and expanded, BAC DNA was isolated. Cy3-dUTP was incorporated by Nick Translation method using BAC DNA to prepare 1 ⁇ 21 BAC DNA probe. Using a chromosomal specimen (Chromosome Science Lab), we confirmed that this probe was able to obtain a signal at the appropriate position of the upper short arm of chromosome 1.
  • a probe was applied to the sample that had been pretreated as described above, subjected to denaturation treatment on a hot plate at 90 ° C for 13 minutes, and then hybridized overnight at 37 ° C.
  • a solution containing 50% formamide, yeast tRNA, salmon sperm DNA and 2X SSC was used as a nofer.
  • the hybridized specimen was washed with 50% formaldehyde / 2xSSC and lxSSC, then counterstained with DAPI, mounted with an anti-fading agent, and the probe signal was detected.
  • the Leica CW4000 system (Leica) was used for signal detection and data analysis.
  • the probe When the probe was mapped to a chromosome sample subjected to Hoechst G banding, it was mapped to 1 ⁇ 21 or 1 ⁇ 22, which is an appropriate genomic region of the DPD gene, and a good signal was detected (Fig. 6).
  • Figures 7 and 8 show FISH images of human tumor lines PAN-4 and Lul30.
  • a clear signal was obtained and a good image with a low background was obtained.
  • 50 or more nuclei with good image separation were counted, and the copy number per cell of the DPD gene was determined.
  • 1 ⁇ 130 was 2.3 signal / nucleus
  • PAN-4 was 1.4 signal I nucleus.
  • Values obtained by ReaH: ime PCR method (3.1 and 1.5) ( The same tendency as in Example 1) was shown, indicating that the detection result by the FISH method was appropriate.
  • the number of DPD genes in Lul30 is 2 copies or more per cell, and the sensitivity of 5-FU anticancer drugs is low, as is the case with PAN-4. From the following, it was predicted that the sensitivity of 5-FU anticancer agents was high.
  • SEQ ID NO: 1 shows the DNA sequence of human-derived DPYD.
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of human-derived DPYD.
  • SEQ ID NO: 3 shows the DNA sequence of mouse-derived DPYD.
  • SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of mouse-derived DPYD.
  • SEQ ID NO: 5 shows the DNA sequence of the forward primer used to determine the copy number of the DPYD gene.
  • SEQ ID NO: 6 shows the DNA sequence of the reverse primer used to determine the copy number of the DPYD gene.
  • SEQ ID NO: 7 shows the DNA sequence of the forward primer used to determine the copy number of the reference genome sequence LINE-1.
  • SEQ ID NO: 8 shows the DNA sequence of the reverse primer used to determine the copy number of the reference genome sequence LINE-1.
  • SEQ ID NO: 9 shows the DNA sequence of the forward primer used to quantify DPYD mRNA.
  • SEQ ID NO: 10 shows the DNA sequence of the reverse primer used to quantify DPYD mRNA.
  • SEQ ID NO: 11 shows the DNA sequence of TaqMan probe used to quantify DPYD mRNA.
  • SEQ ID NO: 12 shows the DNA sequence of the forward primer used to quantify ACTB as an internal standard.
  • SEQ ID NO: 13 shows the DNA sequence of the reverse primer used to quantify ACTB as an internal standard.
  • SEQ ID NO: 14 shows the DNA sequence of TaqMan probe used to quantify ACTB as an internal standard.
  • SEQ ID NO: 15 shows the DNA sequence of the forward primer used to quantify GAPD as an internal standard.
  • SEQ ID NO: 16 is the reverse primer used to quantify GAPD as an internal standard The DNA sequence of is shown.
  • SEQ ID NO: 17 shows the DNA sequence of TaqMan probe used to quantify GAPD as an internal standard.

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Abstract

　抗癌剤の感受性に影響を与える因子を解析し、その有効性を実証した。 　ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を指標として、５－フルオロウラシル系抗癌剤に対する感受性を予測する方法。５－フルオロウラシル系抗癌剤に対する感受性を予測するためのキット及びプライマーも提供する。

Description

明 細 書
5 -フルォロウラシル系抗癌剤に対する感受性を予測する方法
技術分野
[0001] 本発明は、 5—フルォロウラシル系抗癌剤に対する感受性を予測する方法に関す る。
背景技術
[0002] DNAコピー数の変化は、遺伝子の発現の変化に影響する多くの原因の一つである 。ここ数年間で DNAコピー数の解析にアレイ CGH法などを用いて網羅的に検索する 方法が用いられ、有用であることが示されつつある。昨年の 7月に Natureに NCI60スク リー-ングパネル細胞の 100K SNPsアレイ（ァフィメトリックス社）での解析からメラノ一 マの薬剤抵抗性の原因遺伝子を導!ヽた画期的な論文が掲載された (非特許文献 1) 。その生データは NCIのデータベースに公開されており、第三者の再解析を促してい る。一方、既存抗癌剤について、 DNAコピー数の異常とその効果の間での関連は報 告されていない。
[0003] これまで、 5—フルォロウラシル系抗癌剤の感受性を予測する方法として、癌細胞 株あるいは癌組織力 調製したジヒドロピリジジンデヒドロゲナーゼの酵素活性の測 定および ELISAによる同酵素量の測定、あるいは mRNA発現レベルの定量（非特許 文献 2及び 3、特許文献 1)等の手法等が試みられてきた。しかしながら、酵素あるい は mRNAは、新鮮手術組織の保存の際に分解を受けやすぐその分解の度合いも各 施設間でまちまちであり、感受性予測の共通の指標として用いる際の困難さが生じて いた。さらに酵素活性を測定する際に必要な組織量も多ぐ生検材料等で得られる サンプル量では実施不能であった。また病理組織診断として広く用いられて 、るパラ フィン包埋サンプルを材料として、 mRNA発現レベルの測定を行なうことは手技的に 困難である。
[0004] 非特千文献 1： Integrative genomic analyses identify MITF as a lineage survival onco gene amplified in malignant melanoma: Garraway- LA, et al. Nature (2005) vol.436, 7 July, ppl l7-121 非特許文献 2： Dihydropyrimidine dehydrogenase activity in human peripheral blood mononuclear cells and liver: population characteristics, newly identified dencient pat ients, and clinical implication in 5— fluorouracil chemotherapy: Lu Z, Zhang R, Diasio RB. Cancer Res. 1993 Nov 15;53(22):5433— 8
非特許文献 3 : A role for dihydropyrimidine dehydrogenase and thymidylate synthase in tumour sensitivity to fluorouracil: Beck A, Etienne MC, Cheradame S, Fischel JL , Formento P, Renee N, Milano G. Eur J Cancer. 1994;30A(10): 1517-22
特許文献 1：特表 2005-508603号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、抗癌剤の感受性に影響を与える因子を解析し、その有効性を実証する ことを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは前述の論文で用いられたデータと、これまで NCIデータベースに蓄積 された膨大な薬剤感受性データ、遺伝子発現データ、細胞核型データを総合的に 解析 (データマイニング)することで既存抗癌剤 (今回の実施例では 5-FU系抗癌剤） の感受性に影響する今まで知られて 、な 、DNAコピー数変化を突き止めた。また得 られた知見が一般化できるか否かを NCIスクリーニングパネル細胞と重複しない 31の ヒト癌由来ヌードマウス皮下移植ゼノグラフト株にて検証した。
本発明の要旨は以下の通りである。
[0007] (1)ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を指標として、 5—フルォロウ ラシル系抗癌剤に対する感受性を予測する方法。
(2)被験者由来の癌細胞におけるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー 数を測定し、コピー数が 2以下である場合には被験者の 5—フルォロウラシル系抗癌 剤に対する感受性が高いと予測し、コピー数が 2よりも大きい場合には被験者の 5— フルォロウラシル系抗癌剤に対する感受性が低いと予測する（1)記載の方法。
(3)ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を PCR法又、 FISH法、ァレ ィ CGH法、 DNAマイクロアレイ法及びサザンハイブリダィゼーシヨン法から成る群より 選択される少なくとも 1つの方法で測定する（1)又は（2)に記載の方法。
[0008] (4) 5—フルォロウラシル系抗癌剤力 5—フルォロウラシル、テガフール、 5，ーデォ キシ一 5—フルォロウラシル及び力ぺシタビン力 成る群より選択される少なくとも 1つ の成分を含む（1)〜（3)の 、ずれかに記載の方法。
(5)ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を測定するための試薬を含 む、 5—フルォロウラシル系抗癌剤に対する感受性を予測するためのキット。
(6)ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を測定するための試薬が、 ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の全部又は一部を特異的に増幅することが できるオリゴヌクレオチドプライマー又はジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子と特 異的にハイブリダィズすることができるオリゴ若しくはポリヌクレオチドプローブである（ 5)記載のキット。
(7)配列番号 5の DNA配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号 6の DNA配列 力もなるオリゴヌクレオチドの組み合せ力もなる一セットのプライマー。
発明の効果
[0009] 本発明により、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数変化が 5—フル ォロウラシル系抗癌剤に対する感受性に影響を与えることがわ力つた。本発明は、被 験者の 5—フルォロウラシル系抗癌剤に対する感受性を予測することに利用できる。 本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願 2006- 16367の明 細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0010] [図 l]Xenograft31株での DPYDコピー数の分布をヒストグラムにて表示した。縦軸が頻 度、横軸が DPYDコピー数である。
[図 2]Xenograft31株の DPYDコピー数および FU系抗癌剤（UFT,TS- l,Capecitabine,5 ，-DFUR)への感受性データをノーマライズした後、 Ward法によりクラスタリングし、 He atMap図として表示した。グレースケールで表示しており、コピー数、および感受性が 高!、ほうが色が濃くなつて!/、る。
[図 3]縦軸に DPYDコピー数、横軸は以下に示す各薬剤の感受性によるグループ分 けを行なった後の箱ひげ図を示している。すなわち、 Xenograft31株を 5-FU系抗癌剤 (UFT,TS-l,Capecitabine,5，-DFUR)への感受性の順位を元に感受性の高い株から 25パーセンタイル以内を薬剤高感受性株 (S)、 75パーセンタイル以降を薬剤低感受 性株（R)、それ以外を中間株（N)とグループ分けし、 Tukey- Kramer HSD testにより 多重性を考慮した総当りの検定を行なった結果を P値として示して 、る。
[図 4]Xenograft31株の DPYDコピー数と DPYD mRNA発現レベルの関係をプロットした ものである。横軸に DPYDコピー数、縦軸に mRNA発現レベルを示す。相関係数、有 意性を Speaman順位相関により求めた。
[図 5]Xenograft31株の DPYDコピー数と DPYD酵素活性の関係をプロットしたものであ る。横軸に DPYDコピー数、縦軸に DPYD酵素活性レベルを示す。相関係数、有意性 を Speaman順位相関により求めた。
[図 6]染色体標本 (分裂期）を用いた DNAプローブの検証。矢印は DPD遺伝子（1ρ2 1)プローブを示す。
[図 7]パラフィンサンプルでの FISH解析（PAN- 4)。
[図 8]パラフィンサンプルでの FISH解析（Lu-130)。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下は DPYDと称すことがあ る）のコピー数（1細胞に含まれる遺伝子数)を指標として、 5—フルォロウラシル系抗 癌剤（以下は 5-FUと称すことがある）に対する感受性を予測する方法を提供する。
[0012] 本明細書において、「ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ」とは、分子量約 lllkDaの 5—フルォロウラシルの解毒的な分解を触媒する酵素 (EC 1.3.1.2)を指す。同酵素 はピリミジン分解反応経路における律速酵素となっており、主に肝臓での活性が高い ことが知られて 、る。またその遺伝子配列情報は NCBIweb site(http：〃 www.ncbi.nlm. nih.gov/)において、 ReSeq ID:NM— 000110 (ヒト） , RelSeq ID:NM_170778 (マウス)と して登録されている。また、アミノ酸配列については、同データベースにて NP_00010 1 (ヒト）および NP_740748 (マウス）として登録されている。ヒト由来ジヒドロピリミジンデ ヒドロゲナーゼの核酸配列及びアミノ酸配列は、 Diasio,R.B.,et al.J. Clin. Invest. 81 (1), 47-51 (1988)に記載されている。マウス由来ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの 核酸配列及びアミノ酸配列は、 Porsin.B.et al.,Eur. J. Cancer 39 (6), 822-828 (2003) に記載されている。
[0013] 本発明の一態様において、被験者由来の癌細胞におけるジヒドロピリミジンデヒドロ ゲナーゼ遺伝子のコピー数を測定し、コピー数が 2以下である場合には被験者の 5 フルォロウラシル系抗癌剤に対する感受性が高いと予測し、コピー数が 2よりも大 きい場合には被験者の 5—フルォロウラシル系抗癌剤に対する感受性が低いと予測 することができる。
[0014] なお、本発明において、抗腫瘍剤に対する癌細胞の「感受性が高い」と認定された 場合、抗癌剤を投与した際の抗腫瘍効果、延命効果等の治療効果が高いと予測さ れ、「感受性が低い」と認定された場合、治療効果が低いと予測される。従って、本発 明は、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を指標として、 5—フルォ ロウラシル系抗癌剤による癌の治療効果を予測する方法も包含される。より詳細には 、被験者由来の癌細胞におけるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数 を測定し、コピー数が 2以下である場合には被験者の 5 フルォロウラシル系抗癌剤 による治療効果が高いと予測し、コピー数が 2よりも大きい場合には被験者の 5 フ ルォロウラシル系抗癌剤による治療効果が低いと予測する方法も包含する。
[0015] 本発明の方法は、ヒトのみならず、ブタ、サル、チンパンジー、ィヌ、ゥシ、ゥサギ、ラ ット、マウスなどの哺乳動物を被験者とすることができる。
被験者由来の癌細胞におけるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数 を測定するためには、癌組織や癌細胞を含む、生検体試料、摘出臓器、ノ フィン 包埋組織標本、血液、髄液、リンパ液、唾液、胃液、脾液、十二指腸液、腸液、便、 あるいはそこ力も得られる培養細胞、培養組織などを用いるとよ 、。
癌の種類としては、胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、脾臓癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺 癌、頭頸部癌、悪性リンパ腫、白血病、脳腫瘍、子宮癌、膀胱癌などを挙げることが できる。
[0016] ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数は、 PCR法、 FISH法、アレイ CGH法、 DNAマイクロアレイ法、サザンハイブリダィゼーシヨン法などで測定すること ができる。 PCR法
ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を PCR法で測定する場合は、 以下のような手順で行うとよ!/、。
フエノール'クロ口ホルム法、遠心力ラム法、磁気ビーズ法などを用いて調製された 癌細胞のゲノム DNAを铸型にして PCRを実施する。 PCRについては、 ABI7300シーク エンスディテクターにおける下記の PCR条件で、 QIAGENの QuantiTect SYBR Green PCRキットを用いて実施することができる。すなわち、 94で15分（1サィクル）、 94°C2 0秒、 56°C20秒、 70°C30秒 (45サイクル）である。但し、これらの条件は、実験が再 現できる限り、適宜変更できる。その変更した条件で発明が実施される場合も、本発 明の範囲に含まれるものとする。ターゲット DNAの定量値は、任意の閾値に PCR産物 が到達した時の PCRサイクル数 (Ct値)を基に求めることができる。さらに、遺伝子コピ 一数は癌と正常細胞でのコピー数変化のほとんどないリファレンス配列を用いた定量 値により補正することができる。ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数 を PCR法で測定する場合には、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の全部又 は一部を特異的に増幅することができるオリゴヌクレオチドプライマーを用いるとよい 。このオリゴヌクレオチドプライマーは、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の全 領域中、癌細胞に存在しうる他のゲノム DNAには見られな 、塩基配列を有する領域 にハイブリダィズしうるものであるとよい。プライマーのサイズは、望ましくは 17〜25塩 基程度である。プライマーの Tm値は上流プライマーと下流プライマーで揃え、 55〜6 5°Cくら!、に設定すると良好な結果を得られる傾向がある。プライマー間の相補性が 少ないペアを選択し、 2つのプライマー同士がァニールしないようにする。特にプライ マーダイマーの形成による増幅効率の低下を防ぐため、各プライマーの 3'末端同士 力^塩基以上連続して相補的にならないように設計する。また、プライマー内の二次 構造形成を避けるために、 4塩基以上の自己相補配列を含まないようにする。 GC含 量は 40〜60%前後とし、部分的に GCあるいは AT-richにならないようにする。また、プ ライマーの 3'末端と铸型 DNAが安定して結合するように、特にプライマーの 3'側が AT -richまたは GC-richにならな!、ように注意する。プライマーの 3'末端が GC-richの場 合は非特異的産物が生じやすいので、注意が必要である。 Tm値については以下の 注意が必要である。 Tm値とは、二本鎖 DNAの 50%がー本鎖 DNAに解離する温度（me lting temperature)のことである。プライマーが铸型 DNAにアニーリングして、伸長反 応が始まるためには、アニーリング温度をプライマーの Tm値以下に設定する必要が ある。しかし、温度を下げすぎると非特異的なアニーリングが起こり、特異的な増幅効 率が低下する。いくつかのプライマー対の候補がある場合は、特異性を高くするため に、通常、 Tm値の高い対を選ぶ。また、プライマー対のそれぞれの Tm値が異なる場 合は、とりあえず低い方に合わせてアニーリング温度を設定する。上記の留意点に注 意してプライマーをデザインした場合、経験的に 55〜65°Cのアニーリング温度で良好 な結果が得られている。しかし、 PCR産物がまったく得られない場合は温度をさらに 下げ、また非特異的増幅産物が現れる場合は、さらに温度を上げて PCR反応を行う ようにする。
[0018] PCR法に用いるプライマーの塩基配列の一例を以下に記載する。
Forward primer: 5，- CGGCCCTAGTCTGCCTGTT- 3，（配列番号 5)
Reverse primer: 5， - GAGTCTGCCAGTGACAAACCCT- 3 ' (配列番号 6)
参照ゲノム配列として LINE-1 (癌でも正常でもほとんどコピー数が変わらな 、と思わ れるゲノム上に多数存在する配列）を用いるとよ 、。
Forward primer 5 ' - AAAGCCGCTCAACTACATGG -3，（配列番号 7) Reverse primer 5， - TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG - 3 ' (配列番号 8) [0019] FISH法
ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を FISH法で測定する場合は、 ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子と特異的にハイブリダィズすることができる オリゴ又はポリヌクレオチドプローブを用いるとよい。このオリゴ又はポリヌクレオチドプ ローブは、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の全領域中、癌細胞に存在しう る他のゲノム DNAには見られない塩基配列を有する領域にハイブリダィズしうるもの であるとよい。
[0020] FISHに用いるプローブとして、 目的の配列を有する DNA断片、 PCR産物、 cDNA、 P ACクローン、 BACクローンを用いることができる。 In situハイブリダィゼーシヨン法は、 細胞や組織内の特定の DNAあるいは RNA (核酸)の有無および分布を確認する方法 として発展してきた。その原理としては、細胞内の特定核酸に相補的な塩基配列をも つプローブ核酸が特異的に複合体を形成 (ハイブリダィゼーシヨン)する性質を利用 したもので、プローブに予め放射線同位元素 (RI)や抗原物質 (ハプテン)などを標識 しておくとハイブリダ一ゼーシヨンした個所が識別可能となることによる。従来プローブ の標識には RIが用いられてきた力 近年、非放射線物質のピオチンやジゴキシゲ- ンなどのハプテンを利用した蛍光標識方法や検出方法が開発され、 FISHと呼ばれる 蛍光 in situ ハイブリダィゼーシヨン法 (FISH)が発展してきた (参考文献：実験医学 別冊、蛋白質 ·核酸分子の in situ同定法、遠山編)。
[0021] FISH法の手順を以下に例示する。染色体標本は、単離癌培養細胞のスライドガラ ス塗末標本でも良 、し、ホルマリン固定しパラフィン包埋した癌を含む組織ブロックか ら薄切されたスライド標本でも良い。染色体標本スライドはハードユング（固着)させハ イブリダィゼーシヨン過程でのスライドガラス力もの脱落を防いで力 ホルムアミド処理 により変性させておく。ピオチンを標識とする FISH法にぉ 、てはピオチン- dUTP (また は dATP)を用いてプローブ DNAを標識し、 DNAを熱変性させた後、 1本鎖 DNAとハイ ブリダ一ゼーシヨンを行なう。形成されたピオチン標識 DNAとゲノム DNAの 2本鎖 DNA を SSCバッファーを主とする洗浄液を用いて洗浄し、ピオチンと親和性の高 ヽァビジ ン- FITC溶液で処理する。さらに SSCバッファー系列により洗浄し、抗退色剤を滴下し カバーグラスをかけ、蛍光顕微鏡により観察し写真撮影する。
[0022] アレイ CGH法
CGH法（comparative genomic hybridization)法は、蛍光色素を用い、どこの染色体 で異常が生じて 、るのかを特定する解析方法で FISH法の一種であるである力 従来 法では分解能が低ぐ得られたゲノム異常のデータ力 標的の遺伝子への同定には 結びつきにくかった。今回コピー数異常を検出する対象とするゲノム領域は明確にな つていることから、以下の CGH法でのコピー異常検出が可能である。すなわち、癌細 胞と対照として用いる正常細胞力 DNAを抽出し、癌細胞由来の DNAを緑色蛍光色 素（FITC)で標識し、正常細胞由来の DNAを赤色蛍光色素 (Texas red)で標識する。 双方の標識 DNAの等量カゝらなる混合溶液を調製しハイブリダィゼーシヨンを行なう。 従来法ではハイブリダィズさせる標本として正常のヒトから採取した血液を培養後、細 胞分裂を分裂中期で停止させ、細胞膜を露出した状態でスライドガラスに塗末した染 色体標本スライドとして用いて 、たが、多数のクローンィ匕した DNA断片をアレイ化した スライドグラスを用いて CGHを行なうことで (アレイ CGH)、ラベルした癌および正常細 胞由来 DNA由来の蛍光シグナル強度比をもとにアレイ化された DNA断片に相当する 領域の癌 DNAコピー数を定量化できる。アレイ化する DNAとして、 lOOkbのヒトゲノム 断片をクローン化した BACクローン、 BACを铸型に DOP-PCR法などでクローン化ゲノ ム断片を増やした産物を使うことができる。
[0023] マイクロ レイ法
アレイ CGH法と同様に、市販の SNP検出用 DNAマイクロアレイ（オリゴヌクレオチドァ レイまたは cDNAマイクロアレイ）を用いてゲノム特定領域のコピー数の変化を検出す ることができる。 DNAの調製方法、標識方法についてはそれぞれの巿販アレイの標 準プロトコールを用いることができる。
[0024] サザンハイブリダィゼーシヨン法
サザンノ、イブリダィゼーシヨン法は核酸の相補性を利用して目的の DNAを検出する 古典的な方法である。すなわち癌および正常細胞力 調製したゲノム DNAを適当な 制限酵素で処理した後、ァガロースゲル電気泳動して DNAのサイズに応じて分画す る。次にアルカリ変性により 1本鎖 DNAへの変性を行なった後、ニトロセルロースなど のフィルターに転写し固定ィ匕する。このフィルターに対し標的配列を含む DNA断片を 放射性同位元素等で標識したプローブを反応させ、 目的の遺伝子領域のコピー数 の変化を検出することができる。
[0025] ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数は、上記のいずれの方法で測 定してもょ 、が、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数が 2以下である 場合には被験者の 5—フルォロウラシル系抗癌剤に対する感受性が高いと予測し、 コピー数が 2より大き ヽ場合には被験者の 5 フルォロウラシル系抗癌剤に対する感 受性が低いと予測することができる。癌患者の 5—フルォロウラシル系抗癌剤に対す る感受性を予測することができれば、癌治療における適切な薬剤の選択な 、しは無 用な投薬の回避ができ、適切な投与計画の立案や適切な投与計画への変更が可能 となる。 [0026] 本発明の方法は、分解を受けにくい DNAを材料として用いること、また、遺伝子コピ 一数と 、う普遍的な指標を用いることで、 DPYDを指標にした 5-FU系抗癌剤感受性 予測を各施設間で統一された指標を用いて実施できること、さらに、パラフィン包埋 サンプルを含む幅広 、サンプルを材料として用いることにより容易に実施できると!、う 禾 IJ点がある。
[0027] 5 フルォロウラシル系抗癌剤としては、 5 フルォロウラシル、テガフール、 5，一 デォキシ一 5—フルォロウラシル、力ぺシタビン (以下は Capecitabineと称すことがある ), UFT (テガフールとゥラシルをモル比 1 :4で含む配合剤）、 TS-1 (テガフール、ギメ ラシル及びォテラシルカリウムをモル比 1 : 0. 4 : 1で含む配合剤）、カルモフール、ャ マフール、サンフラールの単剤及び配合剤を挙げることができる力 5—フルォロゥラ シル、テガフール、 5，ーデォキシ 5—フルォロウラシル及び力ぺシタビンから成る 群より選択される少なくとも 1つの成分を含む抗癌剤が好ましい。
[0028] また、本発明は、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を測定するた めの試薬を含む、 5—フルォロウラシル系抗癌剤に対する感受性を予測するための キットを提供する。
[0029] ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を測定するための試薬としては 、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の全部又は一部を特異的に増幅すること ができるオリゴヌクレオチドプライマー、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子と特 異的にハイブリダィズすることができるオリゴ又はポリヌクレオチドプローブなどを挙げ ることができる。これらのプライマー及びプローブについては上述した通りである。キッ トには、さら〖こ、 PCR法、 FISH法、アレイ CGH法、 DNAマイクロアレイ法、サザンノヽ イブリダィゼーシヨン法などによるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー 数の測定に必要なその他の試薬一式、緩衝液、取扱説明書などが含まれてもよい。 取扱説明書には、キットの使用方法の他、 5—フルォロウラシル系抗癌剤に対する感 受性を予測するための判定基準なども記載しておくとよい。
[0030] さらに、本発明は、配列番号 5の DNA配列力 なるオリゴヌクレオチド及び配列番 号 6の DNA配列力もなるオリゴヌクレオチドの組み合せ力もなる一セットのプライマー を提供する。本発明のプライマーを用いることにより、被験者由来の癌細胞における ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を PCR法により測定することが でき、この測定結果に基づいて、被験者の 5—フルォロウラシル系抗癌剤に対する感 受性を予測することができる。
実施例
[0031] 以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。
[0032] 〔実施例 1〕
ヒト脯瘍株ヌードマウス皮下移植系での檢
NCI60プロフアイリングデータを深くデータマイニングすることで、 5-FUの感受性に 影響する遺伝子のコピー数異常を導くことができた。この知見が一般ィ匕できる力否か を検証する独立したデータセットとして、 in vivoヒト腫瘍株（Xenograft:ヌードマウス皮 下移植にて継代されている各種臓器癌由来の 31株： 6胃癌 (AZ- 521, SC-2, ST-40, 4- 1ST, SC-4, and OCUM- 2MD3)、 6大腸癌 (KM12C, HCT- 15, KM20C, COL- 1, K M12C/FU, and CO- 3)、 6乳癌 (MC- 5, H- 31, MC- 2, MX- 1, MDA- MB- 435SHM, an d MDA- MD- 231)、 7肺癌 (GT3TKB, LC- 11, Lu- 99, LX- 1, LC- 6, Lu- 134, and Lu- 130)、 6脾臓癌 (PAN- 3, PAN- 4, PAN- 12, H- 48, MIAPaCa- 2 and BxPC- 3)を用いた 。それぞれの入手先を以下に示す。 KM12Cおよび KM20Cは森川博士（国立癌研究 所）より供与された。 KM12C/FUは in vivoにて FU耐性を誘導した株である。 MDA-MB - 435SHMは ATCCより購入した cell lineより in vivoにて SCIDマウスの乳腺に移植し、 高肺転移株を作成したものである。 LX-Ι,ΜΧ-Ιは井上博士 (癌化学療法センター）よ り、 H-31,H48は田口博士（大阪大学)よりそれぞれ供与された。 AZ-521および MDA- MB— 231は HumanScienceResearchResourceBankゝおよび ATCCより購入した。 HCT— 1 5および BxPc-3は大日本製薬より購入した。その他の株は実験動物中央研究所より 入手した。これらの腫瘍片および細胞懸濁液をヌードマウス（Male BALB/c-nu/nu n ude mice、 5週齢、個体重量 18 to 20 g) (日本クレアより購入）の皮下に移植し、腫 瘍体積 (0.5 X length x width2)力 l00-300mm3に到達した時点で、層化無作為割り付 け法により腫瘍体積を指標に各試験群に 5匹ずつ割り付けた (day 0)。試験開始時 の各群の腫瘍体積には有意差が存在しな ヽことを確認した。 5-FU系抗癌剤である U FT, TS-1, 5，-DFUR、 Capecitabineをそれぞれの薬剤の至適投与量 (MTD)にて 2 週間経口投与し、抗腫瘍効果を求めた。抗腫瘍効果は dayl5の時点で薬剤を投与し な 、コントロールマウスの皮下の腫瘍重量に対し、薬剤を投与したマウスの腫瘍重量 力 Sどの程度抑制されたの力 すなわち腫瘍増殖抑制率 IR%として下式より求めた。全 ての試験は動物実験に関する倫理ガイドラインに従い実施された。
RTV= (治療開始 15日目の腫瘍重量) I (治療開始前の腫瘍重量）
IR%= (1—薬剤治療群の RTVの平均 Iコントロール群の RTVの平均） X 100 DPYD遺伝子のコピー数を求めるために、以下の配列のプライマーを設計した。 Forward primer 5，- CGGCCCTAGTCTGCCTGTT- 3，（配列番号 5)
Reverse primer 5， - GAGTCTGCCAGTGACAAACCCT- 3 ' (配列番号 6) 参照ゲノム配列として LINE-1 (癌でも正常でもほとんどコピー数が変わらな 、と思わ れるゲノム上に多数存在する配列）を用いた。
Forward primer 5 ' - AAAGCCGCTCAACTACATGG -3，（配列番号 7) Reverse primer 5， - TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG - 3 ' (配列番号 8) Xenograftの gDNAは QIAAMP DNA mini kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) を用い 使用説明書に従い調製した。
[0033] PCR反応は QIAGENの QuantiTect SYBR Green PCRキットを用い、 ABI7300シーク エンスディテクタ一により下記の PCR条件で行った。 94°C15分（1サイクル）、 94°C2 0秒、 56。C20秒、 70。C30秒（45サイクル）。
ターゲット DNAの定量値は、任意の閾値に PCR産物が到達した時の PCRサイクル 数 (Ct値)を基に検量線を作成して求めた回帰式より計算された。さらに、遺伝子コピ 一数は下式により算出された。
[0034] (T (DPYD) / T (LINE— 1)) / (C(DPYD) / C(LINE— 1)) x 2
(ここで、 Tは求めたい腫瘍の DNAでの DPYDまたは LINE-1の定量値、 Cは対照として 用いたヒト（男）正常組織由来のゲノム DNAでの DPYDまたは LINE-1の定量値である o )
Xenograftの total RNAは湿重量 20- 30mgの糸且織より RNeasy (Qiagen Inc., Valencia, CA) を用い使用書に従って調製した。 [0035] DPYDmRNAの定量は TaqMan EZ RT- PCR kitおよび ABI Prismシークェンスディ テクターを用いた TaqMan real-time reverse transcribed PCRにて求めた。標準曲線 は MiaPaCa-2の total RNAの希釈系列により作成した。内部標準として GAPD, ACTB を同時に定量し、両者の幾何平均を用い DPYDmRNA量を補正した。
[0036] PCRプライマー、 TaqManプローブ配列を下記に示す。
DPYD
5 ' -AATGATTCGAAGAGCTTTTGAAGC-3 ' (forward primer) (配列番号 9)
5 ' -GTTCCCCGGATGATTCTGG-3 ' (reverse primer) (配列番号 10)
5 ' -TGCCCTCACCAAAACTTTCTCTCTTGATAAGGA-3 ' (TaqMan probe) (配 列番号 11) ,
PCR増幅サイズ： 108 bp
ACTB
5，- TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA- 3， (forward primer) (配列番号 12) 5 ' -CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3 ' (reverse primer) (配列番号 13) 5 ' -ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-3 ' (TaqMan probe) (配列番号 14)
PCR増幅サイズ： 295 bp
GAPD
5 ' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ' (forward primer) (配列番号 15) 5 ' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 ' (reverse primer) (配列番号 16) 5 ' -CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3 ' (TaqMan probe) (配列番号 17) , PCR増幅サイズ： 226 bp
PCR反応条件は 50°C2分（1サイクル）、 60°C30分（1サイクル）、 95°C5分（1サイク ル）および 94。C20秒、 60。C1分、 45サイクルである。
[0037] ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ酵素活性
ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ酵素活性は次の方法で求めた。すなわち、腫瘍 糸且織 4倍量の homogenization buffer [20 mM potassium phosphate (pH 8.0) contain ing 1 mM EDTA and 1 mM β -mercaptoethanol]をカ卩え超音波破碎した。ホモジネ ートを 105,000g、 1時間、 4°Cで遠心し上清を採取した。酵素反応は以下の糸且成にて 実施した。すなわち 10 mM potassium phosphate (pH 8.0), 0.5 mM EDTA, 0.5 mM β -mercaptoethanol, 2 mM dithiothreitol, 5 mM MgCl , 20 ^ M [6— 14C] 5— FUである。
2
[0038] 100 μ M NADPHと 25 μ 1の細胞上清（反応量 50 μ 1)を 37°C, 30分インキュベート した。反応終了後、 5 μ 1の反応液を薄層クロマトグラフィー（Silica gel 60 ； Merck,
F254
Germany)にて ethanolと 1 M ammonium acetateの混合 ¾¾(5: 1 , v/v)にて展開した。 ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ活性は [6- 14C] 5- FUより分離した dihydrofluoroura cilおよび 2-fluoro- j8 - alanine両者の和を、液体シンチレーシヨンカウンターを用い 測定することにより求めた。
使用薬剤： UFT, TS-1 , Capedtabineは大鵬薬品工業 (株）にて合成された。 5，- DF URは日本ロッシュ（株）より購入した。 [6- 14C]- 5- FU (1.85 GBq/mmol)は Moravek Bio chemicals, Inc. (Brea, CA, USA)より購入した。
[0039] 睡菓
NCI60細胞での新し!/、知見、すなわち DPYD遺伝子のコピー数と 5-FUへの感受 性との相関が一般的に起こりうる現象なの力否かを検証するために、 NCI60細胞株 とは重複しない（1株を除く）ヒト癌由来ヌードマウス皮下移植株 31株で同様の検討を 行った。
31株での DPYD遺伝子のコピー数を調べると 2コピー付近の株が多かったものの 0. 78-4.4まで幅広く分布した (表 1 ,図 1)。
[0040] 31株での DPYD遺伝子のコピー数と、抗癌剤の効果（UFT,TS- 1 ,5，- DFUR, Capeci tabine)との関連を調べた。図 2にコピー数と in vivo効力データの HeatMap図を示す o Unsupervised— 2— way clusteringの結果、コピー数と in vivo効力とは相反するノター ンを示していた。そこで 31株をそれぞれの薬剤に対する感受性の高さにより順位付け し、上位 25パーセンタイルの株を高感受性株群、 75パーセンタイル以降を低感受性 株群、その他を中間群としてグループ分けした後、それぞれの群での DPYD遺伝子 のコピー数に対し、 Tukey- Kramar HST testを行なった（図 3)。その結果、 UFT, 5， - DFUR、 Capedtabineについては薬剤の高感受性群、低感受性群との間で有意なコ ピー数の変化を認めた。すなわち、低感受性群での DPYD遺伝子コピー数は有意に 高感受性群のものよりも高力つた (Pく 0.05)。 TS-1については有意差が無力つた力 有 意傾向が認められた。
NCI60スクリーニング細胞株では、 DPYD遺伝子のコピー数と DPYD mRNAの発現と の間に有意な正の相関が認められた。同様に 31株の Xenograftにつ ヽても当てはまる 知見であるか否かを確認するために、 Xenograftの DPYD mRNA発現と DPYD遺伝子 コピー数との相関を調べたところ、両者に有意な相関 (Spearman Rho=0.36, p=0.046) を認めた（図 4)。 DPYD酵素活性との相関をみると正の相関傾向（Pく 0.07)が認めら れた（図 5)。
[表 1]
Xeno Name Copy Number SE Xeno Name Copy Number SE
Co-3 2.071 0.571 MDA435 4.449 2.690
HCT-15 2.410 0.428 BxPC-3 2.571 0.379
KM12C 1.226 0.132 Lu-130 3.060 0.670
K 20C 2.080 0.313 KM12FU 1.086 0.1 71
LC-1 1 1.326 0.178 LC-6 2.101 0.402
Lu-99 0.772 0.263 MIAPaCa 2.944 0.402
LX-1 1.846 0.354 MDA-231 1.919 0.316
C-2 1.668 0.219 Lu-134 2.480 0.623
MX— 1 2.519 0.587 GT3TKB 2.243 0.260
PAN - 12 1.895 0.238 OCU 2.745 0.308
PAN - 3 2.009 0.372 C-5 2.268 0.403
SC-2 1.935 0.298 H-31 1.957 0.187
ST - 40 1.159 0.163 H-48 1.960 0.198
4- 1 ST 1.526 0.425 PAN - 4 1.448 0.277
SC-4 1.934 0.492 AZ-521 2.102 0.365
COL— 1 2.132 0.359
Reference DNA: promega human (male) genomic DNA = 2 copies
3回の独立した実験の平均および標準誤差 [実施例 2]
ヒト腈瘍株ホルマリン岡定、パラフィン切片での枪 tH
本発明は、広く臨床的に応用可能でありかつ信頼性の高い抗癌剤感受性予測法 を提供できると期待される。その大きな理由の一つに臨床にぉ 、て病理組織検査の ため保存されるホルマリン固定パラフィン包埋サンプルを試験材料として利用可能で あると考えられる点である。そこで、ノラフィン包埋組織標本を材料として DPD遺伝子 コピー数を検出できるか否かを FISH法により検討した。実験材料として in vivoヒト腫 瘍株（Lu-130、 PAN-4)を用いた。パラフィンブロックより 5 mに薄切されたスライド標 本を、脱パラフィン操作を行い乾燥させた。さらに PBSに 5分間浸漬した後、 37°Cの P epsin/Ο.ΙΜ HCL中でプロテアーゼ処理後、標本を PBSで十分に洗浄し、 70%および 1 00%のエタノールで脱水し乾燥させた。
[0043] DPD遺伝子を検出するプローブは以下の方法により調製した。すなわち、 DPD遺伝 子領域を有する BACクローン（クローン ID: CTD-3236P20 (Open Biosystems社） )を 含むベクター（pBeloBACl 1 (フナコシ））を大腸菌（DH10B (フナコシ））にトランスフエ タトし拡大培養したのち、 BAC DNAを単離した。 BAC DNAを用い Nick Translation法 により Cy3-dUTPを取り込ませ 1ρ21 BAC DNAプローブを作製した。染色体標本（ク ロモソームサイエンスラボ社)を用いて本プローブが第一染色体上短腕の適正な位 置にシグナルが得られることを確認した。
[0044] 前記のような前処理を行った標本にプローブをアプライし、 90°Cのホットプレート上 で 13分間変性処理を行い、さらに 37°Cで一晩ハイブリダィズした。ノ ッファーとして、 50% formamide、 yeast tRNA、 salmon sperm DNAおよび 2X SSCを含む溶液を用 いた。ハイブリダィズした標本を 50%ホルムアルデヒド/ 2xSSCおよび lxSSCで洗浄し た後、 DAPIで対比染色を行い退色防止剤でマウントし、プローブシグナルの検出を 行った。シグナルの検出およびデータの解析は Leica CW4000システム（ライカ社）を 用いた。
[0045] 睡菓
DNAプローブの検証
へキスト Gバンデイングを施した染色体標本にプローブをマッピングしたところ、 DPD 遺伝子の適切なゲノム領域である 1ρ21もしくは 1ρ22付近にマッピングされ、良好なシ グナルが検出できた（図 6)。
[0046] パラフィン包埋切片での FISH解析
ヒト腫瘍株 PAN-4および Lul30での FISH像を図 7及び図 8に示す。いずれのサンプ ルにお 、ても明瞭なシグナルが得られ、かつバックグラウンドの低い良好な画像が得 られた。対比染色された核の中で、画像上分離が良好な核を 50個以上カウントし、 D PD遺伝子の 1細胞あたりのコピー数を求めた。 1^130では2.3 signal / nucleus, PAN -4では 1.4 signal I nucleusであった。 ReaH:ime PCR法で求めた値（3.1および 1.5) ( 実施例 1)と同様の傾向を示し FISH法での検出結果が妥当であることが示された。す なわち FISH法でのシグナル値より Lul30における DPD遺伝子数は 1細胞あたり 2コピ 一以上であり 5-FU系抗癌剤の感受性が低!、こと、同様に PAN-4では 1細胞あたり 2コ ピー以下であることから 5-FU系抗癌剤の感受性が高 、ことが予想された。これらの感 受性予測と in vivo抗腫瘍効果の結果 (実施例 1)は Lu-130については 4薬剤中 4薬剤 ともすベて一致し、 PAN-4については 4薬剤中 3薬剤で一致するものであった。
[0047] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
[0048] DPYD遺伝子のコピー数が 5-FU系抗癌剤に対する感受性に影響を及ぼすことを見 出した。これにより、被験者の 5-FU系抗癌剤に対する感受性を予測することが可能と なり、この予測結果は癌治療に利用できる。
配列表フリーテキスト
[0049] <配列番号 1 >
配列番号 1は、ヒト由来 DPYDの DNA配列を示す。
<配列番号 2>
配列番号 2は、ヒト由来 DPYDのアミノ酸配列を示す。
<配列番号 3 >
配列番号 3は、マウス由来 DPYDの DNA配列を示す。
<配列番号 4>
配列番号 4は、マウス由来 DPYDのアミノ酸配列を示す。
<配列番号 5 >
配列番号 5は、 DPYD遺伝子のコピー数を求めるために用いたフォワードプライマー の DNA配列を示す。
<配列番号 6 >
配列番号 6は、 DPYD遺伝子のコピー数を求めるために用いたリバースプライマー の DNA配列を示す。
<配列番号 7> 配列番号 7は、参照ゲノム配列 LINE-1のコピー数を求めるために用いたフォワード プライマーの DNA配列を示す。
<配列番号 8 >
配列番号 8は、参照ゲノム配列 LINE-1のコピー数を求めるために用いたリバースプ ライマーの DNA配列を示す。
<配列番号 9 >
配列番号 9は、 DPYDmRNAを定量するために用いたフォワードプライマーの DNA 配列を示す。
く配列番号 10 >
配列番号 10は、 DPYDmRNAを定量するために用いたリバースプライマーの DNA配 列を示す。
<配列番号 11 >
配列番号 11は、 DPYDmRNAを定量するために用いた TaqMan probeの DNA配列を 示す。
く配列番号 12 >
配列番号 12は、内部標準として ACTBを定量するために用いたフォワードプライマ 一の DNA配列を示す。
く配列番号 13 >
配列番号 13は、内部標準として ACTBを定量するために用いたリバースプライマー の DNA配列を示す。
く配列番号 14 >
配列番号 14は、内部標準として ACTBを定量するために用いた TaqMan probeの D NA配列を示す。
く配列番号 15 >
配列番号 15は、内部標準として GAPDを定量するために用いたフォワードプライマ 一の DNA配列を示す。
<配列番号 16 >
配列番号 16は、内部標準として GAPDを定量するために用いたリバースプライマー の DNA配列を示す。
く配列番号 17〉
配列番号 17は、内部標準として GAPDを定量するために用いた TaqMan probeの D NA配列を示す。

Claims

請求の範囲
[1] ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を指標として、 5 フルォロゥラ シル系抗癌剤に対する癌細胞の感受性を予測する方法。
[2] 被験者由来の癌細胞におけるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を 測定し、コピー数が 2以下である場合には被験者の 5 フルォロウラシル系抗癌剤に 対する感受性が高いと予測し、コピー数が 2よりも大きい場合には被験者の 5 フル ォロウラシル系抗癌剤に対する感受性が低いと予測する請求項 1記載の方法。
[3] ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を PCR法、 FISH法、アレイ CG H法、 DNAマイクロアレイ法及びサザンノヽイブリダィゼーシヨン法力 成る群より選択 される少なくとも 1つの方法で測定する請求項 1又は 2に記載の方法。
[4] 5—フルォロウラシル系抗癌剤が、 5—フルォロウラシル、テガフール、 5，—デォキシ
5 フルォロウラシル及び力ぺシタビン力 成る群より選択される少なくとも 1つの成 分を含む請求項 1〜3のいずれかに記載の方法。
[5] ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を測定するための試薬を含む、 5—フルォロウラシル系抗癌剤に対する感受性を予測するためのキット。
[6] ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコピー数を測定するための試薬力 ジヒド 口ピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子の全部又は一部を特異的に増幅することができ るオリゴヌクレオチドプライマー又はジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子と特異 的にハイブリダィズすることができるオリゴ若しくはポリヌクレオチドプローブである請 求項 5記載のキット。
[7] 配列番号 5の DNA配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号 6の DNA配列から なるオリゴヌクレオチドの組み合せ力もなる一セットのプライマー。
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